Parte Sperimentale

40

3. PARTE SPERIMENTALE

3.1. Valutazione dell’impatto sensoriale del TCA in differenti

tipologie di vini

Per questo lavoro, fu selezionato un panel per valutare sia la sensibilità olfattiva

sia quella gustativa al TCA in acqua e in vino. Fu determinata anche una curva

tempo-intensità per il TCA in acqua per vedere se forniva qualche indicazione

sulla percezione sensoriale del TCA. Il panel selezionato ha valutato l’effetto della

tipologia del vino sul riconoscimento del TCA mediante test triangolare, test

sensoriale usato per evidenziare delle differenze, sia su vini bianchi sia su vini

rossi D.O.C., tutti liberi da TCA o con quantità note di questo contaminante

appositamente addizionate.

Materiali e metodi

• Selezione del panel

Diciotto assaggiatori (5 maschi e 13 femmine), con età compresa tra 25 e 60 anni

(72% avevano tra 25-32 anni; età media: 34 anni), furono scelti tra il gruppo di

lavoro e gli studenti dell’Istituto di Enologia e Ingegneria agro-alimentare. Le

prove furono effettuate da gennaio a maggio 2004. La sensibilità dei degustatori

fu testata secondo le norme ISO 8586 (1993) e ISO 6658 (2005). Le prove di

analisi sensoriali furono effettuate secondo i criteri relativi all’equipaggiamento e

all’applicazione di adeguate condizioni ambientali, come riportato dalla norma

Parte Sperimentale

41

ISO 8589 (1994). Tutti i test triangolari eseguiti in questo studio furono effettuati

seguendo la norma ISO 4120 (2004); i criteri per la determinazione significativa

di TCA furono basati sulle tabelle relative alla distribuzione binomiale per test

triangolare. Per tutti i test triangolari eseguiti in questo studio, i risultati sono stati

considerati significativi per α≤ 0.05. In accordo con le norme citate in precedenza,

considerando il numero di prove, e α≤ 0.05, fu determinato un valore di ß< 0.01.

Così il potere statistico del test è p≥ 99%.

Inizialmente, fu eseguito un test di riconoscimento, nel quale venivano preparati

campioni a concentrazioni crescenti ed esaminati in serie. Questa prova è

raccomandata dalla norma ISO 6658 (2005) per una prima selezione dei

degustatori. Questo test fu effettuato in tre giorni differenti, e ogni giorno veniva

esaminata una serie diversa: le tre serie erano composte rispettivamente da acqua,

vino bianco e vino rosso con 0.5 - 1 - 5 - 10 - 15 ng/l di TCA aggiunto (Aldrich -

99%). A ciascun assaggiatore ogni giorno fu presentata una serie di cinque

campioni in ordine crescente. Per questa prova furono utilizzati vini neutri italiani

da tavola, bianco e rosso, confezionati in cartoni laminati. Furono forniti anche

campioni di controllo di acqua e di vino non contaminati. Per ciascuna serie, il

degustatore riceveva un nuovo campione dopo un intervallo 10 di minuti. Il

volume di ogni campione era di 20 ml, servito in un bicchiere di vetro trasparente

alla temperatura di 20 ± 1 ºC. Ai degustatori fu chiesto di identificare la più bassa

concentrazione di TCA percepito rispettivamente all’odore e al gusto (percezione

ortonasale e retronasale) fra i campioni di ciascuna serie. Sullo stesso campione

veniva valutato sia l’olfatto sia il gusto nella medesima sessione.

Parte Sperimentale

42

Tuttavia, la selezione del panel fu effettuata via test triangolare in acqua, nel quale

uno o due dei tre campioni di ciascuna terna contenevano in modo casuale 5 ng/l

of TCA. Ai degustatori fu chiesto di identificare il campione che era differente

dagli altri, sia all’odore sia al gusto. La percezione olfattiva e gustativa di ciascun

campione fu valutata ad intervalli di 10 minuti. Il volume di ciascun campione era

di 20 ml, servito in bicchieri di vetro trasparente alla temperatura di 20 ± 1ºC; ad

ogni assaggiatore furono presentate sei terne di campioni con intervalli di 10

minuti.

Inoltre per il panel selezionato fu determinata la soglia di determinazione del TCA

mediante test triangolare in soluzione acquosa addizionata rispettivamente con 3,

4 e 5 ng/l di TCA. Le prove furono eseguite seguendo la stessa procedura

utilizzata per la selezione del panel.

• Curva tempo-intensità

Ai sei degustatori, che avevano mostrato una maggiore sensibilità all’olfatto per il

TCA in acqua, fornendo sei risposte esatte su sei replicati, furono presentati 10 ml

di acqua contenente 10 ng/l di TCA in un bicchiere di plastica da 30 ml alla

temperatura di 20 ± 1 ºC. Ogni assaggiatore fece tre replicati e un nuovo

campione veniva presentato a intervalli di 10 minuti. Fu chiesto di mettere in

bocca il campione, tenerlo in bocca per 10 secondi e poi espettorare. I degustatori

segnavano l’intensità del gusto di muffa ad intervalli di 5 secondi dopo

l’espettorazione fino all’estinzione della sensazione, in accordo con Ishikawa et

al. (1995). Le risposte furono registrate con un registratore a carta e gli intervalli

Parte Sperimentale

43

di tempo furono indicati ai degustatori attraverso un cronometro dotato di un

segnale sonoro. I risultati ottenuti per ciascun assaggiatore furono elaborati per

ottenere un andamento medio, usando la media geometrica e i dati furono poi

riportati in un grafico tempo-intensità.

• Prove sui vini

L’impatto sensoriale del TCA fu verificato su vini D.O.C. bianchi e rossi

provenienti dalla vendemmia 2003, mentre i vini invecchiati in legno provenivano

dalla vendemmia 2000. Tra i vini bianchi: Frascati, Chardonnay dei Colli

piacentini e Trebbiano di Romagna (da uve neutre); Malvasia dei Colli piacentini,

sia di tipo dolce sia secco, prodotta dallo stesso mosto (da uve aromatiche);

Moscato di Pantelleria (da uve aromatiche seccate); Picolit dei Colli orientali del

Friuli (invecchiato in legno per 2 anni). Tra i vini rossi utilizzati: Bardolino,

Valpolicella, Rosso San Severo, Barbera dei Colli tortonesi e Cabernet Sauvignon

dei Colli piacentini. Invece tra i vini maturati in legno: Cabernet di Lison-

Pramaggiore (L-P) e Montepulciano d’Abruzzo. Le principali caratteristiche dei

vini sono riportate in Tabella 9.

Parte Sperimentale

44

Tabella 9 – Principali caratteristiche analitiche dei vini D.O.C. utilizzati per le prove; le analisi furono eseguite in accordo alle procedure EU Official Methods (1990).

(*) Dopo aver fatto reagire il vino diluito con il reattivo di Folin-Ciocalteu, è stata misurata la OD a 750 nm: IFC = OD x diluizioni x 20. E’ la stima globale del contenuto di tannini presenti nel vino.

I test triangolari furono effettuati sui vini tal quali sia su quelli addizionati con

quantità note di TCA. In ogni terna, uno o due dei tre campioni contenevano

TCA, e la posizione del o dei campioni addizionati era messa a caso in ciascuna

serie. Ai degustatori fu chiesto di identificare il campione che era diverso, sia

all’odore sia al gusto. La percezione gustativa e olfattiva dei campioni fu valutata

nella stessa sessione. Ciascun vino fu testato in un giorno differente, e ad ogni

assaggiatore furono presentate tre terne dello stesso vino con intervalli di 10

Contenuto alcoolico (vol. %)

Zucchero (g/l)

pH Acidità volatile (g acido acetico/l)

Acidità totale (g

acido tartarico/l)

Indice F.C. (*)

Vini bianchi Frascati 11.75 2.10 3.28 0.35 5.75 Chardonnay dei Colli piacentini 11.70 7.60 3.48 0.17 5.62 Trebbiano di Romagna 10.75 1.80 3.56 0.22 4.86 Vini bianchi da uve aromatiche Malvasia dei Colli piacentini (sweet) 8.55 67.60 3.49 0.22 6.08 Malvasia dei Colli piacentini (dry) 10.93 12.20 3.58 0.28 5.68 Moscato di Pantelleria 15.96 147.70 3.54 0.25 3.85 Vini rossi Rosso San Severo 11.53 2.70 3.88 0.44 5.66 46 Bardolino 12.70 2.50 3.50 0.21 5.60 28 Valpolicella 12.70 2.50 3.40 0.25 5.70 37 Barbera dei Colli tortonesi 13.35 13.30 3.20 0.27 7.37 34 Cabernet Sauvignon dei Colli piacentini 13.93 3.40 3.76 0.35 5.04 67 Vini rossi e bianchi invecchiati in legno Cabernet di Lison-Pramaggiore 12.78 6.60 3.64 0.61 5.05 49 Montepulciano d’Abruzzo 12.65 6.50 3.48 0.49 6.22 61 Picolit dei Colli orientali del Friuli 14.00 7.50 3.61 0.56 5.39

Parte Sperimentale

45

minuti. Il volume del campione era di 20 ml, servito in un bicchiere di vetro

trasparente alla temperatura di 20 ± 1 ºC.

