4 geneticamolecolare 1

Facoltà di Ingegneria dell’InformazioneLaurea Specialistica e Magistrale in

Ingegneria InformaticaFacoltà di Ingegneria dei Sistemi

Laurea Magistrale in Ingegneria Biomedica

Bioinformatica e Biologia Computazionale per la Medicina Molecolare

Marco Masseroli, PhD [email protected]

Dipartimento di Elettronica e Informazione

2© Marco Masseroli, PhD

Bioinformatica e Biologia Computazionale per la Medicina Molecolare

Elementi di Genetica e

Biologia Molecolare

Marco Masseroli, [email protected]


Elementi di Genetica e Biologia Molecolare

Genetica molecolare


Elementi di Genetica e Biologia Molecolare Indice

• Genetica molecolareDNA e sua strutturaRNA e sua struttura Genoma

- dei virus- batterico (dei procarioti)- degli eucarioti

Duplicazione informazione geneticaStruttura dei geniEspressione informazione geneticaTrascrizioneDiversi tipi di RNACodice geneticoTraduzioneControllo espressione genetica


Elementi di Genetica e Biologia Molecolare Genetica molecolare – DNA e sua struttura

• DNA è macromolecola più grande nella cellula: è polimero di 4 diversi tipi di monomeri, i nucleotidi, formati da:

1 molecola di zucchero con 5 atomi di carbonio (il deossiribosio, da cui nome DeoxyriboNucleic Acid - DNA) a cui sono legati:

- 1 gruppo fosfato (da molecola di acido fosforico - P)

- 1 molecola contenete azoto (N) (1 delle 4 basi azotate A, C, G, T)

nucleotide B

P

zucchero

gruppo fosfato

base azotata

ZBP Z

5’1’

2’3’

4’O



• Catena del DNA: lunga sequenza di nucleotidi uniti da legame tra l’acido fosforico di un nucleotide e lo zucchero del nucleotide successivo (“ponte” zucchero-acido fosforico-zucchero)

• Tale legame è detto 3’-5’ fosfodiesterico, dove 3’ e 5’ indicano il numero d’ordine degli atomi di carbonio dello zucchero impegnati nel legame

AATCAGCTACCAAGGCA

schema catena del DNA

B

P

zucchero

gruppo fosfato

base azotata

Z

5’1’

2’3’

4’O

ZBP

ZBP

3’

5’



http://tonga.usip.edu/gmoyna/biochem341/lecture36.html




Guanine

Cytosine



• Nel 1953, a Cambridge UK, statunitense James Watson e inglese Francis Crick definirono esatta struttura spazialedel DNA, basandosi su due tipi di risultati sperimentali:

1. La composizione in basi del DNA

2. Spettri di diffrazione dai raggi X di cristalli di fibre puredi DNA



1. Nel 1945-1950 statunitense E. Chargaff trovò che in ogni organismo (regole di Chargaff):

quantità di Adenina (A) = quantità di Timina (T)

quantità di Citosina (C) = quantità di Guanina (G)

ovvero:

A / T = C / G = 1

anche se (A + T) / (C + G) [detto percentuale di CG] varia da organismo a organismo



2. In stessi anni, inglese Rosalind Franklin, in collaborazione con M. Wilkins, ottenne prime foto spettri di diffrazione dai raggi X di cristalli di fibre pure di DNA, che mostravano:

DNA con struttura ad elica

con 2 periodicità caratteristiche, a 0.34 µm e a 0.034 µm lungo asse molecolare principale



• Watson e Crick combinarono le informazioni di Chargaff e della Franklin costruendo modelli tridimensionali di DNA

• Modello maggiormente in accordo con dati sperimentali era la doppia elica

• A temperatura, acidità (pH) e umidità caratteristiche delle cellule viventi DNA si dispone spontaneamente secondo struttura con seguenti caratteristiche:1. Doppia elica di due catene polinucleotidiche avvolte a

spirale destrorsa una sull’altra rispetto all’asse molecolare principale

2. Basi nucleotidiche disposte all’interno della doppia elica, perpendicolarmente all’asse molecolare principale, e scheletro zucchero-fosfato all’esterno



3. Basi nucleotidiche interagiscono tra loro con deboli legami idrogeno (H): • A e T unite da 2 legami H• C e G unite da 3 legami H(A-T e C-G sono dette coppie di basi complementari)

4. Legami H anche tra diverse volute dell’elica consolidano struttura



5. Vi sono 10 coppie di basi (10 bp, base pair) ogni girod’elica; dato che le coppie sono distanziate di 0.034 µm, passo dell’elica è di 0.34 µm (come da spettri raggi X); doppia elica ha diametro di 0.2 µm

