Promotori eucariotici

RNA pol I trascrive rRNA

RNA pol II trascrive mRNA per proteine

RNA pol III trascrive tRNA e 5S rRNA

LE RNA POLIMERASI COMERICONOSCONO I PROMOTORI?

Transcribed region

Promotore-contiene sequenzeSpecifiche per il legame dellapolimerasi

FATTORI DI TRASCRIZIONE

• FATTORI DI TRASCRIZIONE GENERALI (BASALI) - RICONOSCONO ELEMENTI “core promoter”

• REGOLATORI SPECIFICI - ATTIVATORI

- REPRESSORI

Transcribed region

ELEMENTO ENHANCER

ELEMENTO

DEL PROMOTORE PROSSIMALE

Basal factor binding sites

• Il legame promotore RNA polimerasi

richiede i fattori di trascrizione generali

Promotori

~200 bp

gene

Reporter gene

COME IDENTIFICARE ELEMENTI NEL PROMOTORE

eg CAT, luciferase

ATTIVITA’

100%

Reporter gene 100%

Reporter gene 20%

Reporter gene 1%

Reporter gene 0%

Reporter gene

eg CAT, luciferase

ATTIVITA’

100%

Reporter gene 100%

Reporter gene 400%

Reporter gene 1%

Reporter gene 0%

COME IDENTIFICARE ELEMENTI NEL PROMOTORE

Livello

di tr

asc

rizi

one

basale

attivato

represso

Transcribed region

Elementi del Core promoter • siti di legame per I fattori di trascrizione generaliChe supportano un livello di trascrizione basale

La regolazione della trascrizione e’ ottenuta dallaAzione di fattori di trascrizione gene-specifici

~24bpTATABRE Inr DPE

TATA-box 8 bp elemento ricco in AT

BRE 6 bp elemento ricco in purine

Bound by TFIID

Bound by TFIIB

Inr DPE Bound by TFIID

RNAP II

TFIIA

TFIIE

TFIIF

TFIIH

RNAP II

TFIIB

TFIID2-3 subunits

2 subunits

1 subunit

10 subunits

2 subunits

12 subunits

9 subunits~40 polipeptidi

~24bpTATABRE Inr DPE

TATA-box 8 bp AT

BRE 6 bp

lega TFIID

lega TFIIB

Inr DPE lega TFIID

RNAP II

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~24bpTATABRE Inr DPE

TFIIH

TFIIDTFIIATFIIB

TFIIF

RNAP IITFIIE

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TFIID contiene la TATA-Box Binding Protein

TBP

TFIID

TFIID e’ composta da vari TBP Associated Factors

—TAFs

-aiutano il posizionamento di TFIID riconoscendoL’elemento Inr

-legano i fattori di trascrizione gene specifici

-aiutano a decompattare la cromatina

~24bpTATABRE Inr DPE

TFIID

~24bpTATABRE Inr DPE

TFIIDTFIIA

-aumenta e stabilizza il legame di TBP al DNA

-interagisce con vari attivatori gene specificiAiutandoli a legarsi ai vari TAF

TFIIA

~24bpTATABRE Inr DPE

TFIIDTFIIATFIIB

TFIIB

-si lega a TBP e richiama la polimerasi

-Partecipa alla selezione del sito d’inizio eStabilisce la direzione

~24bpTATABRE Inr DPE

TFIIDTFIIATFIIB

TFIIF

RNAP II

TFIIF

Stabilizza il complesso di preinizio e induceUna torsione nel DNA

~24bpTATABRE Inr DPE

TFIIDTFIIATFIIB

TFIIF

RNAP IITFIIE

TFIIE

Attira una elicasi ed insieme srotolano ilPromotore.Stimola l’attivita’ chinasica di TFIIH

~24bpTATABRE Inr DPE

TFIIH

TFIIDTFIIATFIIB

TFIIF

RNAP IITFIIE

TFIIH

Fosforila una delle subunita’ della polimerasidando l’avvio alla trascrizione

— REGOLATORI GENE SPECIFICI

Transcribed region

SI LEGANO A SEQUENZE REGOLATORIE

Regolatori gene specifici

• hanno una struttura modulare

• contengono un dominio che lega il DNA

• contengono uno o piu’ domini di attivazione trascrizionale

• qualche volta contengono uno o piu’ domini di repressione• qualche volta contengono un dominio di dimerizzazione

(MADS box)

NH

H O C

Donatore Accettore

A D A M A A D M A D A D A A

A A A D A A A A D A

Transcribed region

Regolatori gene specifici

1) Contengono un dominio che lega il DNA

2) E un dominio di attivazione trascrizionale

Gli Attivatori come influenzano la trascrizione di un gene distante molte

migliaia di nucleotidi?

