Misure con biomarcatori IV. Biomarkers di genotossicità Prof. Giorgio Sartor Corso di Laurea...
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Misure con biomarcatoriIV. Biomarkers di genotossicità
Prof. Giorgio SartorCorso di Laurea Specialistica in Scienze per l’Ambiente e il Territorio
Copyright © 2001-2006 by Giorgio Sartor.
All rights reserved.
Versione 3.0 - gennaio 2006
gs © 2001-2006 ver 3.0 Misure con biomarcatori IV 2
Stress ossidativo
gs © 2001-2006 ver 3.0 Misure con biomarcatori IV 3
Ossigeno tripletto
· O – O ·
3O2
2p4
2s2
1s2
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Fornendo energia
3O2 1O2
hν
gs © 2001-2006 ver 3.0 Misure con biomarcatori IV 5
Ossigeno singoletto
O – O :
1O2
2p4
2s2
1s2
gs © 2001-2006 ver 3.0 Misure con biomarcatori IV 6
Anione superossido
·O - O· ·O – O:- O22- perossido
2O2·- + 2H+ H2O2 + 3O2 dismutazione
O2·- + Fe3+ Fe2+ + 3O2 ossidazione
H2O2 + Fe2+ Fe3+ + ·OH + -OH (Fenton)
H2O2 + O2·- 3O2 + ·OH + -OH (Haber-Weiss)
O2·- + ·OH 1O2 + -OH
O2·- + NO· OONO- perossinitrito
e- riduzione
Fe/Cu
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Specie radicaliche dell’Ossigeno (ROS)
• Prodotte anche dalla catena respiratoria
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Specie radicaliche dell’Azoto (RNS)
• Prodotte prevalentemente dallo smog fotochimico
• All’interno dell’organismo vengono prodotte da reazioni dell’ossigeno molecolare
O2 + L-arginina → •NO + L-citrullina monossido d’azotoO2•ˉ + •NO → ONOOˉ perossinitritoONOOˉ + CO2 → ONOOCO2ˉ nitroperossicarbonato ONOOCO2ˉ + •NO2 + CO3•ˉ biossido d’azoto e radicale carbonato
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Fonti di Radicali
• Sorgenti endogene: • catena respiratoria, fotosintesi,
prostaglandine, perossisomi, autossidazione, fagociti, ossiemoglobina, enzimi ossidativi
• Sorgenti esogene: • xenobiotici, radiazioni (ionizzanti e UV),
calore, infezione, iperossia, inquinamento
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Invecchiamento
Diminuzione delle difese antiossidanti
UV
Aumento dello stress ossidativo
AUMENTATA PRODUZIONE DI ROS
Accumulazione di mutazioni del DNA
Stimolazione delle vie di trasduzione del
segnale
Modificazione di proteine
Alterazione della struttura genica
Alterazione dell’attività genica
Alterazione della struttura e della
funzione delle proteine
Perdita della regolazione dell’omeostasi intracellulare ed extracellulare
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Biomarkers di genotossicità e loro significato
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Inquinante o xenobiotico
ASSORBIMENTO
Distribuzione (sangue, tessuti)
Biotrasformazione
Metabolitiattivi
Metabolitiinattivi
Distribuzione (sangue, tessuti)
ESC
REZ
ION
E
Legame a siti critici Legame a siti non critici
Prodotti di degradazione
Effetti non tossici
Danni reversibili
Lesioni precliniche Lesioni cliniche
MONITORAGGIOAMBIENTALE
MONITORAGGIOdell’esposizione
biologica
MONITORAGGIOdell’effetto biologico
Meccanismi di riparo
DIAGNOSI
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INDUZIONE dellaSINTESI PROTEICA
HSP
Effetto sinergico di inquinanti
Danno perossidativoalle membrane lisomiali
Danno perossidativo
alle membrane lisosomiali
IDROLASI
lipofuscine
DNA
LISOSOMI
Alterazionidel DNA
Riparate Non riparate
Mutazioni
Tumori e carcinogenesi
Aberrazioni aicromosomi
Apo-tioneine
metallotioneine
CytP450
Stimolazionesintesi mRNA
Stimolazionesintesi mRNA
ESCREZIONE
Biotrasformazione
Metaboliti
METALLIPESANTI
XENOBIOTICIORGANICI
METALLIPESANTI
ORGANOMETALLI(Sn)
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Danni al DNA
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Tipi di danni al DNA
• Danni naturali• Mutazioni spontanee
• Danni fisici • Da radiazioni ionizzanti e UV
• Danni chimici • Da ROS e inquinanti organici
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Danni Naturali
• Perdita di basi: il legame glicosidico è labile sotto condizione fisiologiche (formazione di un sito AP).
• Deamminazione: i gruppi amminici primari sono a volte instabili e possono venire convertiti in chetoni.
O P OR
O P OH
O
NON
OO
NH2
P OH
O
O
OO
OH
H
NO
N
N
ON
NH2
OO P O
OR
Sito AP
R
O P OH
O
NON
OO
O
H
O P OR
NH3
R
O P OH
O
NON
OO
NH2
O P OR
O2
Citidina Uracile
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Danni Fisici: Radiazioni Ionizzanti
• Danni diretti: Single Strand Break, Double Strand Break, mismatched bases.