6. Le due catene nucleotidiche sono antiparallele, ovvero con direzione opposta (una da 3’ a 5’, l’altra da 5’ a 3’)

7. Doppia elica ha 2 solchi sulla superficie, uno maggiore e uno minore;In questi solchi avvengono interazioni con proteinecoinvolte in replicazione DNA e trascrizione genica

• Video struttura DNA: http://www.youtube.com/watch?v=ZGHkHMoyC5I



• Doppia elica di Watson e Crick è detta forma B del DNA e si trova normalmente in cellule viventi (con molta acqua)

• Quando umidità è bassa, DNA assume struttura più larga e compatta (forma A)

• Vi sono anche altre forme di struttura di DNA, es. forma Z, con andamento a zig-zag dell’ossatura zucchero-fosfato e più sottile e con avvolgimento sinistrorso



• Molecole di DNA sono molto lunghe: in ogni cellula umana vi è più di 1 m di DNA

• Essendo molto sottili e flessibili si avvolgono su se stesseoccupando volume molto piccolo

• Fenomeno di ripiegamento DNA su se stesso è detto impacchettamento (packaging) o compattazione del DNA (video:http://www.youtube.com/watch?v=OStI5pniHPA)


Elementi di Genetica e Biologia Molecolare Genetica molecolare – RNA e sua struttura

• Nelle cellule l’RNA svolge ruolo fondamentale nella sintesi delle proteine

• Strutturalmente l’RNA rispetto a DNA:Formato da zucchero ribosio (anziché deossiribosio)Ha base azotata U (anziché T), che si appaia sempre con A (come T)Esiste sempre come catena singola, in cui le basi interagiscono tra loro formando strutture tridimensionali complicate, spesso non ancora ben note

• In alcuni esseri viventi privi di DNA (es. virus “a RNA”), l’RNAsvolge ruolo fondamentale nella riproduzione dell’individuo (es. virus del mosaico del tabacco - tmv)



Esempi di Strutture di RNA



• Nelle cellule vi sono diversi tipi di RNA, con ruoli diversi: messanger RNA (mRNA)ribosomial RNA (rRNA)trasfer RNA (tRNA), circa 75-95 nucleotidismall nuclear RNA (snRNA)small interfering RNAs (siRNA), di 20-25 nucleotidimicro RNA (miRNA), di 21-23 nucleotidilong noncoding RNAs (long ncRNAs), >200 nucleotidiantisense RNAs…

• mRNA, rRNA e tRNA svolgono ruoli fondamentali diversi nella sintesi proteica; gli altri RNA nella sua regolazione


Elementi di Genetica e Biologia Molecolare Genetica molecolare – Genoma

• Genoma: materiale genetico di un organismo

• Indica generalmente il DNA contenuto in ogni cellula(caratteristico della specie e organizzato in n cromosomi)

• Spesso per estensione il termine si riferisce anche all’RNA e alle proteine (che derivano dal DNA)

• Dimensione e organizzazione genoma variano nelle specie

• Cellule batteriche (procarioti) hanno genoma aploide (n)

• Maggior parte cellule eucariote hanno genoma diploide (2n), con numero diverso di cromosomi nelle varie speci

• Vediamo organizzazione genoma in virus, batteri e cellule superiori


Elementi di Genetica e Biologia Molecolare Genetica molecolare – Virus e loro genoma

• Virus sono le più semplici forme di vita conosciute

• Non sono cellule autonome, ma parassiti cellulari obbligati: possono riprodursi solo all’interno di altra cellula (sfruttandone sistemi enzimatici)

• Genoma virale:

Composto da 1 molecola di acido nucleico (DNA o RNA)

Racchiuso in involucro proteico (capside) di varie forme(icosaedrica, elicoidale o filamentosa, testa-coda)



• Esistono molti virus, divisi in 3 classi:Virus dei batteri, o batteriofagi o fagiVirus delle pianteVirus degli animali

• Batteriofagi: capside con testa icosaedrica, contenente materiale genetico (DNA o RNA), con attaccato cilindro cavo(coda) alla cui base vi sono strutture filamentose (spikes) che permettono attacco di virus a parete cellula batterica

Una volta legato, il virus “inietta” proprio materiale genico, dalla testa attraverso la coda, dentro la cellula, dove si riproduce (video: http://www.youtube.com/watch?v=gU8XeqI7yts)



Struttura di un batteriofago efasi della sua riproduzione



Fagi che attaccano batterio Escherichia coli visti al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) in falsi colori Alcuni stanno iniettando il loro materiale genetico (verde) nella cellula