DNA loop

Enhancers- stimolano la trascrizione1. Attivatori si legano ad un sito specifico

2. Il DNA si ripiega

Enhancers- stimolano la trascrizioneAttivatori si legano

ad un sito specifico

Il DNA si ripiega

Si forma il complesso nel promotore

Enhancers- stimolano la trascrizioneAttivatori si legano ad un

sito specifico Il DNA si ripiegaSi forma il complesso

nel promotoreSi lega la RNA

polimerasiInizio della trascrizione

Controllo combinatorialedell’espressione genica

Con poche proteine regolatorie si possono controllare un elevato numero di geni

Diverse combinazioni producono fenotipi differenti

Heterodimerization of DNA binding proteins can altertheir sequence specificity

Enhancer e Repressori

gene

promotoreenhancer

repressore10-50,000 bp

repressore previene il legame dell’enhancer

RNAP

enhancer interagiscono con RNAP

trascrizione

Recettori nucleari Fattori di trascrizione regolati da molecole

idrofobiche• Cambio dell’attivita’• Cambio della localizzazione cellulare

Recettori nucleari

RGRACANNNTGTYCY

TBP

TAFTAF

TAF

TAF

RNA pol II

Il legame del ligando causa cambiamenti conformazionali

Nuclear Receptors

GR hsp90hsp90GR

Legame dell’ormone

Dissociazione da hsp90

dimerizzazione

GR GR

Migrazione nel nucleoGR GR

Legame al DNA

TATA

Regolazione mediante fosforilazione

• Ormoni attivano una chinasi

• La chinasi fosforila un fattore di trascrizione

• Il fattore e’ attivato

Cascata delle chinasiGF si lega al recettore - protein tyrosine kinase

Il recettore dimerizza

Il complesso fosforila MEKK – (MAP kinase kinase kinase)

MEKK fosforila SEK – una MAP kinase kinase

SEK fosforila JNK – una MAP kinase

MEKK

P

MEKKP

SEKSEKP

JNKJNKP

Cascata delle chinasiJNK attivata migra nel nucleo e fosforila il fattore di trascrizione C-JUN

C-JUN dimerizza with C-FOS per formare AP-1

AP-1 attiva la trascrizione legandosi a –TGA(C/G)TCA- e interagendo con I fattori di trascrizione generali

JNKP

nucleo

C-JUN

TRE

C-JUN

P

RNA pol II

C-FOS

P

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Metilazione del DNA• La citosina puo’ essere metilata:

• La metilazione del DNA e’ coinvolta nell’inattivazione del cromosoma X

• Risulta in una maggiore condensazione della cromatina

Trascrizione e struttura della cromatina

• Il DNA nella cromatina condensata non e’ accessibile

• La cromatina condensata (eterocromatina) e’ trascrizionalmente silente

• La condensazione della cromatina dipende ANCHE dalla acetilazione degli istoni

Acetilazione degli Istoni

• E’ una modificazione post-traduzionale

• Gruppi acetilici (CH3COO–) legati covalentemente a aminoacidi basici Neutralizzano le cariche positive

• Eliminano le interazioni ioniche con il DNA

• Diminuiscono la condensazione

• Associati con una attiva trascrizione

– Acetilazione/Deacetilazione

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Attivatori: acetilazione degli Istoni

• Alcuni attivatori attirano delle acetilasi

• Il macchinario di trascrizione puo’ accedere

al DNA meno condensato

Alcune Istone Acetilasi (HAT)

• p300/CBP

• TAF II 250

• Ambedue sono dei co-attivatori

• SAGA e’ a ponte tra un Fattore di Trascrizione e la TBP

Repressori: deacetilazione degli Istoni

• Alcuni repressori attirano delle deacetilasi

• Prevengono l’accesso del macchinario di trascrizione al DNA

– Acetilazione/Deacetilazione

SWI/SNF in Lievito

SWI/SNF sono regolatori positivi del gene HO (accoppiamento) e del gene SUC2 (utilizzo del saccarosio).