Il test triangolare e la significatività dei risultati ottenuti sono stati eseguiti in

accordo alle norme ISO citate.

Risultati e discussione

• Selezione del panel

I test di riconoscimento, effettuate dai 18 assaggiatori, hanno dato informazioni

relative alla loro sensibilità all’olfatto e al gusto del TCA (percezione ortonasale e

retronasale) in acqua e in vino (Tabella 10).

Tabella 10 − Test di riconoscimento del TCA in acqua, vino bianco e rosso: per ciascun livello di riconoscimento (ng/l di TCA), è riportata la percentuale di degustatori che hanno identificato la presenza di TCA (panel composto da 18 assaggiatori; numero di replicati: 3).

Livello di riconoscimento 0.5 1 5 10 15 olfatto 6 22 44 28 Acqua gusto 16 28 50 6 olfatto # 0 17 55 28 vino bianco gusto # 0 55 39 6 olfatto # 0 55 45 vino rosso gusto # 0 78 22

(#) il livello di riconoscimento di 0.5 ng/l TCA non fu testato nei vini. Per quanto riguarda l’acqua, la soglia di riconoscimento del TCA fu identificata

tra 0.5 e 5 ng/l dal 94 % dei degustatori al gusto, e dal 72 % all’olfatto. Per i vini

rossi tutti gli assaggiatori hanno identificato il TCA tra 5 e 10 ng/l, e anche per i

vini bianchi i risultati della prova hanno dato un andamento analogo, pur con una

Parte Sperimentale

46

maggiore dispersione. Come ci aspettavamo, il TCA, sia al gusto che all’odore, è

stato riconosciuto meglio in acqua che in vino, probabilmente per l’assenza di

interazione tra l’etanolo ed i composti aromitici presenti nel vino. In accordo con

Suprenant et al. (1996), i degustatori mostrano una sensibilità verso il TCA

variabile; tuttavia il nostro panel si è dimostrato sempre più sensibile al gusto del

TCA, nell’intervallo di concentrazioni considerate. La maggiore sensibilità

retronasale potrebbe essere spiegata dal fatto che la volatilità del TCA potrebbe

essere esaltata dalla temperatura presente nella bocca. Nella selezione del panel,

effettuata mediante test triangolare, furono considerati solo i degustatori che

diedero almeno 5 risposte corrette su 6 replicati sia all’olfatto sia al gusto. Così

per tutte le prove successive il panel fu composto da 14 assaggiatori.

La soglia di determinazione del TCA in acqua fu determinata mediante test

triangolare e i risultati sono riportati in Tabella 11. Il riconoscimento fu

considerato statisticamente significativo (α≤0.001) per concentrationi di 4 e 5 ng/l

di TCA sia al gusto sia all’olfatto, mentre per 3 ng/l non fu considerato

significativo (α≤0.10). Tuttavia, la soglia di determinazione del panel fu stabilita

in 4.5 ng/l e 4.7 ng /l, rispettivamente per il gusto e l’olfatto, calcolato applicando

una regressione lineare ai dati riportati in Tabella 11.

Parte Sperimentale

47

Tabella 11 – Soglie di determinazione del TCA mediante test triangolare in acqua. Il panel era composto da 14 degustatori; per le tre concentrazioni di TCA, a ciascun assaggiatore furono presentate 6 terne di replicati. Sono stati riportati la percentuale di identificazione corretta e i livelli di significatività.

Olfatto Gusto TCA (ng/l) identificazione

corretta % α identificazione

corretta % α

3 45 n.s. 45 n.s. 4 70 0.001 71 0.001 5 90 0.001 94 0.001

n.s. = non significativo Confrontando i nostri risultati con le soglie di percezione per l’acqua riportate in

Tabella 5, il nostro panel risulta meno sensibile al TCA in acqua anche se il test di

riconoscimento mostra un buon livello di sensibilità dei degustatori sia allo

stimolo ortonasale sia a quello retronasale del TCA, come illustrato sopra.

• Curva tempo-intensità

In Figura 8, viene riportata la curva tempo-intensità per il gusto del TCA

(percezione retronasale) ed è rappresentata come una media delle risposte dei 6

degustatori.

La massima intensità è stata raggiunta dopo 15 secondi dall’espettorazione; il

tempo totale di durata era di 55 secondi. Per le nostre conoscenze, è la prima volta

che viene rappresentata una curva T-I per il TCA, e tuttavia ulteriori studi sono

necessari per migliorare la correlazione di questa curva con la percezione del TCA

nel vino. Il

tempo di saturazione e la persistenza della sensazione potrebbero parzialmente

spiegare perchè i degustatori si adattano all’aroma del TCA molto rapidamente.

Parte Sperimentale

48

Per questo motivo, tutti i test sensoriali sono stati effettuati ad adeguati intervalli

di tempo (10 minuti) tra prove successive furono fissate per evitare l’effetto

saturazione.

Figura 8 – Curva tempo-intensità curve per 10 ng/l di TCA in acqua (media su 6 misure). Parametri rilevanti della curva: Tinizio (tempo che rileva il primo valore non zero) = 5 s; Tmax (tempo dove si ha il primo valore massimo) = 15 s; Tfine (tempo che rileva il primo valore zero dopo l’ultimo massimo) = 55 s.

0

2

4

6

8

10

12

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75

tempo (s)

inte

nsità

• Prove sui vini

L’effetto sensoriale del TCA addizionato ai diversi tipi di vino fu controllato

mediante test triangolare dal panel precedentemente selezionato e costituito da 14

assaggiatori. La percentuale di risposte corrette nell’identificazione del TCA e i

livelli di significatività (α) sono riportati nelle Tabelle 12 e 13.

Tmax

Tfine

Tinizio

Parte Sperimentale

49

Come si può vedere, la maggiore sensibilità retronasale del panel al TCA,

osservata in acqua, è molto meno evidente nel vino, soprattutto nei vini rossi.

Questa differenza può essere spiegata con la diversa esperienza dei degustatori

nell’analisi sensoriale del vino.

- Vini bianchi (Tabella 12)

Il vino Frascati con 5 ng/l di TCA addizionati ha ottenuto il 50 % e 52 % di

identificazioni corrette, rispettivamente all’olfatto e al gusto (percezione

ortonasale e retronasale); questi risultati sono significativi (α < 0.01), ma danno

valori più bassi se confrontati con i risultati ottenuti per il TCA in acqua alla

stessa concentrazione (Tabella 11). Come ci aspettavamo, lo stimolo del TCA

interagisce con le caratteristiche sensoriali dei composti presenti nel vino come

l’etanolo, così viene prodotto un effetto mascherante.

Il panel ha mostrato una buona abilità nell’identificare il TCA nel vino, fino alla

quantità di 5 ng/l (addizionati al vino Frascati), che rientra nelle soglie di

determinazione citate in letteratura (Sefton et al., 2005) e i dati riportati in Tabella

5 per i vini bianchi. A causa del livello più basso di significatività nel caso del

vino Frascati, per i vini successivi fu aggiunta una quantità di 7 ng/l di TCA o

maggiore.

Parte Sperimentale

50

Tabella 12 – Effetto sensoriale del TCA addizionato ai vini bianchi, testati dai 14 panellisti mediante test triangolare (3 replicati per ciascun assaggiatore). Sono riportate la percentuale di identificazione corretta e i relativi livelli di significativà. La denominazione completa dei vini e le caratteristiche analitiche sono elencati in Tabella 9.

Vini TCA (ng/l)

Olfatto Gusto

identificazione corretta % α identificazione corretta % α Frascati 5 50 0.01 52 0.01 Chardonnay 7 79 0.001 79 0.001Trebbiano 7 64 0.001 65 0.001Malvasia (dolce) 7 60 0.001 60 0.001Malvasia (secco) 7 50 0.01 55 0.01 Moscato 7 71 0.001 71 0.001Picolit 10 45 n.s. 45 n.s. Picolit 15 62 0.001 64 0.001

n.s. = non significativo

Tra i vini addizionati di 7 ng/l TCA, furono osservate alcune differenze:

Chardonnay è risultato il vino più sensibile con il 79 % di identificazioni corrette

sia al gusto sia all’odore, il vino Malvasia secco è stato il meno sensibile con 55 e

50 % di assegnazioni corrette rispettivamente al gusto e all’olfatto. La minore

sensibilità del vino Malvasia all’effetto del TCA può essere correlato con i suoi

caratteri aromatici che hanno per certi versi un effetto coprente del TCA

contaminante. Una differenza fu osservata nei livelli di significatività per la

percezione ortonasale e retronasale del TCA tra i vini Malvasia dolce e secco,

prodotti dallo stesso mosto e con le stesse caratteristiche aromatiche. Questo

potrebbe essere spiegato con il maggior contenuto alcoolico del vino Malvasia

secco che deprime la volatilità e, di conseguenza, la sua percezione sensoriale.

