BIOMARCATORI E BIOINDICATORI

NELLA VALUTAZIONE DELLA QUALITÀ

DELLE ACQUE INTERNE

gentilmente inviato da Fortunato La Rocca

Tesi di Laurea Redattore: Fortunato La Rocca Relatore interno: Prof.ssa Barbara Giordana

Relatore esterno: Dott.ssa Elisabetta Agradi

Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali – Corso di Laurea in Scienze Naturali

Università degli Studi di Milano

A.A. 2004/2005

Labelab srl – Via Mirasole 2/2 – 40124 Bologna (BO) – C.F./P.Iva: 02151361207

Università degli studi di MilanoFacoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali

Corso di Laurea in Scienze Naturali

BIOMARCATORI E BIOINDICATORI NELLA VALUTAZIONE DELLA QUALITÀ

DELLE ACQUE INTERNE

Relatore interno: Prof.ssa Barbara GiordanaRelatore esterno: Dott.ssa Elisabetta Agradi

Tesi di Laurea di: Fortunato La Rocca

Anno Accademico 2004-2005

Indice

Introduzione

1- INTRODUZIONE

L’inquinamento delle acque costituisce un problema crescente con effetti sullo stato di salute

dell’ambiente, dell’uomo e della sua qualità di vita. Per questo il ripristino della qualità dei fiumi

che percorrono aree interessate da intensa industrializzazione ed urbanizzazione è ritenuto un

aspetto essenziale dei progetti sponsorizzati dalla Comunità Europea. I dati presentati in questa tesi

sono stati sviluppati nell’ambito del programma di ricerche previste dal progetto CITYFISH

(“Modelling Ecological Quality of Urban Rivers: Ecotoxicological Factors Limiting Restoration of

Fish Populations”) approvato dal quinto programma quadro CE, che ha come scopo quello di

studiare protocolli di biomonitoraggio e di individuare le fonti principali di inquinamento dei fiumi

che toccano importanti città europee. In questa ricerca specie di pesci sono state utilizzate come

bioindicatori dell’inquinamento ambientale sia di tipo organico che inorganico.

In questa tesi sono riportati i dati ottenuti negli studi riguardanti tre dei fiumi previsti dal progetto e

riguardano in particolare i risultati sui biomarcatori e bioindicatori dei metalli pesanti.

Dalla metà del Novecento, di pari passo con la crescita industriale, il letto del fiume e l’ambiente

circostante sono in uno stato di pericoloso degrado. Mentre un tempo la pesca era esercitata a livello

professionale ed amatoriale ora è sensibilmente ridotta e limitata al tratto più vicino alla sorgente.

Recentemente è stato proposto che i biomarcatori possano fornire delle indicazioni interessanti per

la prevenzione dei danni ecologici da inquinamento e per il monitoraggio degli effetti delle strategie

di ripristino ambientale. I biomarcatori sono parametri che consentono di rilevare variazioni

biologiche cellulari e fisiologiche dovute all’esposizione a sostanze tossiche tramite analisi

effettuate su tessuti, fluidi biologici o a livello dell’intero organismo. L’applicazione dei

biomarcatori ha vari vantaggi, tra cui una risposta integrata, sensibile e precoce, prima che si

verifichino effetti letali o anomalie nella riproduzione.

L’inserimento dei biomarcatori nei protocolli di monitoraggio di un ambiente specifico comporta

che l’approccio sperimentale venga adattato alla realtà in cui ci si trova ad operare. Ciò implica un

processo di validazione, cioè i risultati ottenuti dall’impiego di biomarcatori devono essere

confrontati con quanto emerso dalle analisi dei parametri biologici classici previsti dalla normativa

vigente e con i risultati delle analisi chimiche, considerate un parametro di riferimento basilare,

nonostante i limiti delle informazioni fornite.

La tesi comprende anche dati ottenuti al di fuori di questo specifico programma ed a suo

completamento. In particolare questi ultimi dati riguardano l’utilizzo di organismi vegetali nel

biomonitoraggio degli inquinanti inorganici.

