Metabolismo do azoto dos aminoácidos e ciclo da ureia; Rui Fontes

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Metabolismo do azoto dos aminoácidos e ciclo da ureia

Índice

1- Aspetos gerais e enquadramento ..................................................................................................................1

2- A conversão de amónio (tóxico) em ureia (não tóxica) ocorre no fígado ....................................................1

3- A ação catalítica da sintétase do carbamil-fosfato I e a das outras enzimas do ciclo da ureia .....................2

4- A ureia contém dois átomos de azoto que têm origem direta no amónio e no aspartato ..............................3

5- Um dos átomos de azoto da ureia tem origem direta no amónio e indireta em todos os aminoácidos.........3

6- Um dos átomos de azoto da ureia tem origem direta no aspartato e indireta em todos os outros aminoácidos ..........................................................................................................................................................4

7- Energética do processo de síntese da ureia ...................................................................................................5

8- A regulação da atividade das enzimas do ciclo da ureia e da sintétase de carbamil-fosfato I pelo N-acetil-glutamato ..............................................................................................................................................................5

9- O catabolismo de uma mesma molécula de um aminoácido pode ocorrer em etapas que têm lugar em órgãos distintos .....................................................................................................................................................6

10- A alanina e a glutamina constituem, em conjunto, mais de metade dos aminoácidos libertados pelos músculos ...............................................................................................................................................................7

11- Uma parte do azoto dos aminoácidos é excretada na forma de amónio ...................................................7

12- As relações entre excreção de azoto, a ingestão proteica e o balanço azotado .........................................8

13- Efeitos dietéticos e patológicos na proteólise, no catabolismo dos aminoácidos, na produção de ureia e na eliminação de azoto .........................................................................................................................................9

14- A excreção de azoto quando há défice de um aminoácido essencial na dieta ..........................................9

15- O ciclo da ureia para além de permitir converter o amónio em ureia também participa na síntese da arginina ...............................................................................................................................................................10

1- Aspetos gerais e enquadramento

Embora os aminoácidos “nutricionalmente dispensáveis” possam, no que refere ao esqueleto carbonado, formar-se a partir da glicose, é uma boa aproximação à realidade afirmar-se que os aminoácidos existentes no sangue e nas células resultam da hidrólise das proteínas endógenas ou das proteínas da

dieta. De facto, se pensarmos apenas na porção azotada, mesmo os aminoácidos sintetizados endogenamente a partir da glicose têm origem nos aminoácidos formados nestes processos de hidrólise.

A maior parte das moléculas dos aminoácidos libertados aquando da hidrólise das proteínas endógenas são reutilizados na síntese dessas mesmas proteínas ou de outras proteínas, mas uma parte sofre

catabolismo perdendo o azoto e gerando intermediários não azotados que, em última análise (direta ou indiretamente), vão acabar por oxidar-se a CO2.

Num indivíduo em balanço azotado nulo a quantidade de azoto ingerido é igual ao que se perde na urina, nas fezes e através da pele, cabelo, unhas, etc. A maior parte do azoto perde-se na urina na forma de ureia e, em menor grau, na forma de amónio. Quase todo o azoto que se perde na forma de ureia e amónio corresponde a moléculas de aminoácidos que foram oxidadas a CO2.

2- A conversão de amónio (tóxico) em ureia (não tóxica) ocorre no fígado

Os aminoácidos ou os intermediários a que dão origem no decurso do seu catabolismo podem perder os grupos azotados em reações de desamidação ou desaminação em que se liberta o ião amónio.

A concentração plasmática do amónio é, num indivíduo saudável, muito baixa (cerca de 20 µM no sangue sistémico e cerca de 260 µM na veia porta)1. Quando a concentração de amónio aumenta no plasma

1 Para comparação: a concentração plasmática da glutamina é cerca de 600 μM, a dos aminoácidos em que a concentração plasmática é mais baixa (metionina e aspartato) ronda os 20 µM [Bergstrom et al. (1974) J Appl Physiol 36:693-7] e a de ureia 5 mM.

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(hiperamonémia) provoca alterações neurológicas cursam com confusão mental e que podem culminar em coma e morte.

No fígado, ou mais precisamente, nos hepatócitos periportais, o amónio tóxico é convertido em

ureia não tóxica. Uma situação clínica aguda que cursa com hiperamonémia é, por exemplo, uma hemorragia para dentro do lúmen do sistema digestivo em doentes com cirrose hepática. Nesta situação as proteínas do sangue acabam por gerar amónio por ação sequenciada das enzimas digestivas e das bactérias intestinais. Existem outras condições clínicas mais raras que também cursam com hiperamonémia: são exemplos as doenças causadas por défices congénitos das enzimas do ciclo da ureia ou da síntase do N-acetil-glutamato (ver, mais à frente, a Equação 27).

3- A ação catalítica da sintétase do carbamil-fosfato I e a das outras enzimas do ciclo da

ureia Numa reação catalisada pela sintétase do carbamil-fosfato I (uma enzima da matriz mitocondrial)

forma-se carbamil-fosfato (ver Equação 1). Na reação catalisada por esta sintétase consome-se amónio e CO2 que se ligam para formar o carbamilo [1C,1N] que é fosforilado pelo ATP; o processo também envolve a hidrólise de uma outra molécula de ATP. O carbamil-fosfato vai ser o dador de um dos dois azotos da

ureia [1C,2N] que se vai formar. Ver Fig. 1. Embora, em termos estritos, não se possa considerar que a sintétase do carbamil-fosfato I seja uma

enzima do ciclo da ureia, a relação da sintétase de carbamil-fosfato I com o ciclo da ureia é tão íntima que, na maioria dos livros de texto, é incluída nas enzimas deste ciclo.