Queste differenze nei livelli di riconoscimento tra i vini Malvasia dolce e secco

Parte Sperimentale

51

sono risultate più alte all’olfatto che al gusto, senza influire sui livelli di

significatività. Questo suggerisce una maggiore influenza del contenuto alcolico

sulla percezione ortonasale piuttosto che su quella retronasale del TCA in questi

vini. Il vino Moscato, prodotto da uve aromatiche lasciate maturare sulla vigna,

era molto più sensibile al TCA del vino Malvasia e aveva un comportamento

similare a quello dei vini Chardonnay e Trebbiano, anche se le loro caratteristiche

sensoriali e chimiche (contenuto alcolico, acidità volatile) erano differenti. Nel

caso del Picolit, vino bianco invecchiato in barrique, furono addizionati 10 ng/l di

TCA ma l’identificazione non fu significativa (α< 0.10); tuttavia, un’aggiunta di

15 ng/l fu percepita in modo significativo (α<0.001). La minore sensibilità del

panel a questo vino dipende probabilmente dall’effetto congiunto dell’alto

contenuto alcoolico e dell’aroma legnoso.

- Vini rossi (Tabella 13)

Le prove effettuate addizionando una quantità di TCA pari a 10 ng/l e, in alcuni

casi, di 15 ng/l ai vini. Sebbene la quantità di TCA aggiunta era superiore in

confronto ai vini bianchi (ad eccezione del Picolit), l’identificazione del TCA

risultò, in generale, più difficile. Questo dovrebbe essere dovuto ad un maggiore

effetto mascherante dei caratteri sensoriali dei vini rossi rispetto alla percezione

del TCA, che potrebbe essere correlato con le differenze generalmente esistenti

tra i profili aromatici dei vini rossi e i vini bianchi.

Parte Sperimentale

52

Tabella 13 – L’effetto sensoriale del TCA addizionato nei vini rossi, testati dai 14 assaggiatori mediante test triangolare (3 replicati per ciascun degustatore). Vengono riportata la percentuale di identificazioni corrette e i relativi livelli di significatività. La denominazione completa dei vini e le caratteristiche analitiche sono elencati in Tabella 9.

Vini TCA (ng/l)

Olfatto Gusto

identificazione corretta % α identificazione corretta % α Rosso San Severo 10 50 0.01 57 0.001Bardolino 10 79 0.001 79 0.001Valpolicella 15 55 0.01 55 0.01 Barbera 10 43 n.s. 43 n.s. Barbera 15 52 0.01 52 0.01 Cabernet Sauvignon 10 74 0.001 74 0.001Cabernet L.-P. 15 55 0.01 55 0.01 Montepulciano 10 36 n.s. 36 n.s. Montepulciano 15 69 0.001 71 0.001

n.s. = non significativo

Tra i vini rossi non invecchiati in legno con 10 ng/l di TCA addizionati,

l’identificazione fu significativa per i vini Rosso San Severo (α<0.01 e α<0.001

rispettivamente per la percezione ortonasale e retronasale), Bardolino e Cabernet

Sauvignon (per entrambi i vini α<0.001 sia per la percezione ortonasale sia

retronasale). Cabernet Sauvignon si differenziò solo leggermente dal Bardolino nel

corretto riconoscimento del TCA addizionato (74 e 79 % rispettivamente)

mostrando che la percezione del panel non era affetta dalla diversa composizione

chimica dei due vini. Per i vini Barbera e Valpolicella, furono raggiunti valori

significativi di identificazione solo con 15 ng/l di TCA addizionati, e così la

tipologia di questi vini sembra avere un effetto mascherante maggiore nel

riconoscimento del TCA, se confrontati con gli altri vini rossi studiati.

Parte Sperimentale

53

I vini invecchiati in barrique, Cabernet Lison-Pramaggiore e Montepulciano

d’Abruzzo, mostrano un livello significativo di determinazione del TCA

(rispettivamente α<0.01 e α<0.001) solo alla concentrazione di 15 ng/l.

Un’interazione tra l’aroma legnoso e il sentore di muffa può aver luogo anche in

questi vini, come già osservato per il vino bianco Picolit invecchiato in legno,

nonostante per alcuni vini rossi testati l’influenza dell’aroma legnoso mostra una

minore influenza sul riconoscimento del TCA. Infatti, se confrontiamo i vini rossi

non invecchiati in barrique: Barbera e Valpolicella con quelli invecchiati in legno,

Cabernet Lison-Pramaggiore e Montepulciano, con la stessa quantità di TCA

aggiunto (15 ng/l), i livelli di riconoscimento sono confrontabili o leggermente

migliori nel caso dei vini maturati in legno.

Confrontando il comportamento dei vini Barbera e Montepulciano, sembra che

l’aroma legnoso abbia un’influenza minore sul riconoscimento del TCA rispetto

alla tipologia del vino. Per il vino Barbera, la corretta identificazione passò dal 43

al 52 % (sia per la percezione ortonasale sia retronasale) se la concentrazione del

TCA veniva incrementata da 10 a 15 ng/l, e così fu osservata una debole

correlazione tra la quantità di TCA aggiunto e la capacità di identificazione del

panel. Nel vino Montepulciano, quando la concentrazione del TCA passò da 10 a

15 ng/l, le risposte corrette passarono da un livello non significativo (36 % sia per

percezione ortonasale sia retronasale) ad un valore significativo di α inferiore a

0.001 (69 e 71 % rispettivamente per la percezione ortonasale e retronasale).

Conclusioni

Parte Sperimentale

54

Le prove effettuate su soluzioni di TCA in acqua, vini bianchi e rossi hanno

confermato la differente sensibilità individuale del nostro panel. Nel caso dei vini,

la sensibilità del panel allo stimolo del TCA è risultato congruente ai dati

pubblicati in letteratura (Tabella 5).

Per i vini testati non invecchiati in barrique, il riconoscimento del TCA è risultato

più semplice nei vini bianchi piuttosto che in quelli rossi. Per quanto concerne i

vini bianchi, l’effetto del TCA fu mascherato maggiormente nei vini con

caratteristiche varietali più intense e con un contenuto alcoolico più elevato; per

quanto riguarda i vini rossi, si può dire che la tipologia sembra avere un impatto

sensoriale più forte nel riconoscimento del TCA addizionato.

Tra i composti volatili e non volatili dei vini rossi testati, alcuni possono interagire

con la percezione del TCA, spiegando il comportamento osservato. Tuttavia, sulla

base delle conoscenze attuali circa le interazioni gusto-olfattive nei vini rossi, non

è possibile identificare le sostanze che producono differenti livelli di

riconoscimento del TCA nei vini Rosso di San Severo, Cabernet Sauvignon, e

Bardolino se confrontati con Barbera e Valpolicella.

L’aroma legnoso interagisce con il riconoscimento del TCA sia nei vini bianchi

sia nei rossi, ma in questi ultimi lo stile sembra avere un’influenza prevalente.

Nonostante il ridotto numero di vini testati, questi risultati suggeriscono che la

tipologia di un vino ha un importante effetto nell’identificazione del TCA, così

come l’uso generico delle soglie di percezione per tutti i vini non sembra

abbastanza accurato.

Parte Sperimentale

55

I risultati sono stati oggetto di un poster presentato durante il convegno In Vino

Analitica Scientia 2005 (INRA, Montpellier). Il lavoro è in corso di revisione

sulla rivista Food Research International.

Parte Sperimentale

56

3.2. Messa a punto del metodo di estrazione e di analisi del TCA

nel sughero, mediante estrazione solido-liquido e

determinazione per GC/ECD

Nel campo del controllo qualità, sono stati svolti numerosi studi dedicati alla

messa a punto di metodi di determinazione del TCA nel sughero e nel vino,

tuttavia non esiste ancora un metodo ufficiale di estrazione e di analisi.

Come già evidenziato da alcuni autori, il metodo di estrazione con solvente da

buoni risultati sia in termini di riproducibilità sia di ripetibilità; inoltre è un

metodo semplice e nelle possibilità di molti laboratori (Juanola et al., 2002).

Questo aspetto va sottolineato, visto che la determinazione del TCA nei tappi di

sughero si sta diffondendo come metodo di controllo qualità non solo

nell’industria sugheriera ma in tutto il settore enologico. Inoltre utilizzando

l’estrazione con solvente è possibile estrarre la frazione facilmente rilasciabile di

TCA, che permette la stima della quantità di analita che potrebbe andare

successivamente in contatto con il vino, e quindi contaminarlo.

L’obiettivo di questa ricerca è stata la messa a punto di un metodo di estrazione e

di analisi del TCA per il controllo qualità di tappi in sughero.

Materiali e metodi

Parte Sperimentale

57

• Reagenti e prodotti chimici

Tutti i solventi, etanolo assoluto e n-esano RPE furono ottenuti da Carlo Erba

Reagenti (Italia). 2,4,6-tricloroanisolo 99 % fu fornito da Sigma-Aldrich (Italia).

Inoltre fu preparata una soluzione madre alla concentrazione di 250 mg/l di TCA

in esano.

Furono usati anche solfato sodio anidro (Carlo Erba Reagenti, Italia) e filtri di

carta (Schleicher & Schuell, Germania).