• Virus cellule eucariote:

molto più numerosi, sia per animali che per piante (per piante meno importanti di macro-parassiti)

Capsidi principalmente icosaedrici o filamentosi (a volte rivestiti da membrana lipidica derivata da cellula infettata a seguito di fuoriuscita delle particelle virali)

Materiale genico (DNA o RNA) con grande varietà di struttura (singola o doppia elica, lineare o circolare, segmentato o intero)

Maggior parte virus piante è a RNA



Esocitosi di un nuovo virus da una cellula infetta. Virus HIV (Human Immunodeficiency Virus) (rossi) fuoriescono da un linfocita infetto: fotografia al microscopio elettronico a trasmissione, in falsi colori



• Molti virus possono integrare proprio genoma in quello di cellula ospite, determinando a volte drastici cambiamenti (morfologia e fisiologia) sulla vita della cellula infettata

• Trasformazione cellulare: insieme dei fenomeni derivanti dall’integrazione di virus nel DNA della cellula ospite

Microfotografia ottica di tumoremidollo osseo (mieloma) Cellule tumorali (in viola) hanno rimpiazzato maggior parte deltessuto sano; ciò che resta(cellule rosate) sta morendo



• Retrovirus (es. HIV [Human Immunodeficiency Virus])Contengono 1 o 2 molecole di RNAGrazie a enzima trascrittasi inversa, RNA convertito in DNA a filamento singolo (forma intermedia) trasformato in doppia elica da enzima DNA polimerasi (attivo in nucleo cellulare); così trasformato genoma virus si può integrare in genoma dellacellula ospite e riprodurre


Elementi di Genetica e Biologia Molecolare Genetica molecolare – Genoma batterico

• Cellule batteriche (procarioti) non hanno vero e proprio nucleo, ma struttura compatta (nucleoide) formato da 1molecola di DNA (di solito circolare) lungo circa 1 mm(cellula batterica lunga circa 1 µm!!)

• Struttura esatta nucleoide batterico non nota, ma deve avere impacchettamento con numerosi ripiegamenti su se stesso (supercoiling)

• Lungo DNA batterico vi sono 2’000-2’500 geni in sequenza continua (senza interruzioni al loro interno)



• In molti batteri, oltre a genoma vero e proprio, vi sono anche piccole molecole circolari di DNA: i plasmidi:

Conferiscono caratteristiche vantaggiose alla cellulaPossono integrarsi in genoma cellulare e distaccarseneportando con se un assortimento variabile di geni

• Vari tipi di plasmidi, tra cui:

Plasmide R (R = resistenza): determinano resistenza di cellule ai cationi di metalli pesanti o a molti antibiotici -> difficoltà trattamento infezioni batteriche- Se vi è plasmide R, in ambienti ricchi di antibiotico, si

attivano geni resistenza (che vengono disattivati in ambiente povero di antibiotici per risparmiare energia)



Plasmidi degradativi: permettono al batterio di metabolizzare composti chimici stabili (residui petrolio, pesticidi, …) -> impiego in recupero zone inquinate

Fattore di fertilità (o fattore F): cellule che lo contengono sono dette maschi (F+), le altre femmine (F-)- Tramite pilus sessuale (struttura cilindrica in parete

cellulare), cellule F+ possono trasferire a cellule F-

copia fattore F (coniugazione), trasformando F- in F+

- Coniugazione permette “trasferimento orizzontale” di materiale genico


Elementi di Genetica e Biologia Molecolare Genetica molecolare – Genoma degli eucarioti

• Nucleo cellule eucariote molto più complesso di procariote

• Contiene varie molecole lineari di DNA, ognuna contenuta in un cromosoma

• Numero cromosomi non proporzionale a grandezza genoma: es. lievito di birra (il fungo saccharomyces cerevisiae) ha genoma di circa 20.000 Kb (kilobasi) suddiviso in 16 cromosomi, DNA umano ha 3.000.000 Kb ed è suddiviso in 23 cromosomi

• Cromosomi costituiti da cromatina, formata 50% da DNA, 50% da proteine e piccola parte di RNA

• Proteine più strettamente associate a DNA sono gli istoni(H1, H2A, H2B, H3, H4)



• Cromatina ha struttura simile a collana: filamento centrale con particelle sferiche (nucleosomi) di diametro circa 10 µm

• Ogni nucleosoma dista dal successivo per un tratto di DNA di circa 50-70 bp (linker)

• Avvolgimento DNA su nucleosoma spiega (in parte) comeDNA sia impacchettato nei cromosomi