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Introduzione

1.1 SOSTANZE INQUINANTIL’uomo, gli animali e le piante sono esposti ad una enorme varietà di sostanze chimiche estranee

all’organismo, o xenobiotici, che possono essere di origine naturale o antropogenica. Queste

sostanze potenzialmente tossiche comprendono metalli e altri composti inorganici ed un gran

numero di complesse molecole organiche.

L’uso di sostanze chimiche elaborate dall’uomo, e la loro immissione nell’ambiente, non è certo una

pratica recente, tuttavia solo verso la metà del 1900 il fenomeno ha assunto dimensioni più

preoccupanti.

Le principali fonti da cui provengono sono localizzate nel settore industriale, agricolo e domestico.

Molte sostanze che l’uomo immette nell’ambiente possono essere lentamente trasformate dagli

organismi viventi, specialmente dai decompositori, sino ad essere completamente demolite e sono

definite biodegradabili; altre sostanze invece non sono biodegradabili (o lo sono molto lentamente).

La maggior parte delle sostanze inquinanti che si riversano nelle acque sono in grado di accumularsi

negli organismi perché sono prevalentemente idrofobiche e attraverso la catena trofica vengono

trasferite da un organismo all’altro subendo un progressivo aumento di concentrazione mediante il

processo di “amplificazione biologica” di una sostanza tossica, che, inizialmente presente nel

terreno o nelle acque, si accumula prima nelle piante, successivamente negli erbivori che se ne

nutrono e più tardi nei carnivori. L’accumulo delle sostanze inquinanti, che prende il nome di

bioaccumulo, può avvenire attraverso due differenti meccanismi:

- la bioconcentrazione: captazione diretta degli xenobiotici, disciolti nell’acqua attraverso le branchie

o la pelle. E’ un fenomeno di natura fisica che dipende unicamente dalla lipofilicità del composto (le

sostanze liposolubili vengono assorbite più facilmente di quelle idrosolubili).

- la biomagnificazione: accumulo crescente di inquinanti, attraverso l’ingestione di cibo

contaminato, che raggiunge in un organismo quantità più elevate rispetto agli organismi che lo

precedono nella catena alimentare.

Una sostanza tossica è capace di produrre delle risposte dannose in un sistema biologico,

alterandone seriamente le funzioni o producendone la morte.

Una volta immessa in una catena alimentare si propaga rapidamente attraverso tutti i suoi anelli. Nel

passaggio da un anello all’altro si concentra sempre più, raggiungendo livelli preoccupanti

soprattutto in quegli organismi sfruttati dall’uomo a fini alimentari.

Virtualmente ogni sostanza chimica, conosciuta e non, può produrre un danno o la morte se presente

in concentrazioni sufficientemente elevate. Tutte le sostanze sono perciò potenzialmente tossiche, la

dose è un fattore discriminante per determinare quando una sostanza produce effetti indesiderati,

danni severi o la morte.

Per produrre una manifestazione tossica, un agente chimico o un suo metabolita deve potere

interagire con specifici siti dell’organismo ed essere presente in una appropriata concentrazione per

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Introduzione

un periodo sufficientemente lungo: perciò l’eventuale manifestazione tossica dipende dalle proprietà

chimico-fisiche dell’agente chimico, dall’esposizione e dalla sensibilità del sistema biologico.

Particolarmente importante è anche la via di assunzione della sostanza. Le più importanti vie

attraverso cui gli agenti tossici hanno accesso nell’organismo animale sono: il tratto intestinale, i

polmoni, la pelle o le branchie nel caso dei pesci.

Il compartimento ambientale più esposto all’inquinamento è quello acquatico: nelle acque, infatti, si

riversano un’ampia varietà di composti tossici sotto forma di effluenti zootecnici, scarichi di

processi industriali, rifiuti domestici.

L’inquinamento ambientale comprende composti di natura organica ed inorganica ma questa tesi

prende in considerazione esclusivamente alcuni aspetti dell’inquinamento inorganico dell’acqua.