Equação 1 NH4

+ + CO2 + 2 ATP + H2O → carbamil-fosfato + 2 ADP + Pi No ciclo da ureia intervém uma enzima que, tal como a sintétase de carbamil-fosfato I, está na

matriz mitocondrial, a transcarbamílase da ornitina (ver Equação 2); as outras três estão no citoplasma e são a sintétase do arginino-succinato, a argininosuccínase e a argínase (ver Equação 3, Equação 4 e Equação 5).

Equação 2 ornitina + carbamil-fosfato → citrulina + Pi Equação 3 citrulina + aspartato + ATP → arginino-succinato + AMP + PPi Equação 4 arginino-succinato → arginina + fumarato Equação 5 arginina + H2O → ureia + ornitina

Costuma dizer-se que a ornitina [5C,2N] desempenha, no ciclo da ureia, um papel catalítico porque

se consome na primeira reação (transcarbamílase da ornitina: ver Equação 2) e, via citrulina [6C,3N], arginino-succinato [10C,4N] e arginina [6C,4N], se regenera na última (argínase: ver Equação 5)2. É na reação catalisada pela argínase que se dá a hidrólise da arginina formando-se ureia e regenerando-se ornitina, um dos substratos da transcarbamílase da ornitina.

Ao longo do ciclo da ureia a estrutura da ornitina vai aceitando os componentes da ureia: como evidenciado pela reação de hidrólise catalisada pela argínase, a arginina [6C, 4N] pode ser entendida como sendo formada por dois resíduos: ornitina [5C,2N] e ureia [1C,2N]. Por ação catalítica da transcarbamílase da ornitina, a ornitina aceita o grupo carbamilo do carbamil-fosfato gerando citrulina que reage com o aspartato [4C,1N] gerando arginino-succinato (sintétase do arginino-succinato: ver Equação 3): a formação do arginino-succinato é um processo endergónico acoplado com a hidrólise de ATP a AMP + PPi. Por ação duma líase (argininosuccínase) o arginino-succinato desdobra-se em arginina e fumarato [4C] (ver Equação 4).

Como já referido, a transcarbamílase da ornitina é uma enzima da matriz mitocondrial enquanto que todas as outras três enzimas do ciclo são citoplasmáticas. Assim, o produto da transcarbamílase da ornitina, a citrulina, sai da mitocôndria, enquanto o substrato aminoacídico da mesma enzima, a ornitina, entra para a mitocôndria e os dois processos de transporte são catalisados pelo mesmo transportador que é um antiporter (ver Equação 6).

Equação 6 ornitina (citoplasma) + citrulina (mitocôndria) → ornitina (mitocôndria) + citrulina (citoplasma)

2 Na realidade, o mesmo se pode dizer a respeito de qualquer dos intermediários de um qualquer ciclo metabólico.

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4- A ureia contém dois átomos de azoto que têm origem direta no amónio e no aspartato O somatório das reações catalisadas pelas enzimas do ciclo da ureia e pela sintétase do carbamil-

fosfato I pode ser expresso pela seguinte equação soma:

Equação 7 CO2 + NH4+ + aspartato + 3 ATP + 2 H2O → ureia + 2 ADP + AMP + 2 Pi + PPi + fumarato

Os azotos e os carbonos da ureia [OC(NH2)2] têm, obviamente, origem direta na hidrólise da

arginina (ver Equação 5) mas, se pensarmos no ciclo da ureia na sua globalidade, também se pode dizer que o carbono tem origem no CO2, um dos átomos de azoto tem origem direta no amónio e o outro origem direta no aspartato [4C,1N] (cujo esqueleto carbonado origina fumarato [4C] durante o processo).

5- Um dos átomos de azoto da ureia tem origem direta no amónio e indireta em todos os

aminoácidos O amónio que está na origem do carbamil-fosfato hepático tem origem nos aminoácidos que

sofrem catabolismo libertando amónio ou na própria ureia que é hidrolisada no lúmen do tubo digestivo3. Uma parte considerável do amónio (talvez 1/3) utilizado para a síntese de carbamil-fosfato é

captado pelo fígado chegando aí, através da veia porta, já como amónio. Este amónio foi formado nos enterócitos a partir da glutamina (via ação da glutamínase que catalisa a hidrólise do grupo amida: ver Equação 8) e no lúmen do intestino por ação das bactérias (que formam amónio quer a partir de produtos azotados com origem na dieta e nas secreções, quer da ureia). É de notar que parte da ureia que circula no sangue passa para o lúmen do cólon onde é reconvertida em amónio pelas bactérias: existe assim um ciclo entero-hepático de azoto envolvendo a ureia e o amónio assim como as enzimas hepáticas do ciclo da ureia e a urease (Equação 9) das bactérias intestinais.

Os restantes 2/3 resultam da ação de enzimas hepáticas que provocam a perda de grupos azotados de aminoácidos na forma de amónio. Exemplos deste tipo de enzimas são a enzima de clivagem da glicina (ver Equação 10), a líase da cistationina (ver Equação 11), a desidrátase da serina (ver Equação 12), a histídase (ver Equação 13), a asparagínase (ver Equação 14), a glutamínase (ver Equação 8) e a desidrogénase do glutamato (ver Equação 15)4.