• Durante particolare fase della divisione cellulare (metafase) i cromosomi assumono forma a X, con 2 elementi lineari (cromatidi) uniti in punto detto centromero, che divide ogni cromatide in 2 bracci p (braccio corto) e q (braccio lungo)

• Posizione relativa centromero, lunghezza di cromatidi e dimensioni cromosoma identificano clinicamente i diversi cromosomi (che costituiscono cariotipo dell’organismo)

• Ad estremità di cromatidi vi sono i telomeri (dal greco, “punta fine”)



Cariotipo umano maschile

Cariotipo umano femminile



• Con colorazioni artificiali, zone del cromosoma ricche di basi A e T si tingono di scuro, zone con abbondanza di G e Crestano chiare, generando assetto "a striscie“ (bande)

• Ogni banda ha nomenclatura (es. 6p21.3) che indica sua posizione, come su una mappa, specificando:

cromosomabraccioregionebanda sottobanda



• Es. 6p21.3 indica:6: numero del cromosoma (cromosoma 6)p: braccio più corto del cromosoma2: gruppo di bande (regione) visibile sul braccio a partire

dal centromero1: banda all'interno del gruppo, contando dal centromero

verso il telomero3: sottobanda, una banda sottile visibile all'interno di

banda più spessa, contata a partire dal centromero• Ovvero, posizione 6p21.3 indica la terza sottobanda della

prima banda osservabile sul secondo gruppo di bande localizzato sul braccio corto del cromosoma 6

http://homepages.uel.ac.uk/V.K.Sieber/human.htm



• Non tutto materiale genetico cellula eucariota è in nucleo

• Piccola frazione di DNA circolare si trova in organellicellulari: i cloroplasti (in cellule vegetali, deputati a fotosintesi) e i mitocondri (producono energia chimica per la cellula)

• Geni extranucleari di cloroplasti e mitocondri, essendo nel citoplasma sono trasmessi alla prole solo dalla cellula uovo (che ha molto più citoplasma dello spermatozoo) -> ereditàmaterna, non mendeliana


Elementi di Genetica e Biologia Molecolare Genetica molecolare – Duplicazione genica

• Per garantire la trasmissione dell’informazione genetica da una generazione all’altra, prima di duplicazione cellulare il DNA viene copiato (duplicazione o replicazione del DNA)

• Processo identico in procarioti ed eucarioti

• Molecola DNA si replica secondo modello semiconservativo:Ogni molecola figliaha 1 filamento DNAmolecola madre e 1 filamento di nuova sintesi



• Modello di duplicazione semiconservativa prevede:Apertura “a cerniera” della doppia elica Esposizione singole basi sui due filamenti che agiscono come stampoAppaiamento di basi di nucleotidi liberi nella cellula con quelle complementari di filamenti stampo (legami H)Nucleotidi di basi appaiate si legano uno all’altro a formare nuovo filamento

• Alla fine, 2 doppie eliche, ognuna con:1 elica parentale1 elica di nuova sintesi



• Zona apertura doppia elica e sintesi nuovo filamento è detta forca replicativa (per sua forma)



• Duplicazione non contemporanea su tutta lunga molecolaDNA, ma solo in una zona alla volta, a partire da posizione prestabilita (origine della duplicazione), secondo specifica successione:1. Apertura localizzata doppia

elica ad opera di enzimi specifici

2. Copiatura tramite appaiamentofra basi e polimerizzazionenucleotidi grazie a enzimaDNA polimerasi (III e I) indirezione da 5’ a 3’ su entrambii filamenti di DNA



Su filamento orientato da 5’ a 3’ (leading strand) copiatura in modo continuo Su filamento orientato da 3’ a 5’ (lagging strand) copiatura da 5’ a 3’ deve avvenire a tratti (okasakifragments) che sono poi uniti uno all’altro da enzima DNA ligase

3. Richiusura doppia elicaper opera di numerosi altri enzimi specifici

Video DNA replication:http://www.youtube.com/watch?v=teV62zrm2P0


Elementi di Genetica e Biologia Molecolare Genetica molecolare – Struttura geni

• Sequenza di 3 basi (tripletta) = codone

• In procarioti:

• In eucarioti:

geneupstream downstream

start codon stop codonpromoter

(regulatorynucleotide sequence)

5’ 3’

open reading frame (ORF)

intronsstop codon

exons(codifying

nucleotide sequences)

upstream downstream

start codonPromoter & transcription

factor binding sites(regulatory nucleotide sequences)

3’5’


