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MUTAZIONI NEI GENI STRUTTURALI II: il connettivo

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Lezione 5

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FACIES:

Estrema fragilita’ delle ossaIpomineralizzazioneFraquenti fratture congeniteSclere bluastre o blu-grigio(l’OI e’ una patologia del

tessuto connettivo e, quindi puo’ coinvelgere tessuti diversi da quello osseo)(n.b la sclera e’ la parte non trasparente della tunica esterna dell’occhio)

Crescita anomala del cranio e tardiva chiusura della fontanella anteriore(dopo il primo anno di vita)

Sviluppo intellettivo normaleDentinogenesi imperfetta

AUTOSOMICA DOMINANTE

1/10.000 IN TUTTO IL MONDO1/10.000 IN TUTTO IL MONDO

Osteogenesi Imperfetta (OI)

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Fratture durante l’infanzia, meno frequenti dopo la puberta’. Statura normale , deformita’ minima. Sclere bluastre, denti normali. A volte perdita dell’udito

I

Gravi deformita’ e fratture ossee congenite. Di solito letale in eta’ perinatale per insufficienza respiratoria

II

Fratture congenite con progressivo rallentamento della crescita. Denti anormali, sclere bluastre, possibile perdita dell’udito

III

Fragilita’ delle ossa lieve o moderata, denti anormali, sclere normali o grigiastre, possibile perdita dell’udito

IV

Classificazione clinica

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AUTOSOMICA DOMINANTE

Genotipo

Fenotipo

a a a A A A

omozigote omozigoteeterozigote

Non affetto AFFETTI

Genetica dell’OI

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VISTI GLI ASPETTI FENOTIPICI DEVE DIPENDERE DA UN DIFETTO DELLA STRUTTURA DEL TESSUTO CONNETTIVO

IL COLLAGENEIL COLLAGENE E’ LA PROTEINA PIU’ ABBONDANTE DEL TESSUTO

CONNETTIVO

OTTIMO CANDIDATO

Basi biochimiche dell’OI

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Esistono tipi diversi di collagene nei vari tessuti. Essi si differenziano per lunghezza, sequenza dei diversi domini, per composizione e dimensione dei peptidi C e N terminali e per proprieta’ fisiche.

Il collagene di Tipo I e’ piu’ abbondante in pelle, tendini, ossa e arterie. Questi sono anche i tessuti maggiomente interessati dalla OI

N-term Dominio a tripla elica C-term

Il collagene

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Sintesi del collagene

cfr.testo

By NA C OI C OI

PELLET CELLULARE MEZZO DI COLTURA

COLTURA IN PRESENZA DI 3H-PROLINA

ISOLAMENTO DELLE PROTEINE

SDS-PAGE

PRO1(III)

PRO1(I)

PRO2(I)

Le proteine sono state tagliate e separate per elettroforesi evidenziando che un frammento del pro(I) migrava in maniera anomala

C’era una delezione nella proteina

DIVERSA MIGRAZIONE DIVERSA PROTEINA

Prove del coinvolgimento del collagene nell’OI

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1979 YAMAMOTO E CO.isolarono il cDNA del COA1

mRNA del collagene e’ stato estratto dal tessuto osseo di embrioni di pollo e frazionati in base alle dimensioni per centrifugazione su gradiente di saccarosio.Le diverse frazioni sono state saggiate per la capacita’ di codificare il procollagene in un sistema acellulare per traduzione.Dalle frazioni capaci di codificare il procollagene e’ stato costruito il cDNA.Clonaggio del cDNA nel plasmide pBR322 e successiva trasformazione batterica in E.Coli Trasferimento delle colonie su filtro e ibridazione con il cDNA marcato radiattivamente.Isolamento colonie positive.Verifica con saggio di legame al filtro:

Denaturazione del DNA del clone positivo.Legame a colonna.Caricamento della colonna con RNA estratto da ossa di

pollo.Allontanamento dell’RNA non legato ed Eluizione

dell’RNA legato.Test per la produzione di COA1 mediante traduzione in

vitro.

Clonaggio del gene di OI1

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OGNI CATENA DEL COLLAGENE E’ CODIFICATA DA UN GENE DISTINTO. QUESTI GENI PRESENTANO OMOLOGIA DI SEQUENZA ELEVATA.

TRAMITE SCREENING DI LIBRARY GENOMICHE E’ STATO POSSIBILE ISOLARE DIVERSI GENI PER IL COLLAGENE.

