METODICHE PER LA PREPARAZIONE E SEPARAZIONE DELLE CELLULE DELLA RISPOSTA IMMUNITARIA DA SANGUE

PERIFERICO

IL SANGUE

COMPOSIZIONE:

ELEMENTI FIGURATI (ERITROCITI, LEUCOCITI, PIASTRINE)PLASMA

LEUCOCITI:-POLIMORFONUCLEATI (neutrofili (N), eosinofili (E), basofili(B)

-CELLULE MONUNUCLEATE (linfociti, monociti)

FORMULA LEUCOCITARIA:FORMULA LEUCOCITARIA:

N. 50-70%

E. 2-4%

B. 0,5-1%

LINF. 20-40%

MON. 3-8%

CELLULE MONONUCLEATE

POLIMORFONUCLEATI

LINFOCITI

La possibilità di isolare fisicamenteparticolari popolazioni di cellule o cellule singole di una

popolazione mista riveste spesso una grande importanza inbiologia cellulare.

human

mouse

rat

non human primate

other species

Cell separation products for your species of interest

         

T cell CD4+ T cellT cell subset

CD8+ B cell

granulocyte eosinophil basophil Tumour cell Mammary cell

Cell separation for cell of interest

NK monocyte progenitor dendritic cell mesenchymal

cell

Esistono numerose soluzione per la selezione di ogni tipo cellulare presente nel sangue periferico e non solo.

Ci sono metodiche che prevedono una selezione negativa e altre invece che prevedono una selezione positiva.

Inoltre si può utilizzare una separazione per gradiente di densità, o una separazione di tipo “immunomagnetico” , o una separazione detta“immunodensità” che utilizza un gradiente di densità in presenza di anticorpi.

- Positive and Negative Selection

- Magnetic and Density-Based Separation

Positive selection:

Desired cells are targeted for selection using a monoclonal antibody to a specific cell surface antigen.

Negative selection:

Unwanted cells are targeted for depletion using monoclonal antibodies to specific cell surface antigens.

Desired cells are not labeled with antibody.

Immunomagnetic selection:

Cells are labeled using monoclonal antibodies and magnetic particles.

Immunodensity separation:

Unwanted cells are targeted with monoclonal antibody-based reagents, and pellet when centrifuged over density medium.

Metodi per la separazione delle cellule

1) SEPARAZIONE DELLE CELLULE MONONUCLEATE DEL SANGUE MEDIANTE CENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI DENSITA’

ARNE BOYUM, NORWAY(1965)

FICOLL HYPAQUE 1077

MISCELA DI:

•DESTRANO AD ALTO PESO MOLECOLARE

•MEZZO DI CONTRASTO IODATO (SODIO METRIZOATO)

FICOLL HYPAQUE DENSITA’ 1.077DENSITA’ 1.077

DESTRANO AD ALTO PESO MOLECOLARE

PSEUDOAGGLUTINAZIONE DEGLI ERITROCITI PER MODIFICAZIONI DELLA CARICA ELETTRICA DI SUPERFICIE

SODIO METRIZOATO

CONSENTE DI OTTENERE SOLUZIONI AD ELEVATA DENSITA’

Durante la centrifugazione si hanno migrazioni differenziali dei vari elementi del sangue, dando luogo così alla formazione di varie fasi distinte contenenti tipi cellulari diversi.

•Lo strato più in basso nella provetta contiene eritrociti eritrociti aggregati dall’azione del destrano

• lo strato immediatamente sopra contiene granulocitigranulociti che alla pressione osmotica del Ficoll Hypaque raggiunge un gradiente di densità tale da attraversarlo e migrare sul fondo della provetta

•Ancora al di sopra troviamo i linfocitilinfociti posti all’interfase fra il plasma e il ficoll Hypaque , a causa della loro bassa densità non riescono a migrare attravrso la miscela, ma anche altre componenti del sangue a bassa densità, quali le piastrine piastrine e i monociti.monociti.

2) SEPARAZIONE DEI GRANULOCITI MEDIANTE CENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI DENSITA’

ENGLISH E ANDERSEN (1974)

FICOLL HYPAQUE 1077 E 1119

È dunque possibile ideare un sistema in cui anche le cellule delle serie granulocitiche possano essere raccolte utilizzando una procedura ad una sola fase. Il sistema ficoll-paque 1119 è stato progettato per questo scopo specifico, sulla base delle osservazioni di English e Andersen.

Secondo la procedura, si forma un doppio gradiente depositando uno strato di soluzione ficoll-paque 1077 su un volume identico di soluzione ficoll-paque 1119. Successivamente si versa uno strato di sangue intero sul mezzo ficoll-paque 1077 superiore.

Le provette vengono centrifugate a 700 x g per 30 minuti. Le cellule delle serie granulocitiche si trovano in corrispondenza dell’interfaccia 1077-1119, mentre i linfociti, le altre cellule mononucleari e le piastrine si trovano in corrispondenza dell’interfaccia plasma-1077.

3) SEPARAZIONE POPOLAZIONI CELLULARI PER IMMUNODENSITA’

Unwanted cells are targeted with monoclonal antibody-based reagents, and pellet when centrifuged over density medium.

