Misure con biomarcatoriIV. Biomarkers di genotossicità

Prof. Giorgio SartorCorso di Laurea Specialistica in Scienze per l’Ambiente e il Territorio

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Versione 3.0 - gennaio 2006

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Stress ossidativo

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Ossigeno tripletto

· O – O ·

3O2

2p4

2s2

1s2

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Fornendo energia

3O2 1O2

hν

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Ossigeno singoletto

O – O :

1O2

2p4

2s2

1s2

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Anione superossido

·O - O· ·O – O:- O22- perossido

2O2·- + 2H+ H2O2 + 3O2 dismutazione

O2·- + Fe3+ Fe2+ + 3O2 ossidazione

H2O2 + Fe2+ Fe3+ + ·OH + -OH (Fenton)

H2O2 + O2·- 3O2 + ·OH + -OH (Haber-Weiss)

O2·- + ·OH 1O2 + -OH

O2·- + NO· OONO- perossinitrito

e- riduzione

Fe/Cu

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Specie radicaliche dell’Ossigeno (ROS)

• Prodotte anche dalla catena respiratoria

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Specie radicaliche dell’Azoto (RNS)

• Prodotte prevalentemente dallo smog fotochimico

• All’interno dell’organismo vengono prodotte da reazioni dell’ossigeno molecolare

O2 + L-arginina → •NO + L-citrullina monossido d’azotoO2•ˉ + •NO → ONOOˉ perossinitritoONOOˉ + CO2 → ONOOCO2ˉ nitroperossicarbonato ONOOCO2ˉ + •NO2 + CO3•ˉ biossido d’azoto e radicale carbonato

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Fonti di Radicali

• Sorgenti endogene: • catena respiratoria, fotosintesi,

prostaglandine, perossisomi, autossidazione, fagociti, ossiemoglobina, enzimi ossidativi

• Sorgenti esogene: • xenobiotici, radiazioni (ionizzanti e UV),

calore, infezione, iperossia, inquinamento

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Invecchiamento

Diminuzione delle difese antiossidanti

UV

Aumento dello stress ossidativo

AUMENTATA PRODUZIONE DI ROS

Accumulazione di mutazioni del DNA

Stimolazione delle vie di trasduzione del

segnale

Modificazione di proteine

Alterazione della struttura genica

Alterazione dell’attività genica

Alterazione della struttura e della

funzione delle proteine

Perdita della regolazione dell’omeostasi intracellulare ed extracellulare

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Biomarkers di genotossicità e loro significato

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Inquinante o xenobiotico

ASSORBIMENTO

Distribuzione (sangue, tessuti)

Biotrasformazione

Metabolitiattivi

Metabolitiinattivi

Distribuzione (sangue, tessuti)

ESC

REZ

ION

E

Legame a siti critici Legame a siti non critici

Prodotti di degradazione

Effetti non tossici

Danni reversibili

Lesioni precliniche Lesioni cliniche

MONITORAGGIOAMBIENTALE

MONITORAGGIOdell’esposizione

biologica

MONITORAGGIOdell’effetto biologico

Meccanismi di riparo

DIAGNOSI

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INDUZIONE dellaSINTESI PROTEICA

HSP

Effetto sinergico di inquinanti

Danno perossidativoalle membrane lisomiali

Danno perossidativo

alle membrane lisosomiali

IDROLASI

lipofuscine

DNA

LISOSOMI

Alterazionidel DNA

Riparate Non riparate

Mutazioni

Tumori e carcinogenesi

Aberrazioni aicromosomi

Apo-tioneine

metallotioneine

CytP450

Stimolazionesintesi mRNA

Stimolazionesintesi mRNA

ESCREZIONE

Biotrasformazione

Metaboliti

METALLIPESANTI

XENOBIOTICIORGANICI

METALLIPESANTI

ORGANOMETALLI(Sn)

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Danni al DNA

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Tipi di danni al DNA

• Danni naturali• Mutazioni spontanee

• Danni fisici • Da radiazioni ionizzanti e UV

• Danni chimici • Da ROS e inquinanti organici

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Danni Naturali

• Perdita di basi: il legame glicosidico è labile sotto condizione fisiologiche (formazione di un sito AP).

• Deamminazione: i gruppi amminici primari sono a volte instabili e possono venire convertiti in chetoni.

O P OR

O P OH

O

NON

OO

NH2

P OH

O

O

OO

OH

H

NO

N

N

ON

NH2

OO P O

OR

Sito AP

R

O P OH

O

NON

OO

O

H

O P OR

NH3

R

O P OH

O

NON

OO

NH2

O P OR

O2

Citidina Uracile

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Danni Fisici: Radiazioni Ionizzanti

• Danni diretti: Single Strand Break, Double Strand Break, mismatched bases.

• Danni indiretti: produzione di ROS.

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Danni Fisici: Radiazioni UV• Stress ossidativo: foto-carcinogenesi e foto-invecchiamento

(UV-B)• Foto-dimerizzazione: formazione di CPD e 6-4PP (UV-C).