• Sughero

Il sughero grezzo fu fornito in forma di tappi e prima di effettuare le prove fu

analizzato e risultò non contaminato da TCA. Visto che non sono disponibili

materiali di riferimento per la validazione del metodo, il sughero per le prove fu

preparato iniettando 0.1 ml di una soluzione di TCA (10 mg/l in esano) in

differenti posizioni sotto la superficie dei tappi (250 ng/g di sughero). In accordo

con quanto riportato da Juanola et al. (2005), la migrazione del TCA iniettato nel

sughero con questa procedura risulta essere molto simile alla migrazione del TCA

che si ha con il sughero naturalmente contaminato, almeno per brevi tempi di

contatto.

Furono analizzati anche sei campioni di tappi di sughero contaminati

naturalmente.

Parte Sperimentale

58

• Metodo di estrazione

Per quanto riguarda il metodo di estrazione sono stati presi in considerazione

diversi parametri ed è stata valutata l’influenza di questi nelle varie fasi. Di

seguito sono riportati i parametri considerati: - il tempo di contatto (6, 12, 24, 48

ore); - la modalità di contatto statico o dinamico (agitazione con movimento

orbitale o alternato); - il tempo (3, 6, 12, 24, 48 ore) e la velocità di agitazione

(100, 200 rpm); - il tipo di solvente (etanolo assoluto, etanolo assoluto/acqua 1:1).

Le condizioni ottimali scelte per effettuare l’estrazione del TCA sono le seguenti:

3 tappi di sughero (circa 12 g) furono messi in contatto con una opportuna

quantità di etanolo assoluto in una bottiglia di vetro chiusa per 48 ore a

temperatura ambiente. La procedura di contaminazione e le condizioni di

estrazione furono fissate in modo tale da poter estrarre e quantificare il TCA

facilmente rilascibile presente nel sughero cercando di simulare il più possibile le

reali condizioni del fenomeno e al tempo stesso con lo scopo di minimizzare

l’estrazione di alcuni componenti come le paraffine.

La frazione organica fu separata filtrando su filtro di carta e fu aggiunta acqua

distillata (1:1 v/v). La soluzione idroalcolica risultante fu estratta per tre volte con

15 ml di n-esano. La frazione esanica fu filtrata su filtro di carta con sodio solfato

anidro per eliminare eventuali residui acquosi e concentrata a 0.5 ml, alla

temperatura di 40°C e alla pressione di 335 mbar con un rotavapor BÜCHI B –

171 (BÜCHI, Switzerland) e poi analizzato con GC-ECD.

• Analisi gas cromatografica

Parte Sperimentale

59

Le analisi furono effettuate con un gas cromatografico GC 1000 (DANI

Instruments S.p.A., Italia) equipaggiato con un rivelatore a cattura di elettroni

(DANI Instruments S.p.A., Italia). Il campione è stato iniettato in modalità

splitless (0.5 µl) in una colonna capillare EC-5 (30 m x 0.25 mm i.d.; 0.25 µm

spessore film; Alltech, Italia). Le condizioni operative erano le seguenti:

temperatura dell’iniettore 200 °C, temperatura del rivelatore 300 °C, carrier gas

N2 con flusso 1.0 ml/min, flusso gas ausiliario N2 30 ml/min. La programmata di

temperature del forno era la seguente: 5 min a 60°C, 5°C/min fino a 200°C e poi

30°C/min fino a 280°C ed infine 5 min a 280°C. L’identificazione del TCA

estratto fu effettuata comparando il tempo di ritenzione con quello di uno standard

commerciale. Per la quantificazione, fu utilizzato il metodo dello standard esterno

preparando delle diluizioni dalla soluzione madre in esano: furono costruite due

curva di calibrazione, una ad alte concentrazione di TCA (soluzioni in esano da

0.5 a 5 µg/l), e un’altra a basse concentrazioni (nell’intervallo da 0.1 a 1 µg/l). Per

ciascun punto della retta di calibrazione, furono analizzati cinque replicati. I dati

cromatografici furono analizzati mediante il programma Clarity software di DANI

Instruments S.p.A.

Risultati e discussione

Parte Sperimentale

60

• Curve di calibrazione

Furono costruite due curve di calibrazione facendo il grafico della concentrazione

di TCA rispetto all’area del picco di TCA corrispondente. I parametri della curva

di calibrazione sono riportati in Tabella 14. I coefficienti di determinazione

ottenuti sono risultati buoni (r2 = 0.998 e 0.999, rispettivamente). La minore

quantità di TCA rilevata per il metodo utilizzato, considerando le fasi di

estrazione e di concentrazione, fu di 5 pg/g di sughero o, considerando il peso

medio di un tappo di sughero pari a 4 g, di 0.02 ng/tappo di sughero.

Tabella 14 - Parametri delle curve di calibrazione (y = a + bx) costruite per la quantificazione del TCA. Per ciascun punto sono stati eseguiti cinque replicati.

• Limite di determinazione (LOD) e limite di quantificazione (LOQ)

Una soluzione esanica di TCA (0.1 µg/l) fu utilizzata per stabilire i limiti di

determinazione e di quantificazione del metodo. Furono considerati cinque

replicati.

Assumendo come limite di determinazione tre volte il rapporto tra segnale e

rumore di fondo e come limite di quantificazione 10 volte questo rapporto, il

TCA µg/l a Sa b Sb r2

0.1 – 1 0.59 0.36 119.36 10.87 0.999

0.5 – 5 31.73 5.75 79.73 8.56 0.998

Parte Sperimentale

61

limite di determinazione è di 1 ng/l mentre il limite di quantificazione è risultato

pari a 3.5 ng/l. Inoltre il valore di LOQ ottenuto è congruente con i limiti riportati

da Jönsson et al. (2006) riguardo alla determinazione del TCA con GC/ECD nel

vino che variano da 2.9 a 18 ng/l.

• Recupero

Il recupero del metodo fu determinato considerando la fase di estrazione e di

analisi di tappi di sughero contaminati da 250 ng/g di TCA. La percentuale di

recupero fu calcolato come rapporto percentuale tra la concentrazione di TCA

estratto, determinata dalla curva di calibrazione, e la concentrazione di TCA

iniettata nel sughero. Il recupero medio fu del 70 % con una deviazione standard

(RSD %) pari all’8 %. Questi dati sono buoni, se si considera che la procedura di

contaminazione consiste nell’iniettare TCA con una siringa nel sughero e che

l’estrazione fu eseguita su una matrice solida. Inoltre si deve considerare che nel

sughero naturalmente contaminato, il TCA spesso è concentrato nella parte più

esterna, quindi la sua estrazione risulta più facile. In letteratura, utilizzando

un’analoga procedura di contaminazione e metodo di estrazione con solvente fu

ottenuto un recupero del 76 %

(Juanola et al., 2002). Valori molto più alti (98-100 %) furono riportati in altri

studi basati su SFE e SPME: in questi casi, la procedura di contaminazione

constava in un’aggiunta esterna di TCA al vino (Taylor et al., 2000; Ezquerro et

al., 2005).

Parte Sperimentale

62

In un recente studio, anche lo HSSE (Head Space Sorptive Extraction) da alti

recuperi (98%) su sughero contaminato per iniezione (Lorenzo et al., 2006).

• Ripetibilità e riproducibilità

Per valutare la ripetibilità, tre differenti campioni di sughero contaminato

(contenenti 250 ng/g di TCA) furono analizzati consecutivamente; invece la

riproducibilità fu stimata analizzando tre campioni identici di sughero

contaminato (contenente 250 ng/g di TCA) preparati in tre giorni diversi. I valori

di RSD ottenuti rispettivamente per la ripetibilità e la riproducibilità furono di 4.5

% e di 6.7 %.

• Applicazione del metodo

Il metodo proposto fu applicato all’analisi di tappi in sughero. La Figura 9 mostra

esempi di cromatogrammi ottenuti da tappi di sughero non contaminati da TCA e

naturalmente contaminate.

Il limite di contaminazione può essere stimato considerando che il livello di

riconoscimento del TCA nel vino varia nell’intervallo tra 4 e 10 ng/l (Sefton,

2005), che rappresenta circa 4-10 ng/tappo se tutto il TCA presente nel tappo di

sughero fosse estratto dal vino. La minima quantità rilevabile con questo metodo

risulta essere adeguata per effettuare una prima analisi della contaminazione da

TCA dei tappi in sughero.

Parte Sperimentale

63

Figura 9– Cromatogrammi ottenuti con la ottimizzazione del metodo: (a) campione di sughero non contaminato da TCA; (b) campione di tappi in sughero contaminato naturalmente con TCA (0.04 ng/g sughero).

(a)

(b)

Parte Sperimentale

64

Conclusioni

Questo metodo presenta una buona alternativa ai metodi basati sull’SPME e

sull’SBSE per la determinazione del TCA nei tappi in sughero, visto che è in

grado di identificare e di quantificare concentazioni di questo composto più basse

di quelle necessarie a produrre il cosiddetto “cork taint”. Questo livello è molto

basso se paragonato con le soglie di TCA nei vini (4-10 ng/l), considerando il

rapporto tra sughero e vino esistente nella bottiglia. Il limite di determinazione è 1

ng/l e il limite di quantificazione è di 3.5 ng/l; i recuperi sono buoni (70 %) con un

RSD % accettabile (8 %), considerando che l’estrazione fu eseguita su tappi in

sughero. Così il metodo proposto sembra essere adeguato per il controllo qualità

dei tappi in sughero.

