Patologie da mutazioni dinamichePatologie da mutazioni dinamiche

Mutazioni dinamiche

mutazioni progressive, nei tessuti e nelle generazioni, di ripetizioni instabili

Alleli normali Pre-mutazioni Mutazioni

Le alterazioni fenotipiche (patologia) si manifestano al di là di un valore soglia

DNA ripetutoDNA ripetuto � stabile ad ogni replicazione e tra generazioni

Perché allora alcuni alleli tendono ad espandersi? Forse

elementi in cis favoriscono l’espansione

Come si formano le ripetizioni?

INSTABILITÀ MITOTICA ���� presenza di espansioni di grandezze

differenti all’interno dello stesso tessuto e tra tessuti diversi

(mosaicismo tissutale)

INSTABILITÀ MEIOTICA���� trasmissione alle generazioni

successive di una espansione di diversa ampiezza. E’ alla base

del meccanismo dell’anticipazione genetica.

Anticipazione genetica

� La malattia esordisce più precocemente da una

generazione alla successiva

� La severità della malattia aumenta da una generazione

alla successiva

50 anni

30 anni

10 anni

Malattie da espansione di tripletteMalattie da espansione di triplette

Patologie da espansione di triplette

ripetizioni consecutive, in numero variabile e quindi polimorfe, di sequenze uguali

• Causano in genere disordini neurologici (malattie neurologiche, neurodegenerative

e neuromuscolari)

• Tendenza al rapporto lineare fra numero di numero di ripetizioni e gravita’ del

quadro clinico

• Si possono accompagnare ad anomalie citogenetiche (sito fragile)

• Espansione preferenziale nelle trasmissioni materne (sindrome dellsindrome dell’’XX--fragilefragile,

distrofia muscolare miotonicadistrofia muscolare miotonica) o paterne (corea di corea di HuntingtonHuntington)

• Spesso associate al fenomeno dell’ anticipazione geneticaanticipazione genetica (= esordio piu’ precoce

da una generazione alla successiva e spesso aggravamento dei sintomi) inspiegabili

dalla genetica classica e spiegati solo negli ultimi anni con la “genetica dinamica”

Perché un aumento nel numero delle sequenze ripetute causa

una patologia?

�esistono differenti meccanismi molecolari

Espansioni in regioni codificanti del gene � es. corea di corea di HuntingtonHuntington

Espansioni in regioni non codificanti del gene � es. sindrome dellsindrome dell’’XX--fragilefragile e e

distrofia miotonica di tipo 1 e 2distrofia miotonica di tipo 1 e 2

Malattia di Martin Bell o sindrome dell’X-fragile

E’ la seconda causa di ritardo mentale di natura genetica dopo la sindrome

di Down.

Si associa ad anomalie citologiche (sito fragile)

Frequenza: 1/4000 maschi; 1/6000 femmine

Fenotipo:- ritardo mentale grave

- faccia allungata con mandibola larga

- grandi orecchie a sventola

- testicoli ingrossati (macro-orchidismo)

Alterazione responsabile della malattia:

Espansione della tripletta CGGCGG nella 5’UTR del gene FMRFMR--11 che ne determina il

silenziamentosilenziamento genico genico (malattia da perdita di funzioneperdita di funzione) ) e la mancata produzione

della proteina FRMP FRMP (fragile X-mental retardation protein).

Fenotipo normale: <50 repeats

Fenotipo premutato: 55-200 repeats

Fenotipo malato: >200 repeats

FMRP è una proteina legante gli RNA (RNARNA--bindingbinding proteinprotein) espressa soprattutto nei

testicoli e nel cervello, i tessuti più colpiti dalla sindrome. FMRP si associa ad RNA

messaggeri codificanti importanti proteine neuronali, e ne regola alcuni aspetti essenziali,

quali il trasporto lungo i dendriti verso le sinapsi e la traduzione in proteine.

Xq27.3) ����

Genetica:

• Espansione preferenziale nelle trasmissioni materne.