1.2 PRINCIPALI INQUINANTI INORGANICI Le prime osservazioni di cancerogenesi indotta dall’esposizione cronica ad inquinanti inorganici, ed

in particolare ai metalli pesanti, risalgono alla fine dell’Ottocento; infatti proprio con l’avvento

dell’era industriale e dell’attività mineraria su larga scala si poté osservare una più ampia incidenza

di malattie associabili all’esposizione a diversi metalli tossici. D’altro canto non deve sorprendere il

fatto che i metalli siano naturalmente e ubiquitariamente presenti nel nostro ecosistema in quanto

sono stati e sono tuttora ampiamente utilizzati per gli scopi più diversi e, talora sconsideratamente,

rilasciati nelle acque, nel suolo e nell’atmosfera. Tuttora oltre il 90% dei rifiuti “tecnologici”, come

vecchi computer o elettrodomestici, finiscono in discarica per essere inceneriti o recuperati senza

trattamento, contribuendo così alla formazione di contaminanti ricchi di metalli pesanti.

Gli animali acquatici sono naturalmente esposti ad una grande varietà di metalli, la cui

concentrazione è governata da processi geochimici naturali e da attività antropogeniche. Questi

metalli comprendono sia elementi essenziali richiesti nei processi biologici, sia metalli non

essenziali o con funzioni biologiche sconosciute. I metalli pesanti sono anche definiti “metalli

traccia”, perché in condizioni fisiologiche sono presenti negli organismi viventi in quantità limitata.

Sono divisi in due classi: Zn, Cu, Mn, Mg e Co, a basse concentrazioni si comportano come

micronutrienti essenziali per la vita, e sono tossici solamente a concentrazioni elevate; la seconda

classe comprende Cd, Hg, Cr e Pb che non sembrano avere funzione biologica e risultano tossici

anche a basse concentrazioni. Ogni metallo è potenzialmente tossico, se presente a concentrazioni

sufficientemente elevate.

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Introduzione

La tossicità dei metalli è dovuta principalmente alla capacità di legarsi ai siti attivi degli enzimi che

contengono ossigeno, zolfo o azoto in forma di gruppi -OH, -COO-, -OPO3H-, -S-S-, -NH2, -NH-.

I metalli pesanti quali rame, zinco, cadmio, argento, mercurio, oro, nickel, cobalto non sono

biodegradabili, né possono essere metabolizzati in composti meno dannosi. La detossificazione da

parte degli organismi avviene attraverso il legame con la metallotioneina (agente chelante) o

attraverso il loro deposito in forma insolubile nei granuli intracellulari

Nel trattamento delle intossicazioni da metalli pesanti, gli organismi utilizzano sostanze chelanti

capaci di bloccare il metallo formando complessi stabili e idrosolubili, facilmente eliminabili per via

renale.

Le proprietà dell’agente chelante devono essere:

- affinità per il metallo superiore a quella del legante biologico

- capacità di raggiungere il sito di legame

- bassa tossicità del chelato a pH fisiologico.

Appare chiaro il rischio ambientale determinato dall’inquinamento inorganico e la necessità di

attuare campagne di monitoraggio e ricavare una classificazione dello stato della qualità ambientale

dei corpi idrici. Per fare ciò, quindi, bisogna eseguire delle determinazioni sulla matrice acquosa.

Questa tesi prenderà in particolare considerazione alcuni aspetti del monitoraggio dell’inquinamento

da parte di agenti inorganici delle acque di fiumi che scorrono in aree industrializzate.

La seconda parete della tesi riguarda i risultati relativi allo studio di biomarcatori dei metalli pesanti

in organismi vegetali. Tali organismi vegetali sono stati scelti tra i modelli più convenzonali solo in

fasi successive di questo lavoro si concentrerà l’attenzione su piante tipiche dell’ambiente

acquatico.

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Introduzione

1.3 INQUINAMENTO IN BACINI FLUVIALI EUROPEII problemi riguardanti il controllo dell’inquinamento e la gestione della qualità delle acque sono

stati troppo spesso rinviati o trascurati poiché considerati di secondaria importanza rispetto allo

sviluppo economico; questo si è verificato anche in presenza di alti livelli d’inquinamento,

trascurando l’evidente l’impatto ambientale.