I risultati sono stati oggetto di un poster presentato durante il “29th Simposium

International on Capillary Chromatography” (Riva del Garda, 29 maggio-2 giugno

2006). Il lavoro è in fase di revisione sulla rivista Italian Journal of Food

Science.

Parte Sperimentale

65

3.3. Confronto tra SBSE (Stir Bar Sortive Extraction) e SPME

(Solid Phase MicroExtraction) per la determinazione di

policlorofenoli e policloroanisoli in vino con analisi gas

cromatografica e l’uso in tandem dello spettrometro di massa

(GC/MS/MS).

Mentre l’estrazione con SPME nello spazio di testa (HS-SPME) e l’uso di stir bar

sorptive extraction (SBSE) combinata con l’analisi GC/MS e GC/ECD è stata

utilizzata da diversi autori per l’analisi di policlorofenoli e policloroanisoli nel

vino (Evans et al., 1997; Lizarraga et al., 2004; Riu et al., 2002; Martínez-

Uruñuela et al., 2004; Jönsson et al., 2006; Zalacain et al., 2004), in letteratura

non sono stati trovati lavori relativi all’uso della microestrazione in fase solida ad

immersione (SPME). Inoltre la bibliografia scientifica non offre dati relativi alla

comparazione di queste tecniche, ma solo indicazioni relative ai singoli metodi di

estrazione (Martínez-Uruñuela et al., 2004; Riu et al., 2006; Jönsson et al., 2006).

Pertanto, uno degli obiettivi di questa parte del lavoro di tesi è stato quello di

confrontare le tecniche SPME, utilizzandola nella modalità ad immersione e nello

spazio di testa, e SBSE, per valutare il metodo più adeguato, rapido ed efficiente

per l’estrazione di policlorofenoli e policloroanisoli nel vino. L’uso della

microestrazione in fase solida nello spazio di testa è consigliata dalle case

produttrici rispetto a quella ad immersione, perchè la fibra utilizzata nella

modalità HS-SPME dà minori problemi di interferenza e dura più a lungo. Inoltre

considerando la complessità della matrice vino, è stato ottimizzato un metodo gas

cromatografico per la determinazione di policlorofenoli e policloroanisoli con

Parte Sperimentale

66

sistema GC/MS/MS. Per la prima volta l’analisi di questi composti è stata

effettuata mediante SBSE e l’uso in tandem dello spettrometro di massa, che

consente di ridurre sia l’effetto del rumore di fondo sia le potenziali interferenze

nella quantificazione. I vantaggi di questo metodo, confrontandolo con il singolo

spettrometro di massa, sono l’incremento di sensibilità e il notevole

miglioramento della selettività (Verenitch et al., 2006).

Materiali e metodi

• Reagenti e prodotti chimici

L’etanolo assoluto RPE fu ottenuto da Merck (Germania), mentre l’acqua fu

purificata mediante il sistema Milli-Q System (Millipore, USA).

2,4,6-triclorofenolo, 2,3,4,6-tetraclorofenolo, 2,4,6-tribromofenolo, 2,4,6-

tricloroanisolo, 2,3,4,6-tetracloroanisolo, 2,4,6-tribromoanisolo e lo standard

interno (IS) γ-esalattone furono forniti da Sigma-Aldrich (Spagna) ed il

pentacloroanisolo fu acquistato da LGC Promochem (Francia).

• Soluzioni standard

Fu preparata una soluzione madre alla concentrazione di 200 mg/l in etanolo

contenente i seguenti composti: 2,4,6-triclorofenolo, 2,3,4,6-tetraclorofenolo,

2,4,6-tribromofenolo, 2,4,6-tricloroanisolo, 2,3,4,6-tetracloroanisolo,

pentacloroanisolo e 2,4,6-tribromoanisolo. Inoltre fu preparata una soluzione

idroalcolica al 12 % (v/v) alla quale furono aggiunti 5 g/l di acido tartarico

(Panreac, Spagna). Il pH della soluzione fu portato a 3.6 con una soluzione di

Parte Sperimentale

67

idrossido di sodio 1 M (Panreac, Spagna). La soluzione idroalcolica fu usata per

diluire la soluzione madre e preparare le soluzioni contenenti gli standard (0.4 ng/l

– 40 µg/l) per la determinazione delle curve di calibrazione per le diverse modalità

di estrazione.

L’identificazione è stata condotta mediante la libreria NIST e la quantificazione si

è basata sulle curve di calibrazione dei rispettivi standard in soluzione

idroalcolica.

Per lo studio della linearità , le curve di calibrazione furono determinate con

soluzioni di vino sintetico addizionato di sette differenti concentrazioni di analiti.

Per ciascun livello di concentrazione furono analizzati quattro replicati. Il limite di

determinazione (LOD) e di quantificazione (LOQ) furono calcolati secondo la

metodologia stabilita dal CATICE (2003).

• Procedura di estrazione

Sono stati esaminati diversi parametri che possono influire sull’efficacia

dell’estrazione, quali il tipo di fibra, l’aggiunta di sale, il volume del campione, il

tempo di estrazione e di desorbimento.

Secondo alcuni studi la fibra in polidimetilsilossano (PDMS) 100 µm è risultata la

più efficace per l’estrazione di policlorofenoli e policloroanisoli in vino,

mostrando una buona sensibilità e ripetitività (Evans et al., 1997; Riu et al., 2002;

Jönsson et al., 2006), così questo tipo di fibra fu impiegato sia per SPME

(Supelco, Bellefonte, USA) sia per SBSE (PDMS, 0.5 mm spessore film, 10 mm

Parte Sperimentale

68

lunghezza, Twister, Gerstel, Germany). Per tutte le tecniche utilizzate il volume

del campione fu di 5 ml, contenenti 25 µl di standard interno.

Per le tre modalità di estrazione il tempo di agitazione fu fissato in 60 minuti con

un’agitazione costante a 250 rpm, a temperatura ambiente per SPME (Martínez-

Uruñuela et al., 2004) e per SBSE, ed alla temperatura di 35 ºC per HS-SPME

(Lizarraga et al., 2004), mentre il tempo di desorbimento fu di 5 minuti.

Per SPME e HS-SPME la procedura di estrazione e di analisi viene eseguita in

modo automatizzato dal sistema gas cromatografico. Per quanto riguarda le stir

bar sorptive extraction furono inserite in matracci da 5 ml contenenti la soluzione

idroalcolica e lo standard interno lasciate in agitazione (250 rpm) a temperatura

ambiente per 60 minuti, poi furono rimosse, lavate con acqua distillata, asciugate

con carta absorbente e trasferite in un tubo per il desorbimento termico e

successivamente analizzate con GC/MS/MS.

• Analisi GC/MS/MS

È stato utilizzato un gas cromatografo Varian CP-3800 (Palo Alto, CA, U.S.A.)

equipaggiato con uno spettrofotometro di massa a trappola ionica Saturn 2200 ed

un autocampionatore Varian CP-8200 (Palo Alto, CA, U.S.A.) con una colonna

capillare Factor four (30 m x 0.25 mm i.d.; 0.25 µm spessore film; Varian,

U.S.A.). Il desorbimento termico dei tubi contenenti le stir bar è stato effettuato

con un sistema di desorbimento termico Perkin-Elmer Turbo Matrix ATM

(Norwalk, CT, U.S.A.).

Le condizioni di desorbimento termico sono state le seguenti: temperatura

trappola 310 ºC; tempo di desorbimento, 5 min; temperatura raffreddamento

Parte Sperimentale

69

trappola, -30 ºC; flusso elio 45 ml/min. Le condizioni dell’analisi

gascromatografica sono state le seguenti: temperatura dell’iniettore 280°C,

temperatura del rivelatore 300°C, flusso carrier gas He 1.0 ml/min; la

programmata di temperature del forno: 2 min a 70°C, 20 °C/min fino a 150 °C (2

min) e poi 10 °C/min fino a 300 °C per 5 minuti.

La capacità della tecnologia a trappola ionica di manipolare la popolazione ionica

seguendo gli ioni in creazione ma con priorità allo ione di analisi, è molto

vantaggioso soprattutto quando devono quantificare livelli molto bassi di sostanze

con alti livelli di interferenze, come in questo caso. E’ stato necessario mettere a

punto un metodo di preparazione dello ione (IPM). I parametri di preparazione

dello ione controllano le funzioni basiche della ionizzazione elettronica e come

possono essere modificate nel preparare gli ioni per la scansione; questi parametri

permettono inoltre il controllo degli ioni espulsi, di quelli trattenuti, e di quelli che

saranno sottoposti alla collisione indotta generando la dissociazione (CID). La

tecnica di preparazione degli ioni determina come la funzione scansione viene

costruita e il tipo di impatto che si va a creare per la dissociazione dello ione.

Le condizioni MS/MS per la dissociazione dei precursori ionici selezionati furono

ottimizzati mediante l’uso del metodo di sviluppo automatizzato (AMD)

disponibile nel software di Varian Saturn. Una volta ottimizzata l’energia per la

dissociazione dello ione selezionato sono state effettuate le analisi mediante l’uso

in tandem dello spettrometro di massa.