Equação 8 glutamina + H2O → glutamato + NH4

+

Equação 9 ureia + H2O → CO2 + 2 NH4+

Equação 10 glicina + H4-folato + NAD+ → N5,N10-metileno-H4-folato + NADH + CO2 + NH4+

Equação 11 cistationina → cisteína + α-cetobutirato + NH4+

Equação 12 serina (ou treonina) → piruvato (ou α-cetobutirato) + NH4+

Equação 13 histidina → urocanato + NH4+

Equação 14 asparagina + H2O → aspartato + NH4+

Equação 15 glutamato + NAD+ → α-cetoglutarato + NADH + NH4+

É de notar que a maior parte do azoto do amónio libertado pela ação da desidrogénase do

glutamato tem origem última em muitos outros aminoácidos. Nalguns casos, o processo envolve reações de transaminação (ver Equação 16) onde o grupo α-

amina dos aminoácidos é diretamente transferido para o α-cetoglutarato formando o glutamato (casos, por exemplo, da alanina, da serina, da tirosina, do aspartato e dos aminoácidos ramificados) enquanto noutros a reação de transaminação envolve intermediários da via catabólica que ainda contêm o grupo α-amino do aminoácido que lhes deu origem (casos, por exemplo, da fenilalanina, cisteína, triptofano e lisina)5. É de

3 O amónio que se forma nas células também pode ter origem na desaminação do AMP (adenilato), da adenosina, da guanina, do CMP (citidilato), da citidina e da citosina assim como pode resultar da rotura do anel das bases pirimídicas no seu catabolismo. No entanto é frequentemente ignorar-se esta origem do amónio porque estes processos são quantitativamente muito pouco relevantes e porque o azoto libertado nestes processos incorpora-se nos referidos nucleotídeos, nucleosídeos e bases aquando da sua síntese tendo origem em aminoácidos. 4 Embora não haja D-aminoácidos nas proteínas, alguns destes enantiómeros existem em polipeptídeos das bactérias incluindo as que povoam o lúmen do cólon. A hidrólise destes polipeptídeos origina aminoácidos D que, no fígado, sofrem a ação de uma enzima (designada de oxídase dos aminoácidos D) que tem como grupo prostético o FAD e que catalisa a seguinte reação: D-aminoácido + O2 → α-cetoácido + H2O2 + NH4

+. O H2O2 formado é depois captado para os peroxissomas onde sofre a ação da catálase: 2 H2O2 → H2O + O2. 5 Embora as transamínases estejam classificadas pela Comissão de Enzimas da União Internacional de Bioquímica na classe das transférases, as reações de transaminação são de facto reações redox. O carbono 2 do α-cetoglutarato e todos os outros

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notar que a ação sequenciada das transamínases referidas e da desidrogénase do glutamato (ver Equação 15) permite compreender que o grupo azotado dos aminoácidos que perdem o grupo amina para o α-cetoglutarato possa aparecer como amónio. Estas sequências de dois passos costumam designar-se por processos de transdesaminação (transaminação seguida de desaminação oxidativa do glutamato) [1] e a equação soma correspondente a estes processos é a Equação 17.

Equação 16 α-aminoácido + α-cetoglutarato → α-cetoácido correspondente + glutamato Equação 17 α-aminoácido + NAD+ → α-cetoácido correspondente + NADH + NH4

+ É de sublinhar que a Equação 17 evidencia que, quando um determinado aminoácido sofre

transdesaminação, para além de perder o seu grupo amina na forma de amónio também há, concomitantemente, formação de NADH que, ao ser oxidado na cadeia respiratória, origina ATP.

Nos casos da glutamina (via glutamínase; ver Equação 8), da histidina (via urocanato →

formimino-glutamato → glutamato), da prolina (via semialdeído do glutamato → glutamato) e da arginina (via ornitina → semialdeído do glutamato → glutamato), o produto formado nas respetivas vias catabólicas específicas é o glutamato.

6- Um dos átomos de azoto da ureia tem origem direta no aspartato e indireta em todos os

outros aminoácidos O “segundo azoto” presente na estrutura da ureia tem origem direta no aspartato: o aspartato

[4C,1N] ao reagir com a citrulina e ao sair como fumarato [4C] deixa ficar azoto no grupo guanidina da arginina que vai sofrer hidrólise e gerar a ureia.

No entanto, este “segundo” azoto pode, indiretamente, ter origem em todos os aminoácidos. A alanina (que é vertida no sangue pelos músculos ou pelos enterócitos e é captada pelo fígado) é

exemplo de um aminoácido dador de amina para a síntese de aspartato no fígado. Por ação sequenciada da transamínase da alanina (ver Equação 18) e da transamínase do aspartato (ver Equação 19), o grupo amina que estava na alanina pode originar o grupo amina do aspartato; a sequência envolve como intermediário aminado o glutamato. Sequências similares envolvendo diversas transamínases e a transamínase do aspartato podem explicar a transferência de grupos amina de diversos aminoácidos para o oxalacetato e a formação de aspartato; a equação soma que descreve estes processos é a Equação 21 (ver abaixo).

Equação 18 alanina + α-cetoglutarato ↔ piruvato + glutamato Equação 19 glutamato + oxalacetato ↔ α-cetoglutarato + aspartato

Quando a perda de azoto origina amónio quer diretamente (casos da desamidação hidrolítica da

glutamina, da ureia e da asparagina ou as desaminações oxidativas da glicina ou do glutamato, a desaminação por ação de líases de diversos aminoácidos; ver equações 8-15), quer indiretamente (via transdesaminação; ver Equação 17), este ião inorgânico também pode incorporar-se no oxalacetato originando aspartato e, desta maneira, contribuir para formar “o segundo azoto” da ureia.

Por ação da desidrogénase do glutamato (ver Equação 20) a operar em direção inversa à que foi referida na Equação 156, o amónio pode originar o grupo amina do glutamato e o glutamato (formado por aminação do α-cetoglutarato) pode, por transaminação, ser dador de amina ao oxalacetato para formar aspartato (ver Equação 19). Tal como nos processos de transdesaminação também aqui está envolvida a desidrogénase do glutamato mas, neste caso, a transamínase pertinente é a transamínase do aspartato. Ao contrário do que acontece nos processos de transdesaminação aqui, em vez de se formar amónio, é este ião inorgânico que é incorporado em compostos orgânicos, no primeiro passo sintetizando-se glutamato (ver Equação 20) e, no segundo, o aspartato (Equação 19).