Queste proteine catalizzano il rimodellamento ATP-dipendente del DNA

Macchinari di Rimodellamento

• Tutti contengono subunita’ simili a swi-2/snf

• NTP-binding proteins

Regolazione dell’Espressione Genica

Puo’ essere regolata in una delle seguenti sei fasi:

DNA RNAtranscript

mRNA mRNA

inactivemRNA

protein

inactiveprotein

NUCLEUS CYTOSOL

trascrizione Maturazione trasporto traduzione

degradazione

controllo dell’attivita’

Lo Splicing puo’ produrre anticorpi solubili o

legati alla membrana dallo stesso gene

• Lo splicing alternativo puo’ produrre due tipi di anticorpo diversi con la stessa specificita’

• Quando attivati dall’antigene i linfociti B cominciano a produrre anticorpi solubili

• Le forme secrete mancano degli esoni 7 e 8 che codificano per domini idrofobici

L’RNA Editing altera le sequenze dei pre-mRNA

Figure 11-39

• mRNA editing

Nell’intestino

La deaminasi e’ presente solo nell’intestino

Nel fegato

Metodi per studiare l’espressione dei geni• Northern blot• Trascrittasi Inversa -PCR (RT-

PCR)• Ibridazione In situ• Trascrizione In vitro• DNA Microarray

Purificazione dell’RNA

• Procedura – Lisi delle cellule con un reagente

che dissocia le nucleoproteine e inibisce la RNAsi

– Rimozione delle proteine– Precipitazione specifica dell’RNA

Northern blot

• Per determinare la dimensione e la quantita’ di specifici mRNA

• Studi sull’espressione genica

Northern blot– Elettroforesi dell’RNA in gel

contenente formaldeide per mantenere l’RNA in forma completamente lineare

– Trasferimento dell’RNA su una membrana

– Ibridazione con una sonda marcata

100V 0,2A

+-

generatore di corrente

gel di agarosio

scatola elettroforetica

tampone elettroforeticoes. TAE (4mM Tris-acetato, 1mM EDTA, pH 8.0)

Gel Elettroforesi-

Separa le molecole in base alla dimensione

Trasferimento su supporto solido

Trasferimento dal gel alla membrana

gel

membrana

Dopo il trasferimento

Preparare la sonda per il Northern Blot

Ibridazione

• La sonda marcata e’ aggiunta ad una soluzione contenente il supporto solido che lega l’RNA da analizzare

Lavaggio

• Rimozione della sonda non legata al supporto solido

Rivelazione degli ibridi

• Esposizione di un film se la sonda e’ marcata radioattivamente

• Se la sonda e’ marcata con un enzima si procede alla reazione enzimatica che produce colore direttamente sul supporto solido

Northern blot

• La rivelazione avviene usando:– DNA marcato con

radioattivo(32P)

– DNA marcato con un enzima che catalizza una reazione che produce luce o colore

Fig. 5. Northern blot analysis of E. lagascae total RNA from leaves (L), germinating seeds (Se), roots (Ro) and stems (St). The blot was hybridized with probes for ElLTP1 (top panel) and ElLTP2 (middle panel). The bottom panel shows ethidium bromide staining of the gel before blotting. The numbers to the left indicate approximate transcript sizes in kb

Northern blot

Svantaggi del Northern Blot

• Richiede grandi quantita’ di RNA

• E’ un processo lungo e laborioso

Ibridazione dell’RNA in situ

Rivelazione di mRNA direttamente su tessuti messi su vetrini da microscopio

Preparation of RNA probe with in vitro transcription

T7/T3 or SP6 promoter

Fig. 7. RNA in situ hybridization with antisense (a-c) and sense (d) RNA probes for ElLTP1. E. lagascae seedlings were collected 7 days after sowing. co Cotyledon, en endosperm, hy hypocotyl, am apical meristem, ro root

RNA in situ hybridization

Colour substrate:

nitro blue tetrazolium (NBT) + 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP)

• Il livello di RNA presente nella cellula non necessariamente riflette direttamente i livelli di trascrizione del gene

• Per poter asserire che un gene viene attivato TRASCRIZIONALMENTE occorre poterne visualizzare l’attivita’

Il saggio di “run-on” (o della catena nascente di RNA)

permette di determinare il livello di trascrizione di un gene

1) Purificare i nuclei2) + NTP, 32P GTP3) Trascrizione: la catena nascente e’ radioattiva4) Estrazione dell’RNA5) Ibridazione a cDNA immobilizzato

su filtro

Sintesi differenziale di 12 geni codificanti mRNA epato-specifici

analizzata tramite run-on

LodishFigure 10-23

Northern blottingProbe labeling

pBS-SemaIII

dATP

dGTPdTTP

dCTPRNA isolation

AAAAAA

Gel electophoresis

Blotting

Hybridization

Autoradiography

reverse Northern blotting

Down-regulation of transcripts

Up-regulation of transcripts

**

labeled (specific) probe

target

Northern

**

specific probes

labeled target

reverse Northern