Nei vecchi trattati non erano presenti accordi internazionali relativi all’impatto degli inquinanti sui

bacini fluviali e venivano trascurate misure anti-inquinamento per il ripristino ambientale. E’ stato

accertato che gli sforzi unilaterali nel controllo dell’inquinamento sono insufficienti per la

prevenzione del deterioramento della qualità delle acque.

Ora, invece, alcuni trattati includono regolamentazioni riguardanti l’inquinamento delle acque, ma,

nonostante ciò, la maggior parte di essi manca di meccanismi istituzionali che contribuiscono a

diminuire l’impatto ambientale incontrollato sulla qualità dell’acqua.

Nei periodi di maggiore sviluppo dell’agricoltura moderna, della rivoluzione chimica e industriale,

dell’aumento della popolazione mondiale e della diffusione dell’urbanizzazione, la qualità

dell’acqua non è stato un fattore preso in considerazione nelle politiche internazionali. Persino dopo

che è stato notato un incremento degli inquinanti nelle acque, pericoloso non solo per l’ambiente ma

anche per l’uomo, il problema non è stato adeguatamente considerato; infatti, i dispositivi di

monitoraggio erano rudimentali e la raccolta di dati limitata. Inoltre, gli interessi economici nei

campi dell’industria e dell’agricoltura hanno ostacolato l’uso di nuove tecnologie per il ripristino

ambientale. Kovacs (1986) descrive l’inquinamento dei fiumi come un problema ambientale dovuto

non solo agli scarichi industriali inquinanti e ai riversamenti accidentali, ma anche a tutte le sorgenti

non puntiformi d’inquinamento come l’urbanizzazione, la deforestazione, l’erosione e l’agricoltura

intensiva.

Non appena l’economia nei campi dell’alta

tecnologia, dei servizi finanziari, delle

telecomunicazioni, dell’industria ricreativa e del

turismo è diventata di maggior interesse rispetto a

quella dell’agricoltura e dell’industria tradizionale,

i principali inquinanti hanno cominciato a perdere

molto del loro impatto e ad essere sostituiti da altri.

Contemporaneamente, in tutto il mondo, i

movimenti ambientalisti sono diventati una forza

politica sempre più potente. Gli articoli scientifici, che hanno mostrato i pericoli dovuti

all’inquinamento delle acque, hanno suscitato una forte preoccupazione a livello pubblico; questo è

stato di rilevante importanza per evidenziare la necessità di applicare misure anti-inquinamento per

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Introduzione

la tutela dei fiumi. Il risultato di queste considerazioni è stato la messa a punto di sistemi più

sofisticati per studiare l’entità dell’inquinamento e le cause che l’hanno determinato.

La sensibilità per l’inquinamento si è dimostrata più sentita nelle società postindustriali altamente

sviluppate dove le misure anti-inquinamento abbracciano non solo il monitoraggio, ma anche

l’inizio di una politica di sostenibilità.

I riversamenti di oli e di sostanze chimiche, le conseguenti morie di pesci, gli effetti devastanti della

siccità e delle inondazioni hanno influenzato notevolmente il rifornimento d’acqua. L’opinione

pubblica, stimolata dai mass-media e dalle notizie riguardanti i disastri ecologici, ha suscitato una

presa di coscienza da parte dei Governi. Il livello economico degli USA, dell’Europa e del

Giappone, consente ai Governi di finanziare progetti per il controllo e il ripristino della qualità

dell’acqua nei propri bacini e in quelli dei paesi confinanti. Le agenzie regionali e le istituzioni

internazionali forniscono supporti per progetti nei paesi più poveri.

1.4 FONTI DI INQUINAMENTO DA METALLI PESANTIL'agricoltura : le trasformazioni più importanti dell’agricoltura europea si sono verificate a partire

dal Settecento, e sono culminate nel corso degli ultimi 100 anni con l’impiego di sostanze

concimanti chimiche, di fertilizzanti, di macchinari per dissodare e proteggere le terre dall’erosione.