α-cetoácidos tem número de oxidação +2 enquanto nos aminoácidos correspondentes o número de oxidação do carbono 2 é 0. Quando um aminoácido X é oxidado ao respetivo α-cetoácido X, o oxidante é o α-cetoglutarato que, obviamente se reduz a glutamato. No sentido inverso é o glutamato que funciona como redutor do α-cetoácido X: consistentemente, o α-cetoácido X reduz-se ao respetivo α-aminoácido X enquanto o glutamato se oxida a α-cetoglutarato. 6 Embora não esteja definitivamente comprovado, é muitíssimo provável que, quando a desidrogénase do glutamato catalisa a síntese de glutamato a partir de α-cetoglutarato e amónio, o agente redutor seja o NADPH (ver Equação 20) e que, quando catalisa a desaminação oxidativa do glutamato, o agente oxidante seja o NAD+ (ver Equação 15).

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Equação 20 α-cetoglutarato + NH4+ + NADPH → glutamato + NADP+ + H2O

Assim, via α-cetoglutarato/glutamato todos os aminoácidos podem contribuir para o azoto

que vai ser cedido diretamente pelo aspartato na síntese da ureia.

7- Energética do processo de síntese da ureia A equação soma relativa ao processo de síntese de ureia mostra que, na síntese de uma molécula

de ureia, se gastam 4 ligações ricas em energia do ATP: duas moléculas de ATP convertem-se em ADP e uma em AMP (ver Equação 7)7.

No entanto também é possível defender um outro ponto de vista. O oxalacetato é aceitador de grupos amina em reações de transaminação em que se forma o aspartato (Equação 21). Na conversão do fumarato (formado no ciclo da ureia) a oxalacetato participam a fumárase e a desidrogénase do malato e a equação soma correspondente a esta conversão é a Equação 22. A Equação 26 (que é a soma das equações 7 e 21-25) mostra que, tendo em conta os ATPs que se podem formar como consequência da oxidação do fumarato (via fumárase, desidrogénase do malato, cadeia respiratória e síntase do ATP; ver Equação 22 e Equação 23), também se pode pensar que o número de ligações ricas em energia gastas na síntese de uma molécula de ureia é de apenas 1,5 ATPs.

Equação 21 oxalacetato + α-aminoácido → aspartato + α-cetoácido Equação 22 fumarato + NAD+ + H2O → oxalacetato + NADH Equação 23 NADH + ½ O2 + 2,5 ADP + 2,5 Pi → NAD+ + 2,5 ATP + 3,5 H2O Equação 24 AMP + ATP → 2 ADP Equação 25 PPi + H2O → 2 Pi Equação 26 CO2 + NH4

+ + 1,5 ATP + α-aminoácido + ½ H2O + ½ O2 → ureia + 1,5 ADP + 1,5 Pi + α-cetoácido

No ciclo da ureia gastam-se 4 ligações ricas em energia do ATP mas, porque a reconversão do

fumarato em aspartato permite a formação de 2,5 ATPs (admitindo relação P:O de 2,5 para o NADH), o gasto líquido é de apenas 1,5 ATPs. De qualquer forma, independentemente dos diferentes pontos de vista, pode sempre dizer-se que a síntese de ureia a partir de amónio e aspartato é um processo endergónico.

8- A regulação da atividade das enzimas do ciclo da ureia e da sintétase de carbamil-

fosfato I pelo N-acetil-glutamato A conversão dos “esqueletos carbonados” dos aminoácidos em glicose ou a sua oxidação direta a

CO2 (maioritariamente via acetil-CoA) é acompanhada da libertação de amónio e o destino último do amónio é converter-se em ureia. As condições que levam ao aumento do catabolismo dos aminoácidos também levam ao aumento da síntese de ureia.

No período pós-prandial de uma refeição que continha proteínas há aumento da concentração de aminoácidos no plasma (e, presume-se, no interior das células), mas também há aumento do catabolismo dos aminoácidos e da formação de ureia. Durante o período pós-prandial, à formação de ureia que resultava do catabolismo dos aminoácidos libertados na proteólise endógena soma-se a produção de ureia que resulta da fração dos aminoácidos da dieta que são oxidados neste período [2]. Em parte, este aumento da atividade das enzimas do ciclo da ureia pode dever-se ao aumento da concentração de substratos, nomeadamente o aumento da concentração de amónio no interior das mitocôndrias hepáticas [1]. No caso da sintétase de carbamil-fosfato I, a atividade depende estritamente da presença de um ativador alostérico: o N-acetil-

glutamato. A enzima responsável pela síntese deste composto denomina-se síntase do N-acetil-glutamato (ver Equação 27) e é ativada alostericamente pela arginina [3].

Equação 27 acetil-CoA + glutamato → N-acetil-glutamato + CoA

Quando a dieta é rica em proteínas durante um período alargado de tempo, a concentração de todas

as enzimas do ciclo da ureia, incluindo nestas a síntase do N-acetil-glutamato, aumenta porque a sua síntese fica estimulada [1]. Por isso, quando se administra uma refeição teste (contendo, por exemplo, uma determinada quantidade de leite de soja) após uma semana em que a dieta foi hiperproteica, a concentração

7 Embora se gastem diretamente apenas 3 moléculas de ATP, o facto de uma delas (a que se gasta aquando da ação da sintétase de arginino-succinato) originar AMP (+ PPi, que se hidrolisa a 2 Pi) explica se gastem 4 ligações ricas em energia.

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de aminoácidos no plasma mantém-se alta durante um período mais curto de tempo e a síntese de ureia é acelerada8. Se a dieta foi normoproteica durante a semana que antecedeu a refeição teste, o aumento de concentração de aminoácidos no plasma provocado pela mesma refeição prolonga-se durante algumas horas e a velocidade de síntese de ureia é menor [2].