Elementi di Genetica e Biologia Molecolare Genetica molecolare – Struttura geni

• Genoma umano contiene circa 3 miliardi di basi (3.000 Mb), ma solo 25.000-30.000 geni

• Regione codificante ha circa 90 Mb (solo 3% del genoma)

• Più del 50% del genoma sono sequenze ripetute:Tandem repeats (10-15% DNA, da 1 a migliaia di bp): le ripetizioni sono adiacenti (es. ATTCGATTCGATTCG)Interspersed repeats (35-40% DNA, da 100 a 10’000 bp): le ripetizioni sono sparse lungo tutto il DNA

• Molte sequenze ripetute sono diverse nei diversi individui


Elementi di Genetica e Biologia Molecolare Genetica molecolare – Espressione genica

• Termine espressione genica [Crick 1958] indica processo biologico con cui informazione genetica in un gene è trasferita da DNA a RNA a proteina (principio centrale della Biologia Molecolare)

• Informazione è trasferita solo unidirezionalmente: Da DNA a RNA: trascrizioneDa RNA trascritto a proteina: traduzione

• Sempre vero anche se retrovirus possono trasferire informazione da RNA a DNA


Elementi di Genetica e Biologia Molecolare Genetica molecolare – Trascrizione

• In trascrizione, informazione in DNA guida sintesi molecola RNA da 5’ a 3’

• Solo 1 elica DNA usata per sintesi di un RNA (elica stampo)• Molecola RNA sintetizzata ha stessa sequenza di tratto di

altro filamento DNA (elica codificante), con però nucleotidi con base U (uracile) al posto di nucleotidi con base T (timina)

• Elica stampo e codificante non sono le stesse per tutti RNA• Sintesi è catalizzata da enzima RNA polimerasi



• RNA polimerasi è diversa in procarioti ed eucarioti

• In procarioti RNA polimerasi:Formata da 5 subunità (2 α = α2; 1 β; 1 β’; e 1 σ)Trascrive tutte classi di RNA della cellula (mRNA, rRNA, tRNA, …)

• In procarioti, in trascrizione vi sono 3 fasi distinte:1. Inizio trascrizione:

- enzima RNA polimerasi si lega (con sua subunità σ) a promotore del gene

- si distacca subunità σ e inizia trascrizione



2. Polimerizzazione polinucleotide RNA (allungamento):- enzima continua sintesi RNA fino a raggiungere zona

di stop del gene (terminatore)3. Distacco dell’RNA prodotto e termine trascrizione:

- enzima si dissocia da DNA e da RNA che resta libero

(video: http://www.youtube.com

/watch?v=toCc6ZU8D9A)



• In eucarioti trascrizione è processo più complesso:3 diversi tipi di RNA polimerase (RNA polimerase I, RNA polimerase II, RNA polimerase III)Ogni tipo riconosce e trascrive un set di geni diverso(geni per mRNA, geni per rRNA, geni per tRNA, …)



Servono anche molte altre proteine (fattori trascrizionali), specifiche per ogni polimerase, che posizionandosi in zone opportune del DNA (siti di legame di fattori di trascrizione), quando queste sono tridimensionalmente accessibili, favoriscono attacco RNA polimerasi specifica e trascrizione gene

(video: http://www.youtube.com/watch?v=WsofH466lqk)



• RNA polimerase sintetizza RNA in modo continuo (non può saltare una parte di catena di DNA stampo)

• In eucarioti geni (formati da introni ed esoni) sono trascritti per intero, producendo un trascritto primario (RNA precursore o pre-RNA)

• Complessi processi molecolari(splicing), tipici degli eucarioti, eliminano da trascritto primario sequenze RNA di introni, producendo RNA maturo, che attraverso membrana del nucleo migra al citoplasma dove è tradotto (video:http://www.youtube.com/watch?v=FVuAwBGw_pQ)



• Si possono avere splicing diversi (Splicing alternativo)

1 gene => more than 1 transcript

Gene (DNA)

Transcript (mRNA)

Alternative splicings

exons (codifying nucleotide sequences)

intronstranscription

splicing 1

splicing 2

splicing 3



• In gene con alternative splicing, maggior parte degli esoniè sempre inclusa nell’mRNA finale

• Si possono avere 4 tipi diversi di eventi di splicingalternativo, che generano diversi trascritti finali:

esoni cassetta: intero esone viene trascritto solo in alcuni casi

Isoforme di introni/esoni: i confini di introni e/o esoni possono essere diversi, con troncamento/estensione

ritenzione di introni: introni possono essere contenuti nel trascritto finale

esoni mutuamente esclusivi: esoni diversi possono essere inclusi in trascritti finali diversi