Molte sostanze di natura organica e inorganica sono utilizzate e riversate direttamente, o

indirettamente attraverso il terreno, nei corsi d'acqua.

Si sono verificati numerosi problemi dovuti all’inquinamento dei fiumi, soprattutto nei paesi dove

l’agricoltura e l’allevamento sono intensivi, tra cui l’Inghilterra, l’Olanda, la Germania e l’Italia con

particolare riferimento alla pianura Padana.

L'attività industriale : le industrie di base che caratterizzano i paesi industrialmente più sviluppati,

sono quelle energetica, estrattiva, siderurgica e chimica che favoriscono lo sviluppo d’industrie

come la metallurgica, la meccanica, la cementiera, la petrolchimica, la cartaria, la cantieristica,

l’elettrica e l’elettronica, quella delle materie plastiche, delle fibre sintetiche, di materiali da

costruzione, dei mezzi di trasporto, la farmaceutica e molte altre. Questi tipi d’industrie favoriscono

le immissioni di sostanze nocive nell’ambiente acquatico, in particolare metalli pesanti o sostanze

organiche non biodegradabili.

L’urbanizzazione : le città, in seguito all’industrializzazione, sono diventate il centro del sistema

economico, richiamando buona parte della popolazione e dando vita al fenomeno

dell’urbanizzazione.

Questo processo ha cambiato radicalmente non solo le dimensioni della città, ma, soprattutto, le

funzioni e l’aspetto degli spazi urbani che sono diventati il simbolo della civiltà contemporanea.

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Introduzione

Questo fenomeno assume grande importanza quando occorre valutare l’inquinamento, poiché la

popolazione contribuisce ad immettere sostanze nocive, inorganiche ed organiche, nell’ambiente,

non solo con le attività agricole e industriali, ma anche con quelle domestiche.

Il recupero ambientale dei fiumi è considerato un obiettivo importante per la salute dell’uomo e per

il recupero delle attività ricreative.

1.5 BIOMARCATORILa volontà di sviluppare metodi di biomonitoraggio più efficaci e rapidi rispetto ai tradizionali test

di mortalità e riproduzione e la recente evoluzione delle tecniche di biologia molecolare, ha portato

la ricerca verso lo studio di nuovi indicatori biologici: i biomarcatori. In accordo con van Gestel e

van Brummelen (1996), un biomarcatore è definito come “ogni risposta biologica ad un prodotto

ambientale, ritrovata ad un livello biologico inferiore a quello dell’individuo. Questa risposta deve

essere misurata in un organismo o il suo prodotto e ne indica un cambiamento rispetto allo stato

normale. Questa risposta non deve essere trovata in un organismo sano”. Un biomarcatore

rappresenta quindi un indice dell’impatto o della presenza di uno xenobiota nell’organismo e si

manifesta attraverso specifici cambiamenti molecolari, biochimici, fisiologici, istologici e

morfologici nella popolazione animale e vegetale.

1.5.1 Definizione di biomarcatoreLa National Academy of Science statunitense definisce biomarcatore “quella variazione, indotta da

un contaminante, a livello delle componenti biochimiche o cellulari, che può essere misurata in un

sistema biologico”.

Il concetto si è evoluto e oggi il biomarcatore può essere definito come “la variazione di una risposta

biologica (biochimica, molecolare, cellulare, fisiologica o comportamentale) che può essere

correlata all’esposizione e/o all’effetto tossico di composti inquinanti” (Peakal et al., 1994). Esso

può includere ogni tipo di parametro misurabile nei fluidi biologici, in cellule, tessuti o animali, che

riflette un’interazione tra un sistema biologico ed un potenziale insulto chimico, fisico, biologico.