9- O catabolismo de uma mesma molécula de um aminoácido pode ocorrer em etapas que

têm lugar em órgãos distintos A maioria dos aminoácidos é degradada no fígado, mas uma parte importante do catabolismo

dos aminoácidos ocorre no músculo e nos enterócitos. É de notar que o catabolismo de uma determinada molécula de um determinado aminoácido até

CO2 e ureia pode ser feito por etapas envolvendo vários órgãos. Um bom exemplo é o caso da glutamina que (em parte) é convertida, nos enterócitos, em amónio

e alanina que passam para o sangue da veia porta e são captados no fígado. Esta conversão pode ocorrer via glutamina → glutamato → α-cetoglutarato → succinil-CoA → succinato → fumarato → malato → oxalacetato → fosfoenolpiruvato → piruvato → alanina. O processo designa-se por glutaminólise, corresponde a uma oxidação parcial da glutamina (ver Fig. 2) e equação soma relativa à conversão da glutamina em amónio, alanina e CO2 é a Equação 289.

Equação 28 glutamina (C5H10O3N2) + 1,5 O2 + 7,5 ADP + 7,5 Pi → alanina (C3NH7O2) + 2 CO2 + 7,5 ATP + 7,5 H2O + NH4

+ A conversão de glutamina em alanina pode ser entendida pensando que os 5 carbonos da glutamina

dão origem aos 3 carbonos do piruvato e a duas moléculas de CO2 através da ação sequenciada da glutamínase (ver Equação 8; é nesta reação que se forma o amónio), da transamínase da alanina (ver Equação 18), de enzimas do ciclo de Krebs que convertem o α-cetoglutarato em oxalacetato, da carboxicínase do fosfoenolpiruvato e da cínase do piruvato. O grupo amina da alanina provém de uma molécula de glutamato que, na reação de transaminação acima referida, cede o grupo azotado ao piruvato (ver Equação 18).

A alanina formada nos enterócitos (ver Equação 28) é vertida na veia porta e é captada pelo fígado podendo, aqui, ser diretamente oxidada, via alanina → piruvato → acetil-CoA e oxidação do resíduo acetato do acetil-CoA no ciclo de Krebs e na cadeia respiratória; ver Equação 2910.

Equação 29 alanina (C3NH7O2) + 3 O2 + 11,75 ADP + 11,75 Pi → ½ ureia [½ CO(NH2)2] + 2,5 CO2 + 11,75 ATP + 14,25 H2O

Ou seja a alanina, ao chegar ao fígado, devolve o grupo amina ao α-cetoglutarato convertendo-se

em piruvato que é, nas mitocôndrias, oxidado por ação da desidrogénase do piruvato e das enzimas do ciclo de Krebs (ver Fig. 3 e Fig. 4). Uma outra possibilidade é a alanina que é captada pelo fígado ser convertida em glicose (gliconeogénese) e, esta glicose acabar por ser oxidada a CO2 numa qualquer célula do organismo que tenha mitocôndrias (a exceção mais óbvia são os eritrócitos). O NH4

+ formado nos

8 É de notar que o aumento da síntese de ureia num período curto de tempo não se reflete obrigatoriamente num aumento da excreção urinária de ureia. Existem muitos fatores que, no nefrónio, influenciam a velocidade de excreção de ureia e a concentração de ureia no plasma é apenas um desses fatores. Um outro é o grau de hidratação que aumenta a excreção de ureia. 9 Esta Equação já inclui a formação de ATP resultante da oxidação do FADH2 (formado na conversão succinato → fumarato) e do NADH (formado nas conversões α-cetoglutarato → succinil-CoA e malato → oxalacetato), assim como a fosforilação a nível do substrato que é concomitante com a conversão fosfoenolpiruvato → piruvato. O GTP formado aquando da conversão succinil-CoA → succinato (ação da sintétase do succinil-CoA) é consumido aquando da conversão oxalacetato → fosfoenolpiruvato (carboxicínase do fosfoenolpiruvato). 10 Como consequência da oxidação da molécula da alanina (que resultou da oxidação parcial de uma molécula de glutamina no enterócito) podem formar-se no hepatócito 12,5 ATPs (2,5 em resultado da oxidação do NADH formado na ação da desidrogénase do piruvato e 10 na oxidação do resíduo de acetato do acetil-CoA no ciclo de Krebs). No entanto, como já referido, a síntese de ureia é um processo endergónico que, consumindo diretamente 4 ligações ricas em energia do ATP, também permite a formação de uma molécula de NADH por molécula de ureia formada se contabilizarmos a regeneração do aspartato a partir de fumarato. Ou seja, se incluirmos, o gasto líquido de 0,75 ATPs na formação de ½ molécula de ureia, o balanço global do número de ATPs formados na conversão de alanina em CO2 e em meia molécula de ureia (a ureia tem dois azotos e a alanina só tem um) é de 11,75 ATPs.

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enterócitos a partir da glutamina [5C,2N] e o azoto da alanina [3C,1N] são, no fígado, convertidos em ureia [1C,2N].

Ignorando a síntese de ATP e a redução/oxidação do NAD+/NADH e do FAD/FADH2, a equação soma que descreve a oxidação da glutamina e a conversão dos seus 2 azotos nos dois azotos de uma molécula de ureia é, independentemente dos passos intermédios e dos órgãos intervenientes, a Equação 30. Aceitando que as concentrações de glicose, alanina, intermediários do metabolismo, ATP, ADP, Pi, NADH, NAD+, FAD e FADH2 são estacionárias, a Equação 30 é a que descreve o processo global de oxidação da glutamina no organismo entendido como um todo. (De facto, como veremos adiante, os azotos da glutamina também podem ser excretados na urina na forma de amónio e, neste caso, a equação que descreve a oxidação da glutamina no organismo entendido como um todo, é a Equação 31.)