Selezione negativa

A Immunodensità

Questa metodica permette l’isolamento di popolazioni cellulari umane utilizzando:

-antibody-based TAC (tetrameric antibody complex) technology,

-density centrifugation

Cell enrichment simply involves a brief incubation of the sample with the antibody-based enrichment cocktail at room temperature, followed by a standard buoyant density separation. The antibody cocktail crosslinks unwanted cells in human whole blood to multiple red blood cells (RBCs), forming immunorosettes. This increases the density of the unwanted (rosetted) cells, such that they pellet along with the free RBCs when centrifuged over a buoyant density medium. Desired cells are never labeled with antibody and are easily collected as a highly enriched population at the interface between the plasma and the buoyant density medium .

Alcuni esempi:

-kit per la separazione di linfociti T

TAC cocktail with monoclonal antibodies to the following human cell surface antigens: glycophorin A, CD16, CD19, CD36, CD56, CD66b

This depletion cocktail is tailored to enrich T cells from fresh whole blood. The enriched T cells have not been labeled with antibody.

-kit per la separazione di monociti

TAC cocktail with monoclonal antibodies to the following human cell surface antigens: Glycophorin A, CD2, CD3, CD8, CD19, CD56, CD66b

This depletion cocktail is tailored to enrich monocytes from fresh whole blood. The enriched monocytes have not been labeled with antibody.

-kit per la separazione di linfociti NK

TAC cocktail with monoclonal antibodies to the following human cell surface antigens: Glycophorin A, CD3, CD4, CD19, CD36, CD66b

This depletion cocktail is tailored to enrich NK cells from fresh whole blood. The enriched NK cells have not been labeled with antibody

B Immunodensità

4) SEPARAZIONE POPOLAZIONI CELLULARI CON METODICA IMMUNOMAGNETICA

Questa metodica utilizza:

-specific antibodies

-magnetic nanoparticles in a column-free magnetic system. 

Cells are targeted for selection or depletion using monoclonal antibodies directed against specific cell surface antigens.  These labeled cells are then crosslinked to EasySep® magnetic nanoparticles in a standard FACS tube.  The tube is then placed directly in the specially designed EasySep® magnet. This handheld magnet is gently inverted to remove the cells that are not bound to the magnetic nanoparticles.  The unique EasySep® magnet generates a high gradient magnetic field in the interior cavity that is strong enough to separate cells labeled with EasySep® nanoparticles without the additional magnetic field gradients provided by a column matrix. Unlike larger microparticles used with other column-free systems, the EasySep® nanoparticles do not interfere with subsequent FACS analysis and do not need to be removed.

 

For Positive Cell Selection:  Cells of interest remain in the tube after pouring off the cells that are not bound to the magnetic nanoparticles. To obtain a highly pure population, these cells are rinsed twice or more, then easily collected by removing the tube from the magnet.

 

For Negative Enrichment:  Cells of interest are poured into a new tube when the magnet is inverted, as they are not bound to the magnetic nanoparticles.

negative selection procedure positive selection procedure

Alcuni esempi

Human CD3+ Cell Depletion

This depletion cocktail is tailored to efficiently remove CD3+ cells from fresh or previously frozen peripheral blood or bone marrow. With this magnetic cell depletion technique, one cell type (CD3+ cells) is targeted for removal and all other cells are recovered without being labeled with antibody.

•TAC reagent with monoclonal antibody to CD3 •Appropriate volume of magnetic colloid

Human CD3 Positive Selection Kit

These reagents are designed to positively select CD3+ cells (cells expressing the CD3 antigen) from fresh or previously frozen peripheral blood mononuclear cells. The CD3 antigen is expressed on all T cells. This cocktail contains an antibody to human Fc receptor to minimize nonspecific binding to monocytes and macrophages.

TAC reagent with monoclonal antibody to CD3

•Appropriate volume of magnetic colloid

Protocollo sperimentale

Sul vostro banco troverete:

·  un tubo da 15 ml contenente 4ml di sangue (2 ml buffy coat diluito in 2ml di PBS)·  una eppendorf contenente 100 μl di cocktail di anticorpi ·  un tubo da 15 ml con 4 ml di PBS + FBS 2% (siero fetale bovino)·  un tubo da 15 ml con 2 ml di Ficoll 1.    Aggiungere i 100 μl di cocktail di anticorpi alla provetta contenente il campione di sangue.2.    Incubare per 20 min. a temperatura ambiente, per permettere la formazione delle rosette.3.    Una volta scaduto il tempo d’incubazione, aggiungere al tubo con il sangue e gli anticorpi 2ml di PBS + FBS 2%.4.    Stratificare la sospensione formata su Ficoll: ciò vuol dire versare lentamente la sospensione di sangue, anticorpi e PBS + FBS 2% nel tubo con Ficoll.5.    Centrifugare per 15 min. a 1200 g.6.    Dopo la centrifugata vedrete nel tubo varie fasi:·        in alto si trova il plasma;·        più o meno al centro (subito al di sotto del plasma) si trovano le cellule che ci interessano·        ancora sotto si trova il Ficoll·        sul fondo della provetta sono stratificate le “rosette”, cioè globuli rossi e cellule non desiderate.