Risultati e discussione

• SBSE

Parte Sperimentale

70

Per ciascun composto è stata calcolata la curva di calibrazione, costruendo il

grafico della concentrazione della sostanza da determinare rispetto all’area del

picco corrispondente. In Tabella 15 sono riportati i principali parametri analitici

determinati mediante estrazione con stir bar sorptive extraction e analisi

GC/MS/MS.

Tabella 15 – Caratteristiche analitiche del metodo SBSE e analisi GC/MS/MS.

SBSE TCA TeCA PCA TCP TeCP TBA TBP Ioni composto (m/z) 195, 197,

210, 212 203, 231,

246 237, 265,

280 132, 160,

196 166, 232 329, 344 332

Ione selezionato (m/z) 195 246 280 196 232 344 332 Intervallo conc. (ng/l) 0.4-500 1.0-500 0.4-500 0.4-500 0.4-500 0.4-500 0.4-500 Intercetta 110.1 307.3 74.8 17.1 77.0 277.5 31.0 Pendenza retta 19072.0 657.3 2468.7 346.1 1454.6 1229.9 9212.5 Linearità curva (r2) 0.995 0.999 0.991 0.989 0.978 0.988 0.999 LOD (ng/l) 0.034 0.711 0.046 0.064 0.240 0.226 0.004 LOQ (ng/l) 0.099 1.278 0.084 0.097 0.557 0.226 0.005 Riproducibilità (%) 0.231 0.126 0.063 0.022 0.121 0.004 0.019 Ripetibilità (% RDS) 0.133 0.073 0.036 0.013 0.086 0.002 0.011

TCA: 2,4,6-tricloroanisolo; TeCA: 2,3,4,6-tetracloroanisolo; PCA: pentacloroanisolo; TCP: 2,4,6-triclorofenolo; TeCP: 2,3,4,6-tetraclorofenolo; TBA: 2,4,6-tribromoanisolo; TBP: 2,4,6-tribromofenolo.

I risultati ottenuti con questo metodo permettono di identificare e quantificare sia

concentrazioni inferiori alle soglie di percezione dei composti presi in esame (vedi

Tabella 4, es. soglia di percezione del TCA nei vini: 4-10 ng/l) sia concentrazioni

maggiori in grado di causare gravi contaminazioni. In Figura 10 è mostrato un

cromatogramma ottenuto con il metodo di estrazione SBSE ed analisi GC/MS/MS

alla concentrazione di 10 ng/l.

Parte Sperimentale

71

Figura 10 – Cromatogramma ottenuto con il metodo SBSE e analisi GC/MS/MS.

TCA

TeCA

TCPTeCP

TBA TBP

PCA

Parte Sperimentale

72

• SPME

Sono state costruite le curve di calibrazione relative a TCA, TeCA, PCA, TCP,

TeCP, TBA e TBP determinate mediante analisi GC/MS/MS con il metodo

SPME, e le caratteristiche analitiche sono mostrate in Tabella 16.

Tabella 16 – Caratteristiche analitiche ottenute mediante SPME ed analisi GC/MS/MS.

SPME TCA TeCA PCA TCP TeCP TBA TBP Ioni composto (m/z) 195, 197,

210, 212 203, 231,

246 237, 265,

280 132, 160,

196 166, 232 329, 344 332

Ione selezionato (m/z) 195 246 280 196 232 344 332 Intervallo conc. (µg/l) 0.5-40 0.5-40 0.5-40 0.5-40 0.5-40 0.5-40 0.5-40 Intercetta 186.3 586.6 1850.9 2.9 2.8 959.9 3.4 Pendenza retta 439.3 1345.8 2780.9 9.8 11.3 1831.5 16.0 Linearità curva (r2) 0.965 0.978 0.991 0.994 0.983 1.000 0.991 LOD (ng/l) 0.464 0.664 0.883 0.302 0.252 0.524 0.216 LOQ (ng/l) 0.556 1.149 1.392 0.324 0.253 0.525 0.224 Riproducibilità (%) 0.042 0.175 0.201 0.003 0.000 0.008 0.002 Ripetibilità (% RDS) 0.024 0.101 0.116 0.002 0.000 0.005 0.001

TCA: 2,4,6-tricloroanisolo; TeCA: 2,3,4,6-tetracloroanisolo; PCA: pentacloroanisolo; TCP: 2,4,6-triclorofenolo; TeCP: 2,3,4,6-tetraclorofenolo; TBA: 2,4,6-tribromoanisolo; TBP: 2,4,6-tribromofenolo.

Nonostante i parametri ottenuti con la microestrazione in fase solida ad

immersioni non siano così buoni se confrontati con SBSE, anche questa

metodologia analitica consente di identificare e quantificare concentrazioni dei

composti presi in esame inferiori a quelle necessarie per causare il cosiddetto

gusto di tappo.

• HS-SPME

In Tabella 17 sono riportati i parametri analitici delle sostanze esaminate con

analisi GC/MS/MS e mediante estrazione con HS-SPME.

Parte Sperimentale

73

Tabella 17 – Caratteristiche analitiche del metodo HS-SPME e analisi

GC/MS/MS.

HS-SPME TCA TeCA PCA TCP TeCP TBA TBP Ioni composto (m/z) 195, 197,

210, 212 203, 231,

246 237, 265,

280 132, 160,

196 166, 232 329, 344 332

Ione selezionato (m/z) 195 246 280 196 232 344 332 Intervallo conc. (µg/l) 0.25-10 0.25-10 0.25-10 0.25-10 0.25-10 0.25-10 0.25-10 Intercetta 1010.3 2108.6 2262.1 1402.1 1878.9 8332.7 102.3 Pendenza retta 405.4 739.6 382.7 523.8 741.9 2738.9 33.2 Linearità curva (r2) 0.998 0.998 0.994 0.998 0.997 0.995 0.997 LOD (ng/l) 87.4 107.4 243.1 150.2 106.7 221.9 7.6 LOQ (ng/l) 285.5 351.2 796.4 494.6 349.8 732.7 18.0 Riproducibilità (%) 1.515 2.270 3.012 1.931 5.364 6.322 0.122 Ripetibilità (% RDS) 1.071 1.605 1.739 4.318 3.097 4.470 0.070

TCA: 2,4,6-tricloroanisolo; TeCA: 2,3,4,6-tetracloroanisolo; PCA: pentacloroanisolo; TCP: 2,4,6-triclorofenolo; TeCP: 2,3,4,6-tetraclorofenolo; TBA: 2,4,6-tribromoanisolo; TBP: 2,4,6-tribromofenolo.

In questo caso i risultati ottenuti non sono buoni come per SBSE e SPME, e non

vengono raggiunti i livelli di LOD e LOQ proposti da altri autori (Martinez-

Uruñuela et al., 2004), questo può essere spiegato dal fatto che utilizzarono

temperature di estrazione più elevate (70 ºC) e furono utilizzate fortificazioni dei

campioni. L’obiettivo di questo studio constava nel confronto di diverse modalità

di estrazione a parità di condizioni analitiche e non nell’ottimizzazione di questi

metodi: confrontando le tecniche prese in esame l’estrazione con stir bar (SBSE)

ha dato i valori migliori, fornendo livelli di LOD e LOQ dell’ordine dei pg/l, una

buona riproducibilità e ripetitibilità.

Figura 11 sono riportati i cromatogrammi ottenuti rispettivamente con i metodi

SPME e HS-SPME alla concentrazione di 100 µg/l e successiva analisi

GC/MS/MS.

Parte Sperimentale

74

Figura 11 – Cromatogrammi ottenuti rispettivamente con il metodo SPME ed HS-SPME ed analisi GC/MS/MS.

TCA

PCA

TBA

TeCA TBP TeCP

TeCP

TCP

PCAHS-SPME

SPME

Parte Sperimentale

75

Per rendere più facile il confronto tra queste tecniche di estrazione in Figura 12

sono mostrati i livelli di LOD e LOQ per il TCA, principale responsabile del cork

taint nei vini.

Figura 12 – Livelli di LOD e LOQ per il TCA ottenuti rispettivamente con SBSE, SPME e HS-SPME e successiva analisi GC/MS/MS.

0,03 0,1 0,5 0,6

87,4

285,5

0

50

100

150

200

250

300

conc

. TCA

(ng/

l)

SBSE SPME HSSPME

LOD LOQ

Conclusioni

Il presente lavoro conferma l’efficacia dell’uso in tandem dello spettrometro di

massa per l’analisi di bassi livelli di policlorofenoli, policloroanisoli, TBA e TBP

nel vino.

Parte Sperimentale

76

Dal confronto effettuato in questo studio, la tecnica SBSE ha dimostrato di essere

la più efficace nella determinazione di questi composti, a parità di condizioni di

estrazione e di analisi. Inoltre questo metodo risulta essere una buona alternativa

alla metodologia classica per l’identificazione e la quantificazione di queste

sostanze nel vino sia per livelli inferiori alla soglia di determinazione sia per

contaminazioni più importanti: non richiede manipolazioni del campione né l’uso

di solventi organici, è rapido e semplice, e sembra adeguato per l’analisi di

routine. Il lavoro è in fase di revisione sulla rivista Journal of Chromatography A.