Equação 30 glutamina (C5H10O3N2) + 4,5 O2 → 4 CO2 + 3 H2O + ureia [CO(NH2)2] Equação 31 glutamina (C5H10O3N2) + 4,5 O2 + 2 H+ → 2 NH4

+ + 5 CO2 + 2 H2O

10- A alanina e a glutamina constituem, em conjunto, mais de metade dos aminoácidos

libertados pelos músculos As transamínases dos α-aminoácidos ramificados (ver Equação 32) são muito mais ativas nos

músculos que noutros órgãos e, por isso, os músculos são um importante local de captação (e degradação) dos aminoácidos ramificados (valina, leucina e isoleucina) [4]. No processo de degradação destes aminoácidos, os seus grupos amina podem acabar como azoto da alanina ou da glutamina. Embora constituam apenas 10% dos aminoácidos das proteínas musculares, a alanina e a glutamina constituem, em conjunto, mais de metade dos aminoácidos libertados pelos músculos e contêm mais de 1/3 do azoto aminoacídico plasmático.

Equação 32 aminoácido ramificado + α-cetoglutarato ↔

α-cetoácido ramificado correspondente + glutamato (1) A alanina é uma forma de transporte de azoto e de carbonos do músculo para o fígado sendo

este transporte um dos passos do ciclo da alanina. A alanina libertada pelo músculo resulta maioritariamente de reações de transaminação em que intervém o piruvato formado na glicólise muscular; esta alanina é captada pelo fígado servindo o azoto para a síntese de ureia e o esqueleto carbonado para a síntese de glicose que, libertada pelo fígado, pode ser usada pelo músculo levando à formação de piruvato que, por transaminação regenera a alanina (ciclo da alanina).

Porque o grupo amina da alanina foi cedido pelo glutamato (ver Equação 18) e este grupo amina pode ter tido origem noutros aminoácidos (quer através de outras reações de transaminação (ver Equação 16 e Equação 32), quer através da desidrogénase do glutamato (ver Equação 20) compreende-se que, o transporte de alanina do músculo para o fígado represente o transporte de grupos azotados de variados aminoácidos (que perderam estes grupos no músculos) para o fígado.

(2) Embora algumas das moléculas da glutamina libertada pelos músculos possa ter origem na proteólise que ocorre dentro das fibras, a maior parte resulta da conversão de outros aminoácidos. Embora não seja consensual [5], admite-se que o esqueleto carbonado de algumas das moléculas da glutamina libertada pelo músculo tenha origem na valina e na isoleucina. No seu catabolismo estes dois aminoácidos geram succinil-CoA; no ciclo de Krebs o succinil-CoA pode formar α-cetoglutarato que, aceitando um grupo amina em reações de transaminação, gera glutamato e, via sintétase da glutamina (ver Equação 33), glutamina. Na origem dos grupos azotados da glutamina estariam quer os aminoácidos ramificados (que podem ceder o grupo amina para formar o grupo α-amina da glutamina), quer outros aminoácidos que possam sofrer desaminação no músculo e ceder o NH4

+ (que é substrato da sintétase da glutamina) para formar o grupo 5-amida da glutamina. A glutamina, libertada pelo músculo, pode ser, direta ou indiretamente (via alanina e amónio formados nos enterócitos a partir da glutamina), captada pelo fígado onde os carbonos podem gerar glicose (e/ou CO2) e os azotos ureia.

Equação 33 glutamato + NH4

+ + ATP → glutamina + ADP + Pi

11- Uma parte do azoto dos aminoácidos é excretada na forma de amónio Para além da ureia, um importante composto azotado da urina é o ião amónio (NH4

+). Normalmente o amónio excretado na urina é uma pequena fração do azoto eliminado para o meio exterior (menos de 5%), mas em situações de acidose o valor desta fração aumenta marcadamente [6].

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A maior parte do amónio excretado na urina forma-se nas células tubulares renais por ação da glutamínase (ver Equação 8) e da desidrogénase do glutamato (ver Equação 15): o rim capta glutamina do plasma (com origem no músculo e, em situações de acidose, também no fígado) e usa os seus azotos para formar o amónio que excreta na urina.

O valor do pKa do ião amónio é de cerca de 9,3 encontrando-se por isso maioritariamente na forma protonada em pHs fisiológicos (ver Equação 34)11. O ião amónio formado é segregado para o lúmen do nefrónio representando uma forma de excreção de protões. Em situações de acidose como, por exemplo, quando há síntese aumentada de corpos cetónicos num jejum que dura há vários dias ou na cetoacidose do diabético, a quantidade de azoto que é excretada na forma de amónio pode aproximar-se da que é excretada na forma de ureia [6].

Equação 34 NH4

+ ↔ NH3 + H+ A síntese e a secreção de amónio pelo rim têm um papel homeostático na regulação do pH do

meio interno. Para se compreender esta última afirmação é útil escrever a equação que descreve o somatório dos processos que levam à oxidação completa da glutamina com geração de amónio de forma a pôr em evidência que se gastam protões durante o processo (ver Equação 31)12. A excreção de NH4

+ na urina é, em última análise, uma forma de excretar protões ligados (tamponados) ao amoníaco (ver Equação 34). De notar que a oxidação da glutamina com geração de ureia não tem as mesmas consequências no que se refere ao consumo de protões (ver Equação 30).

12- As relações entre excreção de azoto, a ingestão proteica e o balanço azotado

Para além da ureia e do amónio urinários existem outras formas de eliminar o azoto que foi obtido através da ingestão de proteínas. Essas outras formas são a eliminação urinária de creatinina (formada a partir da creatina que, por sua vez se formou a partir da arginina, da glicina e da metionina) e de ácido

úrico (formado com azoto das purinas que por sua vez veio da glicina, do aspartato e da glutamina) e a eliminação de proteínas inteiras e outros produtos azotados na pele, suor e secreções genitais e nasais. Ao contrário do que acontece com a ureia e o amónio, estas perdas são pouco dependentes da massa de proteínas ingeridas.