• Patologia X-linked

% maschi affetti più alta � no prodotto genico

% femmine affette più bassa � dipende da quale cromosoma X è inattivato

DURANTE L’OOGENESI

amplificazione PRE-MUTAZIONE MUTAZIONE COMPLETA

La tendenza all’espansione della sequenza ripetuta CGG si verifica solo quando la premutazione è

trasmessa dalla madre: pertanto, poichè durante la maturazione dell'ovulo materno o nelle prime

fasi della crescita embrionale, la premutazione può espandersi a mutazione completa, una madre

portatrice sana avrà il rischio del 50% di avere dei figli maschi affetti e del 50% di avere delle

femmine con la mutazione completa metà delle quali presenterà i sintomi della malattia

Quando la premutazione è trasmessa dal padre rimane stabile quindi le figlie femmine

riceveranno la premutazione senza che avvengano variazioni nel numero delle triplette

CGG. I figli maschi, invece, ricevono dal padre il cromosoma Y pertanto non sono a

rischio di ereditare la premutazione .

NB:NB:

La mutazione patologica (definita La mutazione patologica (definita full full mutationmutation)), corrisponde , corrisponde

allall’’allele con > 200 allele con > 200 triplette metilatetriplette metilate

Casi particolari (rari):Casi particolari (rari):

MosaicismoMosaicismo di lunghezza di lunghezza (normale/(normale/premutatopremutato; ; premutatopremutato/mutato; normale/mutato) /mutato; normale/mutato) �� fenotipo variabilefenotipo variabile

MosaicismoMosaicismo di metilazione di metilazione (alleli con > 200 triplette metilati e (alleli con > 200 triplette metilati e

non metilati) non metilati) �� fenotipo variabilefenotipo variabile

1% dei pazienti non presenta espansione di triplette ma 1% dei pazienti non presenta espansione di triplette ma

mutazioni puntiformi o mutazioni puntiformi o delezionedelezione del genedel gene

Albero genealogico di famiglia con FRAX

I

II

III

Fenotipo malato: >200 repeats

Distrofia muscolare miotonica di tipo 1 o Malattia di Steinert

Caratteristiche: patologia ad andamento progressivo caratterizzata da miotonia e

distrofia muscolare. Presente in forma lieveforma lieve (dell’adulto), in forma classicaforma classica (esordio in

età adulta o giovanile) ed una forma congenitaforma congenita (presente alla nascita)

Frequenza: 1/8000

Genetica: trasmissione autosomica dominante a penetranza incompleta. penetranza incompleta. Espansioni

trasmesse per via materna.via materna.

Gene responsabile: l’espansione riguarda la tripletta CTGCTG e si trova nella regione 3’UTR

del gene DMPK DMPK che mappa sul cromosoma 19 e codifica per la proteina miotonina-

protein-chinasi (MT-PK):

alleli normali: 5-35 repeats

alleli premutati: 36-49 repeats

classe E1: 50-150 repeats

classe E2: 150-1000 repeats

classe E3: >1000 repeats

Distrofia muscolare miotonica di tipo 2 o PROMM

Caratteristiche: miopatia miotonica prossimale, indistinguibile a livello clinico dalla

DMM Tipo 1. Non è mai presente una forma congenita. Clinicamente più lieve.

Frequenza: 1/50.000 circa

Genetica: trasmissione autosomica dominante

Gene responsabile: la patologia è determinata da un’espansione di un tetranucleotide

CCTGCCTG, presente nel primo introne del gene ZNF9ZNF9, che mappa in posizione 3q21.3.

Espansioni trasmesse per via materna.via materna.

Alleli normali: 11-26 repeats

Alleli mutati: 75-11.000 repeats (media: 5.000 repeats)

Malattia da guadagno di funzioneguadagno di funzione

DMM1 e DMM2: patologie a RNA

I trascritti contenenti l’espansione formano degli aggregati resistenti alla

distruzione che rimangono intrappolati nel nucleo.

Questi aggregati interferiscono con altre proteine nucleari � guadagno di funzione

In particolare, gli aggregati (“foci”) di RNA sequestrano una classe di proteine

necessarie per un corretto assemblaggio dello spliceosoma

L’effetto finale è l’alterazione dello splicing di altri geni, con conseguente

alterazione funzionale di diversi pathways (effetto in trans).