E’ impossibile monitorare tutti i contaminanti di origine antropogenica e naturale che possono

rappresentare un potenziale pericolo per l’ambiente. Un metodo utile per valutare l’inquinamento

dell'ambiente acquatico consiste nell'esame di risposte biochimiche che riflettono gli effetti dei

contaminanti sugli organismi esposti a tali sostanze (McCarty e Shugart, 1990). L’idea di utilizzare i

biomarcatori nel settore delle indagini ecotossicologiche è nata negli anni ’70 con ricerche in

ambiente marino e negli ultimi decenni ha trovato applicazione anche in altre differenti situazioni

ambientali.

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Introduzione

1.5.2 Classificazione dei biomarcatoriI biomarcatori possono essere suddivisi in tre classi:

- biomarcatore d’esposizione: la risposta di un organismo che indica l’esposizione a un composto

chimico o a una classe di composti, ma che non fornisce nessuna indicazione dei reali effetti

tossicologici sull’organismo.

- biomarcatore d’effetto: è una modificazione biochimica o fisiologica, misurabile in un tessuto o in

un fluido corporeo, associata ad un possibile o effettivo stato di malattia.

- biomarcatore di suscettibilità: si riferisce all’innata o all'acquisita capacità di un organismo a

rispondere ad una specifica sostanza xenobiotica.

I biomarcatori di esposizione rivelano la presenza di xenobiotici o dei loro metaboliti quindi

possono essere utilizzati per confermare o stimare l’esposizione di individui o popolazioni ad una

particolare sostanza, fornendo un legame tra esposizione esterna e dose interna.

I biomarcatori d’effetto valutano la risposta dell’organismo e possono essere utilizzati per

documentare effetti avversi dovuti all’esposizione e all’assorbimento di una sostanza chimica.

Generalmente i biomarcatori d’effetto più sensibili sono rappresentati da alterazioni nei livelli e

nell’attività degli enzimi di biotrasformazione che nei pesci possono essere indotti o inibiti

dall’esposizione a xenobiotici (Bucheli et al., 1995). Infatti, parallelamente all’effetto negativo della

sostanza tossica, nell’organismo esposto si sviluppano delle risposte adattative che tendono a

riportare il sistema ad uno stato di omeostasi. In particolare le risposte a livello molecolare tendono

a diminuire l’effetto tossico del composto inquinante, grazie all’induzione di sistemi multienzimatici

o di proteine di legame, come le metallotioneine.

In base alla loro specificità di risposta nei confronti di composti inquinanti, i biomarcatori possono

essere specifici oppure generali.

I biomarcatori specifici rappresentano l’insieme delle risposte molecolari e biochimiche che si

realizzano in seguito all’esposizione ad una specifica classe di contaminanti (es. l’induzione delle

metallotioneine da parte dei metalli e l’inibizione della colinesterasi dovuta all’azione specifica di

alcuni pesticidi) e che permettono in questo modo di risalire al responsabile della contaminazione e

in pochi casi ad uno specifico contaminante.

I biomarcatori generali rappresentano risposte dell’organismo a livello molecolare, cellulare e

fisiologico che non possono essere ricondotte ad un inquinante in particolare, ma rappresentano uno

stato generale di stress dell’organismo (es. danni al DNA).

I biomarcatori molecolari forniscono informazioni circa le risposte degli organismi a livelli di

organizzazione biologica molto bassi, offrendo quindi la possibilità di ottenere indicazioni

tempestive e sensibili dell’influenza dei tossici su tali sistemi. Inoltre questi biomarcatori hanno un

ruolo importante anche nel controllo e nella valutazione dell’efficacia dei mezzi di recupero

ambientale poiché facilmente misurabili in diverse specie durante le fasi di bonifica.

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Introduzione

1.5.3 Biomarcatori come integrazione ai metodi di analisi classiche nel monitoraggiodella qualità delle acqueIl crescente inquinamento dell’ambiente acquatico rappresenta oggi una grave minaccia per gli

organismi acquatici. Per questo motivo il monitoraggio continuo è essenziale per valutare la qualità

delle acque e per mettere a punto delle strategie mirate alla conservazione ed al ripristino

dell’ecosistema.

