La genetica delle amiloidosi familiari

� Gabriella Restagno

� SS Diagnostica e Consulenza geneticaAO OIRM-S.Anna

� E-mail: gabriella.restagno@oirmsantanna.piemonte.it

� Conferenze Patologico-cliniche 2008

Le amiloidosi familiari:Le amiloidosi familiari:eterogeneità geneticaeterogeneità genetica

� Gruppo di differenti malattie ognuna risultante da mutazioni in una proteina specifica

� La più comune: transtiretina

� Più rare: apolipoproteina AI, cistatina C, lisozima, catena Aα del fibrinogeno, apolipoproteina AII

Ereditarietà “semplice”, correlazioneGenotipo-fenotipo Caratteri Complessi: interazione

Geni + ambiente

Basi genetiche “semplici” e basi genetiche “complesse”

L’utilizzo dei test genetici è un intervento complesso

� Sospetto diagnostico, informazione e preparazione al test (consulenza pre-test)

� Strategie di esecuzione del test genetico di laboratorio: quali tecnologie

� Interpretazione dei risultati

� Comunicazione al paziente (consulenza post-test)

� Supporto a chi ha ricevuto un test positivo

Non indicato il cariotipo

� Prepared from chromosome

metaphase spreads

� Requires dividing cells

� Each chromosome has its

unique staining pattern

� Results need to be read and

interpreted by a certified

cytogeneticist

� Resolution of technique is ~5

Mb

Indicata l’analisi del DNA

�Le molecole di DNA sono a doppia elica, connesse da pontiidrogeno

�Le varie combinazioni diquesti quattro nucleotidicreano un codice unico per ilDNA chiamato sequenza ( o genotipo, gene, allele)

� Cambiamenti nella sequenzadel DNA sono detti mutazioni(se causa di malattia) o polimorfismi (se varianti“neutre”)

�Un Dna è un lungo polimeroformato da quattro basiazotate (nucleotidi).

PerchPerchéé eseguire leseguire l’’analisi del DNA analisi del DNA (Analisi di un gene specifico allo scopo di accertare o escluder(Analisi di un gene specifico allo scopo di accertare o escludere e

unun’’alterazione associata ad una malattia ereditaria, nelle alterazione associata ad una malattia ereditaria, nelle amiloidosi TTR, amiloidosi TTR, apolipoproteina AI, cistatina C, lisozima, catena Aa del fibrinogeno, apolipoproteina AII, MEFV ))

••Conferma diagnosticaConferma diagnostica

••Identificazione degli eterozigoti (Identificazione degli eterozigoti (““carriercarrier””))

••Test Test presintomaticipresintomatici e predittivie predittivi

••Test di Test di ““suscettibilitsuscettibilità”à” o o ““predisposizionepredisposizione””

La diagnosi genetica può essere eseguita con la ricerca di mutazioni sulla sequenza dei diversi geni

Come di esegue l’analisi del DNA

� Il DNA viene estratto generalmente da un prelievodi sangue (in edta). L’analisi si effettua in tre passaggi:

� 1) Preparazione del campione

� 2) Amplificazione (PCR)

� 3) Rivelazione della mutazione (o del polimorfismo) con differenti metodiche

MutazioneMutazionepuntiformepuntiforme DelezioneDelezione InserzioneInserzione

DuplicazioneDuplicazione

Varianti di uno stesso gene possono causare Varianti di uno stesso gene possono causare sintomi clinici noti (mutazioni) o non dare sintomi clinici noti (mutazioni) o non dare sintomi clinici (polimorfismi)sintomi clinici (polimorfismi)

Mutazioni del DNAMutazioni del DNA

Le amiloidosi ereditarie :Le amiloidosi ereditarie :autosomiche dominanti (AD)autosomiche dominanti (AD)

Le amiloidosi ereditarie :Le amiloidosi ereditarie :da transtiretina (A TTR)da transtiretina (A TTR)

� Mutazioni nella plasma proteina tetramericatranstiretina, composta da 127 aminoacidi

� trasporta ormone tiroideo e VitA attraverso un complesso con RBP in siero e liquor

TTR: il locus

OMIM: *107680, 18q11.2- q12.1

TTR: il gene TTR: il gene 4 esoni, 615 bp (147 4 esoni, 615 bp (147 aminoacidi)aminoacidi)

A TTR: Eterogeneità allelica e fenotipica

A TTR: Eterogeneità allelica e fenotipica

A TTR: la stessa mutazione può dare fenotipi differenti

V30M: variabilità dei sintomi clinici in soggetti di origine etnica differente

V30M: penetranza (% di portatori della mutazione che sviluppano la malattia) inferiore al 50%