Cassette exon

Intron/exonisoform

Intronretention

Mutually exclusive exons

normal

normal

normal

normal

alternative

alternative 1

alternative 2

alternative

alternative

Eventi di splicing alternativo



Splicing è processo non ancora ben notoIn alcuni casi, complessi molecolari formati da piccole molecole di RNA e proteine (SNRNP – Small NuclearRiboNucleoProtein) tagliano:- prima ad estremità 5’ di introne in corrispondenza di

dinucleotide GU- poi ad estremità 3’ ove vi è dinucleotide AG

Poi si ha riunione esoni confinanti con introne eliminatoVi sono introni anche in geni non per mRNA (es. per rRNA) che seguono regola GU-AG senza usare SNRNP; eliminano da soli introni (autosplicing); tali RNA sono detti riboenzimi



Dopo lo splicing, processo di trasformazione di mRNA primario in mRNA maturo viene completato stabilizzandomRNA (formato da sole parti corrispondenti agli esoni) aggiungendovi:- all’estremità iniziale un “cappello” di 7 Metil Guanina- all’estremità finale una “coda” di Adenine (poli A tail)

In questa fase possono avvenire complessi fenomeniche portano a degradazione di mRNA impedendone successiva traduzione e quindi “silenziando” l’espressione del gene

mRNA maturo esce dal nucleo, attraverso la membrana nucleare, e si trasferisce nel citoplasma, dove avviene la sua traduzione


Elementi di Genetica e Biologia Molecolare Genetica molecolare – Diversi tipi di RNA

• RNA ribosomiale (rRNA): Componenti strutturali e funzionali dei ribosomi, organellicellulari molto grandi e di forma ovoidale (in eucarioti e procarioti) in cui avviene sintesi proteica

• RNA di trasferimento (tRNA): Piccole molecole di acido nucleico (75-95 nucleotidi)Funzione di trasporto degli aminoacidi (che verranno usati nella sintesi proteica) verso le molecole di mRNAlegate ai ribosomi



tRNA ha struttura “a trifoglio”, con tratti appaiati in doppia elica alternati a tratti senza appaiamento di basi (anse)- Braccio accettore, (con estremità 3’) ove si attacca

particolare aminoacido- Zona dell’anticodone, formata da sequenza di 3 basi

complementare a codone mRNA da tradurre, che durante traduzione si appaia a tale codone



• RNA messaggero (mRNA): mRNA prodotti durante trascrizione, stabiliscono la sequenza di aminoacidi di proteina che codificanoMolecole intermedie tra geni e proteineIn procarioti, mRNA tradotti subito dopo essere trascrittiIn eucarioti, subiscono varie modificazioni, tra cui lo splicing (in inglese, tagliare e cucire) prima di essere tradotti

• rRNA, tRNA e mRNA prodotti in trascrizione partecipano tutti a traduzione


Elementi di Genetica e Biologia Molecolare Genetica molecolare – Codice genetico

• Codice genetico: insieme di regole che definiscono come informazione in sequenza di nucleotidi di mRNA (scritta con le 4 basi azotate A, G, C, U) è tradotta in sequenza aminoacidica di proteina codificata (scritta con 20 aminoacidi)

• E’ “universale”: vale per quasi tutte le cellule (tranne per geni di mitocondri di alcuni organismi)

• Scoperto nel 1964 con test che dimostra che ribosoma si attacca a mRNA solo se molecola mRNA ha almeno 3 basi

4 basi nucleotidiche -> 43 = 64 possibili triplette (codoni)

• In 1966 si da ad ogni codone una funzione di codifica:Inserimento specifico aminoacidoInizio o fine messaggio



trp

*

*+

+

•

•



• Caratteristiche codice genetico:Ciascun aminoacido è codificato da tripletta di basi Triplette sono “lette” (cfr. open reading frame - ORF) una di seguito all’altra, senza interruzioniOgni tripletta può codificare solo uno dei 20 aminoacidi- Quasi tutti aminoacidi codificati da più di 1 tripletta

• Alcune triplette “strumentali”: AUG codifica Met (unico codone) e indica quasi sempreinizio messaggio (tripletta di “start”) UAA, UAG, UGA (triplette di “stop”) non codificano alcun aminoacido, ma fine di messaggio (gene)



• Codice genetico basato su triplette

• Splicing e soprattutto splicing alternativo può far variare la lettura di triplette all’interno di trama aperta di lettura (ORF)

In stesso spazio si hanno diverse codifichecontemporanee (compressione della codifica)

• Alcuni trascritti alternativi sono tessuto-specifici, ovvero sono espressi solo in un tipo specifico di cellula (es. muscolare, o nervosa, o …)

• Meccanismi di codice genetico e splicing alternativopermettono codificare e produrre molte proteine (funzioni) diverse a partire dallo stesso DNA!