• Danni indiretti: produzione di ROS.
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Danni Fisici: Radiazioni UV• Stress ossidativo: foto-carcinogenesi e foto-invecchiamento
(UV-B)• Foto-dimerizzazione: formazione di CPD e 6-4PP (UV-C).
O P O
R
O P OR
O
O N NH
O
O
CH3
P OH
OO
O
OO
N
N OO
CH3
O P O
R
O P OR
O
O
P OH
OO
O
OO
N
N OO
CH3H
N
N
O
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Danni chimici: ROS• Causano ossidazione delle basi e amplificano deamminazioni e
depurinazioni.o Un esempio di composto ossidato è OH8dG: causa
trasversioni delle basi GC → TA
RO
O
RON
N
N
NH
O
NH2
RO
O
RON
N
N
NH
O
NH2
O HROS
deossiGuanosina 8-ossi-deossiGuanosina (OH8dG)
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Danni chimici: inquinanti Organici• Genotossici: danno diretto al
DNA tramite formazione di addotti (alchilanti in posizioni nucleofile).
N N
N N
NH2
R
N
NH
O
O
CH3
R
N
N
O
NH2
R
N N
N NH
O
NH2
R
Guanina
Adenina Timina
Citosina
OOH
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
NN N
N N
O
H
H
DNA
(+)-7,8-diidro-benzo[a]pirene-7,8-ossidobenzo[a]pirene
(-)-trans-7,8-diidro-benzo[a]pirene-7,8-diolo
(+)-anti-7,8-diidro-benzo[a]pirene-7,8-diol-9,10-ossido
addotto con il DNA
monoossigenasi epossido-idrolasi
monoossigenasi
• Epigenetici: danno indiretto al DNA attraverso stress ossidativo o l’attivazione di composti pericolosi. Es. IPA.
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Formazione di micronuclei
• Durante la divisione cellulare i cromosomi sono trascinati verso i due poli da fibrille. Se il DNA è rotto il cromosoma non ha centromero in grado di attaccarsi alle fibre. Il DNA danneggiato rimane quindi al di fuori del nucleo principale e forma uno o più micronuclei.
• I micronuclei si formano sia per rottura del singolo strand (chimica) che per rottura del doppio strand (radiazioni).
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Formazione di micronuclei
gs © 2001-2006 ver 3.0 Misure con biomarcatori IV 23
Test dei micronuclei
• Blocco del ciclo cellulare.• Calcolo della % dei micronuclei indotti
(separazione incorretta di frammenti cromosomici durante l’anafase).
• Vengono considerati positivi i campioni con correlazione dose-risposta che mostrano una % almeno doppia del bianco.
• Spesso utilizzato come bioindicatore di genotossicità in ambiente marino con applicazione in mitili.
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Addotti al DNA
• Sono prodotti dall’azione dei ROS e/o degli IPA sul DNA
RO
O
RON
N
N
NH
O
NH2
RO
O
RON
N
N
NH
O
NH2
O H
OH
OH
OH
NN N
N N
O
H
H
ROS
deossiGuanosina 8-ossi-deossiGuanosina (OH8dG)
DNAaddotto di
benzo--pirene con il DNA
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OH8dG
• Biomarker clinico del danno ossidativo al DNA.• Non è assimilata dalla dieta, tutta l’OH8dG
urinaria è conseguenza diretta delle lesioni cellulari.
• Facilmente distinguibile da G con tecniche analitiche.
• Problema: OH8dG ha un potenziale di ossidazione più basso di G, quindi diventa il sito preferenziale di ossidazione, e forma la guanidinoidantoina.
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Referenze sul WEB …• Vie metaboliche
– KEGG: http://www.genome.ad.jp/kegg/• Degradazione degli xenobiotici:
http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway/map/map01196.html• Struttura delle proteine:
– Protein data bank (Brookhaven): http://www.rcsb.org/pdb/– Hexpasy
• Expert Protein Analysis System: http://us.expasy.org/sprot/• Prosite (protein families and domains): http://www.expasy.org/prosite/• Enzyme (Enzyme nomenclature database):
http://www.expasy.org/enzyme/– Scop (famiglie strutturali): http://scop.berkeley.edu/
• Enzimi: – Nomenclatura - IUBMB: http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/– Proprietà - Brenda: http://www.brenda.uni-koeln.de/– Expasy (Enzyme nomenclature database): http://www.expasy.org/enzyme/
• Database di biocatalisi e biodegradazione: http://umbbd.ahc.umn.edu/• Citocromo P450: http://www.icgeb.org/~p450srv/• Metallotioneine: http://www.unizh.ch/~mtpage/MT.html• Tossicità degli xenobiotici: Agency for Toxic Substances and Disease Registry
http://www.atsdr.cdc.gov
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…e naturalmente
• Questo ed altro materiale può essere trovato visitando il sito: http://www.ambra.unibo.it/giorgio.sartor/
• Il materiale di questa presentazione è di libero uso per didattica e ricerca e può essere usato senza limitazione, purché venga riconosciuto l’autore usando questa frase:
• Materiale ottenuto dal Prof. Giorgio SartorUniversità di Bologna a Ravenna Corso di Laurea in Scienze Ambientali