ESISTONO DIVERSE CLASSI DI COLLAGENE:COLLAGENI FIBRILLARI(DI TIPO I II III V E XI)COLLAGENI NON FIBRILLARI(i domini a tripla elica

sono interrotti da domini non a tripla elica) COLLAGENI A CATENA BREVE (TIPO VII)

I GENI PER IL COLLAGENE FANNO PARTE DI UNA FAMIGLIA GENICA (insieme di geni con un elevato grado di omologia di sequenza e codificanti per prodotti con funzione simile o correlata. Possono contenere elemeni non funzionanti detti PSEUDOGENI)

I tipi di collagene

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Tali geni si sarebbero originati in seguito a fenomeni di DUPLICAZIONE di un unico gene ancestrale e successiva diversificazione per effetto di mutazioni nelle diverse copie.

geneA

mutazione

diversificazione

duplicazioni duplicazioni

FAMIGLIA GENICA1es.collagene fribrillare

FAMIGLIA GENICA2es.collagene a catena breve

Origine della famiglia del collagene

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TECNICHE COME COSTRUZIONE DI IBRIDI SOMATICI E IBRIDAZIONE IN SITU HANNO PERMESSO DI MAPPARE QUESTI GENI.

SEBBENE DERIVINO DA UN GENE ANCESTRALE COMUNE I GENI PER IL COLLAGENE SONO DISPERSI NEL GENOMA, MAPPANO CIOE’ SU CROMOSOMI DIVERSI:es. il gene per la catena 1(I)(COA1) e’ localizzato sul chr17, mentre esistono geni per altre catene del collagene sui cromosomi 2, 7, 12 etc.

E’ VERAMENTE UNA MUTAZIONE IN UNO DI QUESTI GENI A PROVOCARE L’OI????

Mappatura dei geni del collagene

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L’identificazione di mutazioni nel gene del collagene in casi di OI ha richiesto complesse analisi di linkage tramite polimorfismi di lunghezza dei frammenti di restrizione(RFLP)

RFLP: Variazione della sequenza nucleotidica che interessa il sito di riconoscimento di un enzima di restrizione

A1 A2 A3B1 B2

A1 A3B1 B2mutazioneelimina il sitodi restrizione

endonucleasi Bendonucleasi A

EnzimaA

EnzimaB

Pattern di ibridazione sufiltro

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Studi di linkageIl cDNA di COL1A2 venne testato nella popolazione generale (normale) per individuare la presenza diRFLP

EcoR1

GEL filtro ibridato con cDNA

A1 A2

cDNA COL1A2

14Kb

A1 A2A33.5Kb 10.5Kb

cDNA COL1A2

Se si digerisce il DNA genomico di individui normali che non mostrano la OI presi a caso nella popolazione e si ibrida con il cDNA di COL12A si nota che la regione omologa al cDNA e’ polimorfica: cioe’ nel DNA puo’ essere presente o meno un sito di restrizione. Questo si nota nella popolazione normale.

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A1 A214Kb

A1 A2A33.5Kb 10.5Kb

Omozigoti per allele 14:14/14

A1 A2

A1 A214Kb

14Kb

A1 A2

A1 A2A3

3.5Kb 10.5Kb

3.5Kb 10.5KbOmozigoti per allele 10.5,3.5:10.5,3.5/10.5,3.5

In questo gruppo di individui il cDNA riconosce nel genoma dopo digestione 2 frammenti di = lunghezzae’: 14 kb perche’ su entrambi i cromosomi in quella regione non e’ presente un altro sito QUINDI UNA SOLA BANDA

In questo gruppo di individui il cDNA riconosce nel genoma dopo digestione 4 frammenti 2 da 10.5 e 2 da3.5 kb perche’ su entrambi i cromosomi in quella regione e’ presente un altro sito che cade all’interno della regione identificata dal cDNA. QUINDI 2 BANDE

Eterozigoti per alleli 14 e10.5,3.5 14/10.5,3.5

In questo gruppo di individui il cDNA riconosce nel genoma dopo digestione 3 frammenti : 1 da 10.5 e 1 da3.5 kb originati dalla digestione di un cromosoma (perche’e’ presente un altro sito che cade all’interno della regione identificata dal cDNA) e 1 frammento da 14 originato dalla digestione dell’ altro cromosoma. QUINDI 3 BANDE

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1 2

1 2 3 4 5 6

1 2 3 4 5 6

1 2 3 4

-/- -/+

-/- -/+ -/- -/- -/+ -/-

-/- -/- -/+ -/+ -/+ -/+

-/- -/- +/+ -/+

I

II

III

IV

Il polimorfismo non rappresenta la causa dell’OI, ma e’ inprobabile che tale variazione segreghi con il fenotipo OI per caso...

LA MUTAZIONE OI DEVE RISIEDERE INSIEME CON IL POLIMORFISMO, CIOE’ NEL GENE COL1A2

Famiglie OI1