Ile84Ser: penetranza circa 100%

Mutazioni in altri geni non TTR

Amiloidosi da ApoAI: il locus

OMIM: *107680, 11q23

ApoAI: 4 esoni, 897 bp, 267 aminoacidi

•Gly26Arg (ggc>cgc): NP, nefropatia

• Trp50Arg (tgg>agg): A sistemica, non NP

•Leu90Pro (cta>cca): A cardiaca e cutanea

•Arg173Pro (cga>cca): A cardiaca, cutanea, laringea

•Leu174Ser (ttg>tcg): A sistemica, non NP

•Ala175Pro ( gcg>ccg): A sistemica, nefropatia, laringea

•del60-71 insVal/Thr: A epatica

•del70-72: nefropatia

Amiloidosi da gelsolina: il locus

OMIM: *137350, 9q34

Amiloidosi da gelsolina: il gene / le mutazioni

Asp187Asn: A sistemica, NP

Asp187Tyr : A sistemica, NP

17 esoni, 2657 bp, 782 aminoacidi, splicing alternativi

Una forma autosomica recessiva: il gene MEFV

OMIM: *6081107, 16p1310 esoni, 3677 bp, 781 aminoacidisplicing alternativi tessuto specifici

il gene MEFV: mutazioni in omozigosi con frequenza differente in diverse popolazioni

M694V: più frequente in popolazioni con amiloidosi sistemica (penetranza 99%, 20-65% dei cromosomi FMF in Arabi, Armeni, Turchi)

E148Q (penetranza 55%)

V726A: più frequente in popolazioni in cui l’amiloidosi èmeno comune

tre mutazioni hotspot ai codoni

148, 680 e 694

I geni delle amiloidosi: metodi d’indagine molecolare

� Per le mutazioni frequenti

� Analisi con primers allele-specifici (ARMS)

� Analisi con sonde oligonucleotidiche allele-specifiche (dot blot, reverse dot blot, kit...)

� Microchip

� Pyrosequencing

Per le mutazioni rare� DGGE� SSCP

� DHPLC � Sequenziamento

1953: doppia elica del DNA ( Watson e Crick )

1955: 46 cromosomi

1961: mRNA

1966: codice genetico

1968: primo enzima di restrizione

1975-1977: sequenza del DNA (Sanger)

1983: mappato il primo gene-malattia

INVENTATA LA PCRINVENTATA LA PCR

2 4 8 16 32 64 128 2 4 8 16 32 64 128 etcetc..

Amplificazione del DNA tramite PCR

(Polymerase Chain Reaction)

� La Polymerase Chain Reaction (PCR) è un

processo di amplificazione del DNA che, a

partire da una sequenza DNA “bersaglio”, ne

consente l’amplificazione selettiva e rapida.

20 µµµµL

Ingredienti:Ingredienti:

DNA da analizzareDNA da analizzare

OligonucleotidiOligonucleotidi(primer)(primer)

NucleotidiNucleotidi

Mg, bufferMg, buffer

TaqTaq PolimerasiPolimerasi

wild type mutato eteroduplici omodupliciwild type wild type mutatomutato eteroduplicieteroduplici omodupliciomoduplici

DHPLC DHPLC ((DenaturingDenaturinghigh performance high performance liquidliquidchromatographychromatography))

•Tecnica di screening che permette di identificare variazioni nella sequenza del DNA in eterozigosi senza uso di gel, fluorescenti ecc., su una speciale colonna cromatografica• Dopo la PCR si esegue una denaturazione (94°C) e un re-annealing (56°C) in cui si formano gli omoduplici originali di filamenti complementari e gli eteroduplici generati dalla combinazione di un filamento wild type e di uno mutato

Profilo cromatografico in DHPLC dell’esone 2 del gene TTR in soggetto eterozigote V30M / wt

V30M

wild-type

Sequenza diretta gene TTR mutazione V30M/wt, esone 2

E89Q

wild-type

Profilo cromatografico in DHPLC dell’esone 2 del gene TTR in soggetto eterozigote E89Q / wt

Sequenza diretta gene TTR E89Q / wt, esone 3

Interpretazione delle mutazioni

� Database

� pubblicazioni

� esperienza dei centri

Problemi aperti : interpretazione prognosticadel significato delle mutazioni

� Database

� Anamnesi familiare

� Mutazioni “de novo”

� Penetranza incompleta

� Espressione variabile (geni modificatori, eterogeneità allelica o di locus, fattori ambientali)

Il punto più critico: i tempi di risposta dei test molecolari

•Dati i costi delle analisi sul DNA (purificazione, DHPLC, sequenze, ecc.) in genere si segue una procedura a passaggi successivi : essenziale una consulenza genetica pre- test

•i tempi di risposta possono variare da una settimana a vari mesi

•in una percentuale variabile di casi non si evidenziano mutazioni

PROSPETTIVE :

LE NUOVE TECNOLOGIE

Messa a punto di pannelli per l’analisi rapida delle mutazioni più frequenti, determinate su basi epidemiologiche

Analisi contemporanea di un elevato numero di mutazioni note, anche in geni diversi: (multiplex PCR)

•Sequenziamento in tempo reale

•Analisi con microarray (microchip)

Next-generation sequencing

Trends in Genetics, Vol 24, marzo 2008

Essenziale

•Necessità di una stretta collaborazione tra clinici, genetisti e laboratoristi

•utilizzo di strumentazione ad elevato throughputper l’analisi molecolare contemporanea di un elevato numero di geni/mutazioni

•attenta valutazione dei risultati dei test molecolari insieme ai dati clinici e di laboratorio

• consulenza genetica