DMM1 e DMM2 sono un esempio di ETEROGENEITÀ GENETICA,cioè mutazioni in geni differenti possono produrre lo stesso

fenotipo

Entrambe le patologie sono dotate di grandissimo mosaicismosomatico

Espansioni trasmesse per via maternavia materna

Corea di Huntington

Caratteristiche:•Malattia neurodegenerativa che porta alla demenza, caratterizzata da disturbi del

movimento (còrea, dal greco danza) e rigidità. Esordio tardivo e decorso progressivo.

Porta a morte in circa 15 anni.

Frequenza: circa 1/20.000

Genetica:• Espansione preferenziale nelle trasmissioni paternetrasmissioni paterne (favorita da eta’ paterna

avanzata)

Gene responsabile: gene IT15, (Interesting Transcript 15) sul braccio corto del

cromosoma 4, che codifica per la proteina huntingtinahuntingtina.. La mutazione è data

dall’espansione della tripletta CAG CAG nell’esone 1 �proteina con sequenza di glutamine in

eccesso

Fenotipo normale: 9 Fenotipo normale: 9 ��36 36 repeatsrepeatsAlleli normali: <26 CAG

Alleli intermedi: 27-35 CAG

Fenotipo malato: 37Fenotipo malato: 37��121 121 repeatsrepeatsAlleli mutati a penetranza incompleta: 36-39 CAG

Alleli mutati a penetranza completa: 40-121 CAG

Forma giovanile per espansioni > 60 CAG

La proteina mutata:La proteina mutata:• stabilisce interazioni anomale con altre proteine cellulariA

• ha un’alterata localizzazione prevalentemente nucleareB

• provoca tossicità cellulare

• è suscettibile al taglio proteolitico

WT mut

A B

Meccanismo patogenico

�Meccanismi di “guadagno di funzione”(dominante)

1) Tossicità da poliglutamineL’eccesso di glutamine nella sequenza aminoacidica

impedisce il giusto ripiegamento (folding) della proteina

stessa. La proteina viene degradata ma i frammenti con

le poliglutamine si aggregano. Si formano accumuli

all’interno dei nuclei dei neuroni con effetto citotossico.

2) Altri meccanismi:danno mitocondriale, alterazione della trascrizione di

altri geni, alterazione del trasporto assonale e

dell’omeostasi del calcio, alterato metabolismo degli RNA

�Meccanismi di “perdita di funzione”perdita della funzione anti-apoptotica con degenerazione

tissutale

Famiglia con malattia di Famiglia con malattia di HuntingtonHuntington (HD)(HD)

Analisi delle ripetizioni espanse Analisi delle ripetizioni espanse

Malattia di Huntington.Amplificazione di un frammento di gene contenente ripetuti (CAG) n

con la PCR e corsa su gel di polyacrylamide. Le bande sono rivelate

con colorazione argentica. La scala indica il numero di ripetizioni.

5) caso di insorgenza giovanile.

9) feto affetto (diagnosi prenatale).

Distrofia miotonica. Southern blot di DNA digerito con Eco

RI. Le bande di 9 o 10 kb sono varianti normali.

4) Il nonno ha una banda 10 Kb lievemente espansa (ha

catarratta ma non altri segni di DM).

1) Sua figlia ha una banda 10 Kb decisamente espansa con un

tipico esordio di DM in età adulta.

6) Il nipote ha una forte espansione ed è caratterizzato da

una forma molto severa e congenita.

Espansioni trasmesse per via paternaEspansioni trasmesse per via paterna Espansioni trasmesse per via maternaEspansioni trasmesse per via materna

Sia la Sindrome dell’X-fragile che la malattia di Huntington sono causate dall’espansione di una ripetizione di triplette.Gli individui con la sindrome dell’X-fragile hanno almeno 200 ripetizioni CGG all’estremità 5’ del gene FMR-1. Gli individui con la malattia di Huntington hanno almeno 36 ripetizioni CAG dentro la regione codificante del gene dell’huntingtina.

a) Come viene influenzata l’espressione del gene da queste espansioni di

triplette?

b) In base alla risposta (a) perché la mutazione del gene FRM-1 dell’X-

fragile è recessiva mentre quella dell’huntingtina nella Corea di

Huntington è dominante?

c) Perché il numero di ripetizioni di triplette necessario a determinare il

fenotipo è diverso per ciascuna malattia?

d) Perché la penetranza è incompleta nell’X-fragile?