Principale causa errore stima 100 K geni anziché 25-30 K


Elementi di Genetica e Biologia Molecolare Genetica molecolare – Traduzione

• Traduzione è processo complesso che coinvolge molticomponenti cellulari, tra cui ribosomi (rRNA), mRNA, tRNA

• I tRNA (adattatori) sono congiunzione tra nucleotidi di mRNAe aminoacidi di proteina:

Tratto anticodone si legaa codone (es. UUU) sumRNA che codifica perspecifico aminoacido (Phe)

In estremità 3’ di tRNA silega covalentemente especificamente solo quell’aminoacido (Phe)



• Traduzione uguale in procarioti ed eucarioti; ha 3 fasi (vedi video: http://www.youtube.com/watch?v=5bLEDd-PSTQ):

1. Inizio:

- Ribosoma si attacca a mRNA in corrispondenza di tripletta di inizio (AUG)

- Riconoscimento di tripletta AUG di mRNA da parte di tripletta complementare del tRNA specifico(anticodone)

- Attacco di tRNA che porta aminoacidocorrispondente a tripletta AUG (Met)



2. Sintesi:

- Processo continua

- Ribosoma si sposta lungo mRNA

- 1 sola tripletta per volta disponibile per attacco con tRNA specifico

- Aminoacidi portati da tRNA si trovano vicini

- Quando ribosoma si sposta, si ha formazione legame peptidico tra ultimo aminoacido trasportato da tRNA e aminoacido precedentemente trasportato (ultimo di catena peptidica che si sta formando)

- Spostandosi ribosoma, catena proteica si allunga



3. Termine:

- Quando ribosoma arriva in corrispondenza di tripletta di stop (UAA, UAG, UGA): ° si distacca da mRNA° libera catena proteica



• Ogni ribosoma costruisce 1 sola proteina per volta

• In batteri (procarioti), che necessitano sintesi di molte copie stessa proteina in breve tempo (alcuni minuti):

Più ribosomi (poliribosomi) traducono in successionecontemporaneamente stesso mRNA (spostandosi uno di seguito all’altro in stessa direzione di sintesi)

Ribosomi possono iniziare a tradurre mRNA primaancora che sia completata sua sintesi (dato che non vi sono fenomeni di splicing e non vi è vero e proprio nucleo) - in batteri trascrizione e traduzione sono accoppiate



Poliribosomi e accoppiamento di trascrizione e traduzione


Elementi di Genetica e Biologia Molecolare Genetica molecolare – Riassunto dogma centrale

Chromosomes (kariotype)

Nucleotides (A,T,C,G)

Organism

Cells

Genes

GENOME PROTEOME

mRNAs

Amino acids(ALA, ARG, ASN, ASP, CYS, GLN, GLU, GLY, HIS, ILE, LEU, LYS,

MET, PHE, PRO, SER, THR, TRP,

TYR, VAL)

Proteins

DNA (genetic code)tRNAs

Ribosomes (rRNA)

TRANSCRIPTOME(transcription) (translation)



Gene (DNA)

Transcripts (mRNA)

Proteins

Functional effect

transcription

translation

promoter & transcription factor binding sites

(regulation nucleotide sequence)

open reading frame (ORF)5’ 3’

DNA


Sintesi proteica

Video riassuntivo: http://www.youtube.com/watch?v=4PKjF7OumYo



Elementi di Genetica e Biologia Molecolare Genetica molecolare – Controllo espressione geni

• Geni di cellula codificano un “pool” di informazione biologica

• Non tutti geni sempre necessari alla vita di cellula

• Solo geni costitutivi (codificanti enzimi metabolismo basale necessari per la vita della cellula) sono sempre espressi

• Altri geni espressi quando serve

• Espressione geni è regolata da necessità cellula: condizioni ambiente e funzioni da svolgere, es.:

Batterio Escherichia coli (E. coli), che si trova in intestino umano e ricava energia da vari zuccheri), se disponibile glucosio (facilmente utilizzabile) regola suoi geni per produrre solo enzimi per il glucosio, “spegnendo” geni codificanti enzimi per altri tipi di zuccheri



In cellule vegetali, attivazione geni della fotosintesi in risposta alla luce solare