Num adulto com 70 kg de peso e com uma dieta equilibrada do ponto de vista calórico, mesmo na ausência de ingestão de proteínas, um mínimo de cerca de 25 g de aminoácidos são diariamente perdidos (“perdas obrigatórias de aminoácidos”). Porque o catabolismo dos aminoácidos fica acelerado quando se ingerem proteínas, para manter balanço azotado nulo, há que ingerir mais aminoácidos do que aqueles que são obrigatoriamente perdidos no contexto de uma dieta proteica nula. As estimativas atuais apontam para valores na ordem dos 0,66 g kg-1 dia-1 (46 g/dia num adulto de 70 kg) como correspondendo ao valor de ingestão proteica que supre as necessidades em 50% dos indivíduos adultos saudáveis [7]. No seu conjunto cerca de 16% da massa das proteínas é azoto e, se admitirmos balanço azotado nulo e uma ingestão de 50 g/dia de proteínas, a massa total de azoto perdida na urina, nas fezes, na pele, no suor e nas secreções nasais e genitais perfaz 8 g/dia (50 g/dia × 0,16 = 8 g/dia).

Um adulto saudável que não faz musculação, não está a recuperar de uma situação em que perdeu proteínas endógenas, nem está a engordar, está em equilíbrio azotado (tem um balanço azotado nulo) e em resposta a um aumento da ingestão de proteínas aumenta o catabolismo dos aminoácidos. A percentagem de azoto eliminado como ureia varia com a quantidade de proteínas ingeridas aumentando quando aumenta a quantidade de proteínas na dieta. Nas dietas “típicas” do ocidente cerca de 85% do azoto urinário é azoto ureico sendo o restante componente de diversos compostos azotados da urina (ácido úrico, creatinina, amónia, hipurato, fenil-acetil-glutamina, etc.). Assim, se admitirmos que à ingestão de 100 g/dia de proteínas (a ingestão média nos EUA) corresponde uma absorção de 90 g/dia e que 85% do azoto urinário é azoto ureico, a massa de azoto da ureia seria de cerca de 12 g/dia (90 g/dia × 0,85 × 0,16).

11 A forma que pode atravessar as membranas (difusão simples) é a forma desprotonada (amoníaco; NH3) que está em equilíbrio químico com o amónio (ver Equação 34). 12 De notar que a mesma equação também pode ser escrita de forma a pôr em destaque que se forma bicarbonato: glutamina (C5N2H10O3) + 4,5 O2 → 2 NH4

+ + 3 CO2 + 2 HCO3-.

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13- Efeitos dietéticos e patológicos na proteólise, no catabolismo dos aminoácidos, na

produção de ureia e na eliminação de azoto A velocidade com que o azoto dos aminoácidos é convertido em ureia depende da velocidade de

desaminação e oxidação dos aminoácidos (catabolismo dos aminoácidos) e da atividade das enzimas do ciclo da ureia.

Muitas das enzimas envolvidas no catabolismo dos aminoácidos têm valores de Km superiores às concentrações em que estes existem nas células, admitindo-se, por este motivo, que são sensíveis a variações na sua concentração [6]. Em todas as células do organismo, mas particularmente nos enterócitos e no fígado que recebem diretamente os aminoácidos libertados aquando da digestão intestinal, o aumento

da concentração intracelular de aminoácidos livres pode, no período pós-prandial, resultar da hidrólise das proteínas da dieta. De facto, a esmagadora maioria das moléculas dos aminoácidos glutamina, glutamato e aspartato que entram para os enterócitos a partir do lúmen são degradadas antes de entrar para o sangue [8]. Como já foi referido, a síntese de ureia aumenta quando, no período pós-prandial, aumenta o catabolismo dos aminoácidos da dieta. Nesta condição, o catabolismo dos aminoácidos e a síntese de ureia que resultam da hidrólise das proteínas da dieta somam-se ao catabolismo e à síntese de ureia que já ocorriam no período pós-absortivo (jejum matinal).

A velocidade de síntese de ureia é mínima quando a dieta não contém proteínas, mas contém glicídeos e é, em termos calóricos, capaz de colmatar a despesa energética. Comparativamente com esta situação, o catabolismo dos aminoácidos e a síntese de ureia é maior quando a ingestão de alimentos é nula (apenas água). Neste último caso, porque a insulina está baixa (a insulina tem uma ação anabólica nas proteínas musculares), a proteólise endógena está aumentada fornecendo aminoácidos como substratos da gliconeogénese. Por outro lado a descida da secreção de insulina e a subida da de glicagina estimulam a captação de aminoácidos pelo fígado, o seu catabolismo e a gliconeogénese.

Se o tempo de jejum se prolonga por vários dias, grande parte da despesa energética do cérebro passa a ser colmatada pelos corpos cetónicos. No entanto, mesmo nesta situação, pelo menos 1/3 da despesa energética do cérebro deriva da oxidação da glicose e a gliconeogénese é a via metabólica onde se forma a glicose que é consumida pelo cérebro. Embora esta adaptação ao jejum (síntese de corpos cetónicos) permita que a degradação das proteínas endógenas diminua à medida que o tempo de jejum total se prolonga, a síntese endógena de glicose está, no jejum total, maioritariamente dependente da degradação das proteínas endógenas e da conversão dos aminoácidos glicogénicos em glicose13. Acompanhando o aumento da síntese de corpos cetónicos, durante o jejum prolongado diminui a formação de T3 (hormona tiroideia) e esta diminuição provoca diminuição da degradação das proteínas endógenas [6]. No jejum prolongado que já se iniciou há uma semana a perda diária de azoto pode ser da ordem dos 8 g dia-1 (o que corresponde a uma perda de massa proteica endógena de 50 g dia-1). Este valor de eliminação de azoto é menor que o que corresponde à ingestão diária de 100 g de proteínas (16 g de azoto dia-1), mas é maior que o que corresponde a uma situação experimental em que a dieta é equilibrada do ponto de vista energético e não contém proteínas (“perda obrigatória de aminoácidos”; cerca de 4 g de azoto dia-1).