Parte Sperimentale

77

3.4. Caratterizzazione di microorganismi naturalmente presenti

nel sughero in base alla loro capacità di degradare TCP e formare

TCA.

I microorganismi presenti sulle plance di sughero (Quercus suber L.) possono

influire negativamente sulla qualità dei tappi, se il loro metabolismo consente la

formazione di sostanze capaci di produrre anomalie gusto-olfattive, che in seguito

potrebbero essere trasmesse anche al vino. La contaminazione del sughero,

causata dai metaboliti microbici, è un grave problema per le industrie del settore

enologico e sugheriero.

Fino ad oggi non sono stati effettuati studi esaustivi per identificare i

microorganismi responsabili della bioconversione del TCP a TCA e i meccanismi

biochimici che portano alla formazione di questa sostanza. Così sono stati presi in

considerazione sette ceppi fungini isolati da sughero grezzo e uno da uve.

L’obiettivo di questo lavoro è stato quello di caratterizzare questi microrganismi

sia in mezzo sintetico solido (condizioni ottimali di accrescimento) sia sul sughero

(sotto stress), in funzione della loro abilità di biodegradare TCP e produrre TCA.

Le spore di ciascun ceppo sono state inocultate su malt extract agar e su polvere di

sughero umidificata in presenza di una quantità nota di TCP per valutare le loro

capacità degradative nei due diversi terreni di coltura.

Il metodo di estrazione e l’analisi gas cromatografica furono ottimizzate per la

determinazione del TCP consumato e del TCA prodotto.

Parte Sperimentale

78

Materiali e metodi

• Reagenti e prodotti chimici

Tutti i solventi, etanolo assoluto e n-esano RPE furono ottenuti da Carlo Erba

Reagenti (Italia). 2,4,6-tricloroanisolo 99% fu fornito da Sigma-Aldrich (Italia) e

2,4,6-triclorofenolo 97% da Fluka (Svizzera).

Furono usati anche solfato sodio anidro (Carlo Erba Reagenti, Italia) e filtri di

carta (Schleicher & Schuell, Germania).

Malt Extract Agar (MEA) fu fornito da Oxoid (U.K.) per il mantenimento e

l’accrescimento dei microorganismi.

Il sughero grezzo fu analizzato e risultò non contaminato da TCP e TCA, poi fu

polverizzato con un mulino (Model 4, Thomas-Wiley, U.S.A.) dopo averlo

congelato sotto azoto liquido; fu utilizzata solo la frazione con un diametro ≤1

mm.

• Microorganismi

I microorganismi furono isolati da sughero grezzo e i generi furono assegnati

morfologicamente, come riportato in un precedente lavoro (Caldentey et al.,

1998). I funghi furono conservati in frigorifero alla temperatura di 4 ºC.

I microrganismi considerati appartenevano ai seguenti generi: Penicillium spp. (3

ceppi), Aspergillus spp. (2 ceppi), Trichoderma spp. e Chrysonilia spp. (1 ceppo).

Inoltre è stata presa in considerazione la Botrytis cinerea, isolata da uve, per

valutare il comportamento in caso di contaminazione visto che questo ceppo

fungino si può trovare facilmente sulle uve e in ambiente di cantina.

Parte Sperimentale

79

La purezza di ciascun ceppo fu osservata al microscopio elettronico a scansione

effettuando un controllo morfologico della struttura riproduttiva (Philips XL-30

ESEM). Le foto di alcuni ceppi fungini utilizzati sono mostrate in Figura 12.

Figura 12 – Micrografie ottenute dall’analisi SEM per alcuni dei ceppi utilizzati

durante lo studio: a) Aspergillus ; b) Penicillium ; c) Trichoderma; d) Chrysonilia.

a) b)

c) d)

• Biosintesi del 2,4,6-tricloroanisolo da 2,4,6-triclorofenolo per

accrescimento fungino su mezzo sintetico (MEA)

Le spore di ciascun ceppo fungino furono inoculate in un becker contenente 100

ml di MEA e TCP alla concentrazione di 1 mg/l. I becker furono incubati

staticamente per 20 giorni a 25 °C. Furono effettuati due esperimenti indipendenti

Parte Sperimentale

80

per ciascun microorganismo. Furono eseguite anche le prove in bianco, come

descritto sopra, con MEA, con MEA senza addizionare TCP e con inoculo di

microorganismi, e con MEA addizionata di TCP ma senza inoculare alcun ceppo

fungino. In Figura 13 sono riportate le foto relative all’accrescimento su mezzo

sintetico di alcuni ceppi utilizzati per le prove.

Figura 13 - Foto relative all’accrescimento su mezzo sintetico di alcuni ceppi utilizzati durante lo studio: a) Aspergillus ; b) Penicillium ; c) Trichoderma; d) Chrysonilia. a) b)

c) d)

• Biosintesi del 2,4,6-tricloroanisolo da 2,4,6-triclorofenolo per

accrescimento fungino su sughero

Parte Sperimentale

81

20 g di polvere di sughero furono posti in un becker contenenti 20 ml di acqua

distillata e 20 µg di TCP e inoculati separatamente con il ceppo fungino (Figura

14). I becker furono incubati staticamente per 110 giorni a 25 °C. Furono eseguite

anche le prove in bianco, con polvere di sughero e acqua, con polvere di sughero e

acqua senza addizionare TCP e con inoculo di microorganismi, e con polvere di

sughero e acqua addizionata di TCP ma senza inoculare alcun ceppo fungino.

Figura 14 - Foto relativa all’accrescimento su polvere di sughero di un ceppo di Trichoderma.

• Procedura di estrazione

Ciascun becker fu estratto con 200 ml di etanolo assoluto per 48 ore a 25 °C; poi

la soluzione alcoolica fu filtrata su filtro di carta e addizionata con 100 ml di

acqua distillata (soluzione idroalcoolica 1). Successivamente fu eseguita una

seconda estrazione degli stessi becker, con 100 ml di etanolo assoluto per 48 ore a

25 ºC e la soluzione alcoolica fu filtrata e addizionata con 50 ml di acqua distillata

(soluzione idroalcoolica 2). Le due soluzioni idroalcooliche risultanti (1 e 2)

furono estratte separatamente per due volte con 20 ml di n-esano. Ciascuna

Parte Sperimentale

82

frazione esanica fu analizzata separatamente, come descritto di seguito, mediante

analisi gas cromatografica.

• Analisi di TCA e TCP

Gli estratti esanici furono analizzati con un gas cromatografico GC 1000 (DANI

Instruments S.p.A., Italia) equipaggiato con un rivelatore a cattura di elettroni

(ECD) fornito da DANI Instruments S.p.A. (Italia). Il campione è stato iniettato in

modalità splitless (0.5 µl) in una colonna capillare EC-5 (30 m x 0.25 mm i.d.;

0.25 µm spessore film; Alltech, Italia). Le condizioni operative erano le seguenti:

temperatura dell’iniettore 200 °C, temperatura del rivelatore 300 °C, flusso carrier

gas N2 1.0 ml/min, flusso gas ausiliario N2 30 ml/min. La programmata di

temperature del forno era: 5 min a 60 °C, 5 °C/min fino a 200 °C e poi 30 °C/min

fino a 280 °C ed infine 5 min a 280 °C. I dati cromatografici furono analizzati

mediante il programma Clarity software di DANI Instruments S.p.A.

L’identificazione e la quantificazione del TCP e del TCA estratti fu effettuata

mediante le rette di calibrazione costruite con il metodo dello standard esterno e

comparando il tempo di ritenzione con quello di uno standard commerciale. Per

ciascun punto della retta di calibrazione, furono analizzati cinque replicati.

Il recupero globale del TCP, calcolato su tre replicati sia per il mezzo sintetico sia

per il sughero, fu rispettivamente del 72 % (RSD 4 %) e del 61 % (RSD 4%)

considerando sia la fase di estrazione sia il metodo di analisi.

Per conferma, gli estratti esanici provenienti dall’accrescimento su sughero furono

analizzati anche con un sistema di desorbimento termico (STD) e analisi GC/MS

Parte Sperimentale

83

presso l’E.T.S.I.Agrónomos (Università di Castilla-La Mancha, Albacete,

Spagna). Un’aliquota degli estratti esanici (10 µl) fu iniettata in un tubo di acciaio

inox per il desorbimento termico, contenente lana di vetro precedentemente

condizionata alla temperature di 300 ºC per un minuto sotto flusso di azoto (100

ml/min). Fu utilizzato un dersorbitore termico Perkin-Elmer ATD 400 (Norwalk,

CT, U.S.A.) combinato con un gas cromatografo Hewlett-Packard 6890

accoppiato con uno spettrometro di massa Hewlett-Packard LC 3D mass detector

(Palo Alto, CA, U.S.A.) con una colonna capillare BP21 (50 m x 0.22 mm i.d.,

0.25 µm spessore film; SGE, Ringwood, Australia). Le condizioni di

desorbimento termico impiegate erano le seguenti: temperatura trappola 330 ºC;

tempo di desorbimento, 4 min; temperatura raffreddamento trappola, -30 ºC;

flusso elio 45 ml/min. La programmata di temperature del forno era: 5 min a 50

°C, 2.5 °C/min fino a 180 °C (2 min) e poi 5 °C/min fino a 230 °C ed infine 20

min a 230 °C. Per l’analisi con lo spettrometro di massa, fu usata la modalità

impatto elettronico (EI) a 70 eV. L’intervallo delle masse variava da 35 a 500 u e

la temperature del detector era di 150 ºC. L’identificazione fu effettuata mediante

la libreria NIST e la quantificazione fu basata sulle curve di calibrazione dei

rispettivi standard in esano. Inoltre per le analisi con lo spettrometro di massa fu

utilizzata la modalità SIM (Selective Ion Monitoring) ed i seguenti ioni: 2,4,6-

tricloroanisolo, m/z 195, 197, 210, 212; e 2,4,6-triclorofenolo, m/z 132, 160, 196

(Zalacain et al., 2004).