• In organismi pluricellulari:L’ambiente di una cellula è l’organismo stesso: singole cellule rispondono a stimoli (sostanze, es. ormoni) prodotte da altre cellule dell’organismo Vi è anche meccanismo “regolazione differenziale” che porta, a partire da una stessa cellula, ad avere diverse cellule specializzate (tutte con stesso DNA)- In uomo, ∼250 tipi di cellule con diversa morfologia e

funzione (es. linfociti, miociti, …)- Diversità stabilita geneticamente molto presto in

sviluppo zigote (non “reversibile”); solo cellule staminali possono differenziarsi in cellule specializzate



Regolazione genica nei batteri

• Conoscenze derivano da studi di francesi François Jacob e Jaques Monod (1960-64) su uso lattosio in Escherichia coli

• Premio Nobel in 1965 per modello regolazione proposto



• Lattosio è disaccaride (zucchero di 2 monomeri, glucosio e galattosio) che per essere utilizzato deve entrare in cellula ed essere scisso nelle 2 molecole componenti

• Scissione lattosio realizzata da 3 enzimi codificati da 3 geni: lacZ -> β-galatosidasilacY -> lattosio-permeasilacA -> lattosio-transacetilasi

• In assenza lattosio, in cellula ∼5 molecole ciascun enzima

• Se lattosio unica fonte energia, sintesi enzimi rapidamente stimolata (enzimi inducibili): in pochi minuti ∼5.000 molecole



• Geni lacZ, lacY e lacA che determinano struttura dei 3 enzimi (geni strutturali) sono consecutivi su cromosoma batterico e trascritti in stesso mRNA

• A monte dei 3 geni vi è gene lacL che regola (down) i 3 geni: sua eliminazione porta a sintesi continua dei 3 enzimi

lacL codifica proteina (repressore) che si lega a zona sul cromosoma, detta operatore (o), tra promotore (p) dei 3 geni e primo di tali geni (lacZ)

• L’insieme di o, p, lacZ, lacY e lacA è detto operone lac(operone = gruppo di geni sotto controllo comune)



Meccanismo regolazione operone lattosio

In assenza di lattosio, repressore legato a operatore impedisce a RNA polimerasi di trascrivere i 3 geni strutturali



• Se lattosio è presente, si lega a repressore, ne cambia la conformazione 3D impedendogli di restare legato a operatore

Repressore si stacca da DNA permettendo trascrizione genidi operone (lacZ, lacY e lacA) e sintesi dei 3 enzimi per scissione lattosio

• Quando lattosio è completamente consumato, repressore si riattacca a operatore e sintesi 3 enzimi si interrompe



• Video su funzionamento operone lac:http://www.youtube.com/watch?v=oBwtxdI1zvk&NR=1

http://www.youtube.com/watch?v=aEtuaEe0C-I



Regolazione genica in organismi superiori

• Meccanismi fondamentali uguali a quelli in batteri, ma più complessità di regolazione

• Espressione gene regolata da proteine (fattori di trascrizione) che legano siti DNA a monte di gene (Transcription Factor Binding Sites) e capaci di favorire o bloccare legame RNA polimerasi a promotore gene

• Esempio complessità regolazione è la regolazione di proteina(metallotioneina) che protegge cellule da effetti tossici metalli liberi in ambiente (es. cadmio)

Piccole quantità metallotioneina sempre presenti in cellulaIncremento sua sintesi indotto da presenza metalli pesanti



Regolazione di metallotioneina

• Gene di metallotioneina è trascritto da RNA polimerasi II

• Molti tratti DNA a monte gene coinvolti in sua espressione:Sito di attacco polimerasiSequenze (potenziatori, o enhancers) che agiscono favorendo trascrizione gene- Forse controllano espressione tessuto-specifica gene

• Oltre a zone con influenza “continuativa”, altre zone regolanoin risposta a stimoli specifici (da interno o esterno cellula)

• Per metallotioneina tali zone (elementi di risposta ai metalli) modulano trascrizione in base a concentrazione metalli



• Con concentrazione elevata di metalli tali siti DNA occupati da proteine regolatrici (fattori di trascrizione) che attivano RNA polimerasi II:

Gene è ”acceso” e molta metallotioneina è sintetizzata

• Quando metallotioneina ha ridotto concentrazione metalli:Proteine regolatrici si staccano da DNA, gene si “spegne”

• Fattori di trascrizione hanno ruolo chiave in regolazione:Hanno struttura (o parte di struttura) che permette loro di entrare in solchi DNA e interagire con basi nucletidiche(DNA binding proteins) - Loro strutture più comuni sono il motivo elica-giro-

elica e lo zinc-finger



zinc-finger elica-giro-elica

zinc-finger video: http://www.youtube.com/watch?v=GRL_rdB30GY

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