Muitas situações de doença cursam com balanço energético e azotado negativos que, em parte, são causados por aumento da despesa energética e da hidrólise das proteínas endógenas. No aumento desta hidrólise participam, como fatores estimuladores, o aumento da produção de citosinas inflamatórias e de cortisol assim como a diminuição da sensibilidade à insulina. Nestas condições há aumento da libertação de aminoácidos livres e aumento da sua oxidação com o aumento concomitante da produção (e da excreção) de ureia.

14- A excreção de azoto quando há défice de um aminoácido essencial na dieta

Um outro fator que pode influenciar a velocidade de oxidação e catabolismo dos aminoácidos é a composição aminoacídica da dieta. Se uma dieta é deficiente num aminoácido essencial, a síntese proteica está prejudicada e aumenta a concentração de aminoácidos livres. Existem aminoácidos que, em condições normais, seriam usados na síntese proteica e que, nestas circunstâncias, vão sofrer catabolismo. Uma dieta

deficiente num aminoácido essencial provoca aumento do catabolismo dos outros aminoácidos e balanço azotado negativo. Admitindo uma situação limite: quando a ingestão de um aminoácido essencial

13 A glicose formada no fígado pode ter origem na reciclagem da alanina e do lactato nos ciclos da alanina e do lactato mas o cérebro não “recicla” glicose: o metabolismo cerebral é aeróbio e a glicose é convertida a CO2. Assim, se pensarmos num tempo de jejum em que já se esgotou o glicogénio, a maior parte da glicose formada “de novo” durante o jejum total resulta da conversão dos aminoácidos libertados na hidrólise das proteínas endógenas. Uma parte menor (cerca de ¼) resulta da conversão hepática e renal do glicerol libertado aquando da hidrólise dos triacilgliceróis do tecido adiposo.

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é zero, a excreção de azoto equivale ao somatório do azoto das perdas obrigatórias de aminoácidos com o azoto ingerido.

15- O ciclo da ureia para além de permitir converter o amónio em ureia também participa

na síntese da arginina A arginina é um intermediário do ciclo da ureia, mas é também um dos aminoácidos constituintes

das proteínas e um precursor na síntese de creatina (e, consequentemente, de creatinina) e do NO (óxido nítrico). Assim, quando uma molécula de arginina, “abandona” o ciclo da ureia para ser usada nestes processos, é imprescindível a sua reposição. A arginina faz parte das proteínas da dieta mas também pode ser sintetizada endogenamente a partir de ornitina. Esta síntese ocorre via ação sequenciada da transcarbamílase da ornitina (ver Equação 2) e da sintétase e da líase do arginino-succinato (ver Equação 3 e Equação 4). Por sua vez a ornitina pode formar-se a partir do glutamato via ação de uma redútase que também consome ATP (ver Equação 35) e da transamínase da ornitina (ver Equação 36).

Equação 35 glutamato + NADPH + ATP → semialdeído do glutamato14 + NADP+ + ADP + Pi Equação 36 semialdeído do glutamato + glutamato ↔ ornitina + α-cetoglutarato

14 De facto, o produto direto da ação da redútase é um composto designado de pirrolina-5-carboxilato que numa reação não enzímica se converte no semialdeído do glutamato.

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Fig 1: Visão geral do metabolismo do azoto dos aminoácidos e ciclo da ureia.

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Fig. 2: Glutaminólise que ocorre nos enterócitos e que leva à conversão da glutamina [5C,2N] em amónio [1N], alanina [3C,1N] e 2 CO2 para a veia porta.

Fig. 3: Oxidação completa da alanina pressupondo que o azoto transferido para o α-cetoglutarato e que levou à formação de glutamato pode ter destinos que não especificamos (síntese de aminoácidos não essenciais, por exemplo).

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Fig. 4: Oxidação completa da alanina pressupondo que o glutamato formado por ação da transamínase da alanina sofre a ação da desidrogénase do glutamato (transdesaminação da alanina). 1. Newsholme, E. A. & Leech, T. (2010) Functional Biochemistry in Health and disease, Wiley-Blackwell, Oxford. 2. Morens, C., Bos, C., Pueyo, M. E., Benamouzig, R., Gausseres, N., Luengo, C., Tome, D. & Gaudichon, C. (2003) Increasing habitual protein intake accentuates differences in postprandial dietary nitrogen utilization between protein sources in humans, J Nutr. 133, 2733-40. 3. Caldovic, L., Ah Mew, N., Shi, D., Morizono, H., Yudkoff, M. & Tuchman, M. (2010) N-acetylglutamate synthase: structure, function and defects, Mol Genet Metab. 100 Suppl 1, S13-9. 4. Ooiwa, T., Goto, H., Tsukamoto, Y., Hayakawa, T., Sugiyama, S., Fujitsuka, N. & Shimomura, Y. (1995) Regulation of valine catabolism in canine tissues: tissue distributions of branched-chain aminotransferase and 2-oxo acid dehydrogenase complex, methacrylyl-CoA hydratase and 3-hydroxyisobutyryl-CoA hydrolase, Biochim Biophys Acta.

1243, 216-20. 5. Stipanuk, M. H. & Caudill, M. A. (2013) Biochemical, Physiological, Molecular Aspects of Human Nutrition, 3rd edn, Sunders, Elsevier., USA. 6. Frayn, K. N. (2012) Regulação Metabólica. Uma perspetiva focada no organismo humano., U.P. Editorial, Porto. 7. Rand, W. M., Pellett, P. L. & Young, V. R. (2003) Meta-analysis of nitrogen balance studies for estimating protein requirements in healthy adults, Am J Clin Nutr. 77, 109-27. 8. Wu, G. (1998) Intestinal mucosal amino acid catabolism, J Nutr. 128, 1249-52.