I contaminanti organici sono caratterizzati da un’elevata persistenza, quindi, anche se presenti a

basse concentrazioni, tendono ad accumularsi e a concentrarsi lungo la catena alimentare nell’arco

degli anni successivi (Stegeman et al., 1994).

Questa osservazione suggerisce che i metodi di monitoraggio chimici che forniscono dati puntiformi

sullo stato di salute dell’acqua (Stegeman et al., 1994) devono essere integrati con metodi biologici

di biomonitoraggio che consentono un controllo continuo nel tempo. L’applicazione della chimica

ambientale classica permette la definizione dei livelli di inquinamento e di bioaccumulo dei

contaminanti più conosciuti, mentre l’utilizzo dei biomarcatori permette di valutare l’esposizione a

livelli di contaminazione superiori alle nomali capacità di compensazione e riparazione

dell’organismo (Viganò et al., 1998; Fossi, 1991). Tutto questo ha lo scopo di individuare le risposte

di adattamento degli organismi esposti, per evitare che avvengano cambiamenti strutturali, che

compaiano malattie o che si verifichino migrazioni della popolazione.

I biomarcatori sono particolarmente utili anche per studiare livelli di inquinamento negli ecosistemi

sottoposti a una miscela di composti ignoti, o parzialmente noti, tipica dell'ambiente acquatico.

Essi forniscono una misura dello stress in corso nell’organismo e una risposta immediata

all’esposizione del tossico, prima del verificarsi di effetti deleteri.

La valutazione degli effetti degli inquinanti sulle comunità naturali è un problema di difficile

soluzione per vari motivi:

- esistono diverse possibili vie di assunzione nell’organismo, anche in funzione dei diversi ecosistemi

(terrestri o acquatici);

- gli inquinanti presentano una diversa biodisponibilità secondo i comparti ambientali in cui si

trovano;

- gli organismi sono generalmente esposti ad una miscela di sostanze che possono generare diverse

interazioni biochimiche e tossicologiche;

- esiste un periodo di latenza, che può essere molto lungo, prima che si manifestano alterazioni a

livello di comunità.

Le correnti metodologie di indagine, quali ad esempio le analisi di chimica ambientale e i saggi di

tossicologia classica, risultano in molti casi inadeguate allo studio di problemi di tale complessità.

L’applicazione dei biomarcatori nei programmi di biomonitoraggio risolve totalmente o in parte le

limitazioni indicate sopra.

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Introduzione

I principali vantaggi legati all’utilizzo dei biomarcatori sono:

- un’elevata sensibilità alle sostanze lipofile nocive;

- una risposta integrata dell’esposizione della specie scelta come bioindicatore, tenendo conto, entro

un determinato ambito spaziale, sia delle diverse vie di assunzione sia delle esposizioni nel tempo;

- una risposta integrata dell’insieme delle interazioni tossicologiche della miscela di composti alla

quale è sottoposto l’organismo;

- una risposta immediata all’esposizione al tossico che può essere impiegata per prevederne gli effetti

a lungo termine.

Per questi motivi i biomarcatori permettono di contribuire efficacemente alla risoluzione di

problemi dovuti al bioaccumulo.

I principali limiti sono:

- la relazione dose-effetto è spesso di difficile interpretazione a causa dei fattori mascheranti od

inibitori che possono interferire con l’induzione del biomarcatore;

- spesso possono risentire di alcuni fattori di disturbo, come eccessivi scarichi industriali, che

modificano le reazioni enzimatiche in funzione dello stato ormonale, dell’età e del sesso

dell’organismo.

In questi casi le risposte biochimiche possono subire alterazioni di tipo inibitorio che modificano i

dati ottenuti dalle analisi.