O P O

R

O P OR

O

O N NH

O

O

CH3

P OH

OO

O

OO

N

N OO

CH3

O P O

R

O P OR

O

O

P OH

OO

O

OO

N

N OO

CH3H

N

N

O

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Danni chimici: ROS• Causano ossidazione delle basi e amplificano deamminazioni e

depurinazioni.o Un esempio di composto ossidato è OH8dG: causa

trasversioni delle basi GC → TA

RO

O

RON

N

N

NH

O

NH2

RO

O

RON

N

N

NH

O

NH2

O HROS

deossiGuanosina 8-ossi-deossiGuanosina (OH8dG)

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Danni chimici: inquinanti Organici• Genotossici: danno diretto al

DNA tramite formazione di addotti (alchilanti in posizioni nucleofile).

N N

N N

NH2

R

N

NH

O

O

CH3

R

N

N

O

NH2

R

N N

N NH

O

NH2

R

Guanina

Adenina Timina

Citosina

OOH

OH

OH

OH

O

OH

OH

OH

NN N

N N

O

H

H

DNA

(+)-7,8-diidro-benzo[a]pirene-7,8-ossidobenzo[a]pirene

(-)-trans-7,8-diidro-benzo[a]pirene-7,8-diolo

(+)-anti-7,8-diidro-benzo[a]pirene-7,8-diol-9,10-ossido

addotto con il DNA

monoossigenasi epossido-idrolasi

monoossigenasi

• Epigenetici: danno indiretto al DNA attraverso stress ossidativo o l’attivazione di composti pericolosi. Es. IPA.

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Formazione di micronuclei

• Durante la divisione cellulare i cromosomi sono trascinati verso i due poli da fibrille. Se il DNA è rotto il cromosoma non ha centromero in grado di attaccarsi alle fibre. Il DNA danneggiato rimane quindi al di fuori del nucleo principale e forma uno o più micronuclei.

• I micronuclei si formano sia per rottura del singolo strand (chimica) che per rottura del doppio strand (radiazioni).

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Formazione di micronuclei

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Test dei micronuclei

• Blocco del ciclo cellulare.• Calcolo della % dei micronuclei indotti

(separazione incorretta di frammenti cromosomici durante l’anafase).

• Vengono considerati positivi i campioni con correlazione dose-risposta che mostrano una % almeno doppia del bianco.

• Spesso utilizzato come bioindicatore di genotossicità in ambiente marino con applicazione in mitili.

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Addotti al DNA

• Sono prodotti dall’azione dei ROS e/o degli IPA sul DNA

RO

O

RON

N

N

NH

O

NH2

RO

O

RON

N

N

NH

O

NH2

O H

OH

OH

OH

NN N

N N

O

H

H

ROS

deossiGuanosina 8-ossi-deossiGuanosina (OH8dG)

DNAaddotto di

benzo--pirene con il DNA

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OH8dG

• Biomarker clinico del danno ossidativo al DNA.• Non è assimilata dalla dieta, tutta l’OH8dG

urinaria è conseguenza diretta delle lesioni cellulari.

• Facilmente distinguibile da G con tecniche analitiche.

• Problema: OH8dG ha un potenziale di ossidazione più basso di G, quindi diventa il sito preferenziale di ossidazione, e forma la guanidinoidantoina.

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Referenze sul WEB …• Vie metaboliche

– KEGG: http://www.genome.ad.jp/kegg/• Degradazione degli xenobiotici:

http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway/map/map01196.html• Struttura delle proteine:

– Protein data bank (Brookhaven): http://www.rcsb.org/pdb/– Hexpasy

• Expert Protein Analysis System: http://us.expasy.org/sprot/• Prosite (protein families and domains): http://www.expasy.org/prosite/• Enzyme (Enzyme nomenclature database):

http://www.expasy.org/enzyme/– Scop (famiglie strutturali): http://scop.berkeley.edu/

• Enzimi: – Nomenclatura - IUBMB: http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/– Proprietà - Brenda: http://www.brenda.uni-koeln.de/– Expasy (Enzyme nomenclature database): http://www.expasy.org/enzyme/

• Database di biocatalisi e biodegradazione: http://umbbd.ahc.umn.edu/• Citocromo P450: http://www.icgeb.org/~p450srv/• Metallotioneine: http://www.unizh.ch/~mtpage/MT.html• Tossicità degli xenobiotici: Agency for Toxic Substances and Disease Registry

http://www.atsdr.cdc.gov

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…e naturalmente

• Questo ed altro materiale può essere trovato visitando il sito: http://www.ambra.unibo.it/giorgio.sartor/

• Il materiale di questa presentazione è di libero uso per didattica e ricerca e può essere usato senza limitazione, purché venga riconosciuto l’autore usando questa frase:

• Materiale ottenuto dal Prof. Giorgio SartorUniversità di Bologna a Ravenna Corso di Laurea in Scienze Ambientali