Risultati e discussione

Parte Sperimentale

84

I dati riportati in Tabella 16 mostrano l’abilità dei microorganismi testati a

trasformare il TCP su mezzo sintetico (MEA) determinata mediante GC/ECD, e

su sughero ottenuta con GC/ECD e STD-GC/MS.

Tutti i ceppi hanno la capacità di degradare il TCP sia su mezzo sintetico sia su

sughero. Nel mezzo sintetico i tre ceppi di Penicillium isolata e Botrytis cinerea

sono risultati i più attivi; Aspergillus isolata mostrano una capacità degradativa

media; Chrysonilia spp. e Trichoderma spp. sono stati i meno attivi.

Tabella 16 – Percentuale di TCP degradato dall’accrescimento fungino su mezzo sintetico (MEA) e su sughero.

% TCP trasformato

MEA Sughero

Ceppo fungino GC/ECD GC/ECD STD-GC/MS

Penicillium spp. 1 60.3±0.7 98.7±0.8 93.2±1.3 Penicillium spp. 2 68.2±0.7 62.2±1.3 65.1±1.6 Penicillium spp. 3 76.8±1.1 46.9±2.4 49.7±1.8 Aspergillus spp. 1 45.1±1.6 80.1±1.1 85.1±1.0 Aspergillus spp. 2 55.5±1.3 78.5±1.6 75.8±1.4 Trichoderma 35.6±1.7 87.0±1.3 88.7±1.3 Chrysonilia 35.4±1.8 95.7±1.0 92.9±1.1 Botrytis cinerea 65.9±1.1 71.6±1.6 74.3±1.4

I valori sono la media di due esperimenti indipendenti effettuati per ciascun ceppo fungino. Nel sughero tutti i fungi hanno mostrato una maggiore abilità di degradazione del

TCP rispetto al mezzo sintetico, ad eccezione di 2 ceppi di Penicillium spp. che

presentano uguale (Penicillium spp. 2) o minore (Penicillium spp. 3) capacità di

consumare TCP. Botrytis cinerea e Penicillium spp. 2 degradano quantità simili di

TCP nei due terreni di coltura.

Confrontando il comportamento dei microorganismi testati su mezzo sintetico con

quelli appartenenti alla stessa specie usati da Silva Pereira et al. (2000a), i ceppi di

Parte Sperimentale

85

Penicillium spp. che abbiamo impiegato mostrano una capacità più omogenea di

consumare alti livelli di TCP, mentre la nostra Chrysonilia presenta una minore

abilità nel degradare il TCP.

Confrontando i risultati ottenuti dall’accrescimento su sughero dei ceppi fungini

con i due differenti metodi di analisi, si hanno dati congruenti che mostrano lo

stesso andamento.

In Tabella 17 è riportata l’abilità a produrre TCA per i microorganismi testati in

mezzo sintetico (MEA) determinata mediante GC/ECD, e su sughero ottenuta con

i metodi GC/ECD e STD-GC/MS.

La capacità di formare TCA varia tra i ceppi utilizzati: Chrysonilia non è capace

di produrre TCA, né in mezzo sintetico né sul sughero, come già dimostrato da

altri lavori (Silva Pereira et al., 2000a).

Un basso livello di TCA fu ottenuto da tutti i tre ceppi di Pencillium spp., ma

Penicillium spp.1 e Penicillium spp. 2 sono risultati più attivi su MEA mentre

Penicillium spp. 3 mostra un comportamento opposto. Per questi funghi la

metilazione del TCP non è il principale processo di detossificazione. Aspergillus

spp. 1, Trichoderma spp. e Botrytis cinerea hanno mostrato la maggiore abilità nel

produrre TCA su MEA, ma presentano un comportamento differente su sughero:

Botrytis cinerea produce gli stessi livelli di TCA nei due mezzi, Aspergillus spp. 1

è risultato meno attivo su sughero, e Trichoderma spp. mostra un comportamento

molto differente con livelli bassi di TCA formato su sughero rispetto a quello

prodotto su mezzo sintetico.

Parte Sperimentale

86

Tabella 17 – Percentuale di TCA formato dall’accrescimento fungino su mezzo sintetico (MEA) e su sughero.

% TCA

MEA Sughero

Ceppo fungino GC/ECD GC/ECD STD-GC/MS

Penicillium spp. 1 5.4±1.1 1.2±0.7 1.3±0.6 Penicillium spp. 2 7.2±1.0 1.1±0.4 1.9±0.7 Penicillium spp. 3 1.3±0.6 7.5±1.4 5.8±1.1 Aspergillus spp. 1 16.5±1.7 10.4±1.0 9.1±1.3 Aspergillus spp. 2 10.6±1.8 10.3±1.1 11.4±1.0 Trichoderma 18.8±1.3 1.2±0.6 1.1±0.3 Chrysonilia 0.0±0.0 0.1±0.0 0.2±0.1 Botrytis cinerea 19.0±1.3 16.3±1.1 15.5±0.8

I valori sono la media di due esperimenti indipendenti effettuati per ciascun ceppo fungino.

Aspergillus spp. 2 è risultato meno attivo su MEA rispetto all’Aspergillus spp. 1,

ma sul sughero i due ceppi di Aspergillus spp. producono gli stessi livelli di TCA.

Anche per quanto riguarda il TCA formato dall’accrescimento dei microorganismi

sul sughero, i risultati ottenuti con i due metodi di analisi mostrano un andamento

analogo.

Come proposto da Tindale et al. (1989) nel caso dei funghi coltivati su mezzo

sintetico, i nostri ceppi possono essere classificati secondo la loro abilità di

metilare TCP, formando TCA (Tabella 18).

Tabella 18 – I microorganismi testati sono stati classificati in funzione della loro

abilità di metilazione sia in mezzo sintetico (MEA) sia su sughero.

Ceppo fungino Metilazione su MEA Metilazione su sughero Penicillium spp. 1 debole Debole Penicillium spp. 2 debole Debole Penicillium spp. 3 debole Debole

Parte Sperimentale

87

Aspergillus spp. 1 moderato moderato Aspergillus spp. 2 moderato moderato Trichoderma spp. moderato debole Chrysonilia spp. debole debole Botrytis cinerea moderato moderato

Debole: TCA prodotto <10 %; moderato: TCA prodotto tra 10 e 45%; forte: TCA prodotto >45%.

La capacità di metilare trovata per i ceppi fungini da noi testati in entrambi i

mezzi di accrescimento si è risultata uguale, ad eccezione del caso del

Trichoderma spp. che è risultato più attivo su MEA.

In accordo con la classificazione riportata da Tindale et al. (1989) e quanto riferito

nel lavoro di Silva Pereira et al. (2000a), Penicillium spp. e Chrysonilia spp.

hanno confermato una debole abilità di metilare.

Conclusioni

Si può osservare che i microorganismi isolati dal sughero mostrano una diversa

capacità di biodegradare TCP, e nella maggior parte dei casi solo una piccola

percentuale di TCP è trasformata in TCA. I risultati suggeriscono che una crescita

controllata dei ceppi fungini sul sughero può influenzare la formazione di TCA, il

composto che più spesso viene associato con il gusto di tappo nel vino.

I nostri risultati confermano quanto già proposto da altri ricercatori che hanno

ipotizzato l’utilizzo, durante le varie fasi di lavorazione del sughero, di ceppi

fungini dotati di una elevata abilità di degradare TCP ed incapaci di sintetizzare

TCA (Silva Pereira et al., 2000a; Grossman, 1993).

Il presente studio mette in evidenzia un importante risultato, prima d’ora non

segnalato in letteratura e cioè la “moderata” capacità di metilare della Botrytis

Parte Sperimentale

88

cinerea. Dal momento che questo microorganismo è facilmente riscontrabile negli

ambienti di cantina e sulle uve, la sua capacità di produrre TCA in presenza di

TCP potrebbe in parte spiegare la presenza del “gusto di tappo” segnalata anche in

vini non ancora imbottigliati (Sefton et al., 2005; Chatonnet et al., 1994).

Il lavoro è in fase di revisione sulla rivista Journal of Agriculture and Food

Chemistry.