1.5.4 Progettazione di protocolli del biomonitoraggioRecentemente è stata sottolineata la grande importanza della programmazione di protocolli di

monitoraggio biologico basati sui biomarcatori. Lo studio di tali protocolli, per monitorare la qualità

dell'acqua dei fiumi europei a maggior rischio di inquinamento, costituisce il tema principale di

questa tesi. In un protocollo di monitoraggio è indispensabile considerare le caratteristiche dei

biomarcatori come la sensibilità, la correlazione tra contaminante e risposta, la specificità della

risposta stessa, la facilità di misurazione e i costi economici. Devono poi essere presi in

considerazione alcuni parametri ambientali come un'area contaminata e una di controllo

caratterizzata da una buona qualità ecologica, basandosi su precedenti analisi chimico-fisiche

effettuate sulle componenti abiotiche. E’ necessario definire, per ogni campionamento, la

periodicità, il numero di campioni statisticamente sufficienti, i metodi di campionamento più

affidabili e paragonabili nelle aree di interesse. Devono infine essere selezionati i bioindicatori ed i

biomarcatori di esposizione e di effetto più sensibili ai parametri da valutare.

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Introduzione

1.5.5 Il pesce come biondicatore I pesci sono organismi particolarmente esposti alle acque inquinate dei fiumi e sono in grado di

accumulare le sostanze nocive nei loro tessuti adiposi a causa della natura lipidica delle loro

membrane. La risposta dei sistemi enzimatici di biotrasformazione dei pesci esposti a condizioni di

inquinamento è conosciuta e le tecniche in proposito sono state standardizzate. L’induzione di

mono-ossigenasi nei pesci rappresenta un efficace biomarcatore per i contaminanti presenti

nell’ambiente acquatico.

Queste osservazioni suggeriscono che i pesci possono essere utilizzati come strumenti di

bioaccumulo per identificare rapidamente le aree inquinate. I dati che si ottengono da questi tipi di

analisi possono permettere di valutare non solo il rischio ecologico, ma anche quello umano.

Come bioindicatore negli studi di monitoraggio è stato scelto il pesce con particolare riferimento al

cavedano, all’abramide comune e alla carpa. La scelta del pesce è dovuta al fatto che si tratta di un

indicatore primario dello stato di salute ecologico; infatti appartiene all’apice della piramide trofica.

L’utilizzo di specie selvatiche nei programmi di screening degli agenti inquinanti è limitato dalla

natura mobile dei pesci. Tali limitazioni possono essere eliminate utilizzando pesci di allevamento

portati nei siti di monitoraggio.

I biomarcatori utilizzati appartengono all’ordine dei Cipriniformi comprendente numerose specie di

pesci, che vivono essenzialmente in acque dolci.

Si distinguono tre gruppi minori, interpretabili come sottordini: Characoidei, Gymnotoidei,

Cyprinoidei. Solo il terzo di questi annovera rappresentanti nella fauna europea. Si conoscono circa

250 generi e 2500 specie. La fauna europea include due famiglie: Cyprinidae, Cobitidae.

I Ciprinidi sono forse la famiglia di pesci più numerosa. Notevole è la varietà dei caratteri eco-

etologici. Alcuni Ciprinidi sono bentonici, altri nectonici, alcuni preferiscono le acque correnti, altri

ancora le acque ferme o a lento corso. Il regime alimentare è per lo più onnivoro. I Ciprinidi

presentano una rilevante importanza pratica: molti di essi sono commestibili, anche se di solito sono

poco pregiati.

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Introduzione

1.5.6 Aree oggetto di studio Il lavoro di biomonitoraggio è stato svolto nel fiume Lambro e nel fiume Amstel. Questi due fiumi

sono stati scelti perché particolarmente rappresentativi per quanto riguarda l’alterazione dei

parametri ambientali dovuta ad immissione di contaminanti di tipo industriale ed agricolo.

Per ogni fiume sono stati individuati determinati siti a seconda delle condizioni ecologiche del

fiume stesso. In particolare sono stati scelti tre siti per ogni fiume: uno di riferimento (non

inquinato), uno inquinato e uno con livelli di inquinamento intermedi. Le specie oggetto di analisi

sono state selezionate in funzione della situazione contingente.

Per il biomonitoraggio delle acque del fiume Lambro è stato utilizzato come bioindicatore il

Leuciscus cephalus (cavedano comune) in quanto questa specie è

ben rappresentata nel tratto di fiume scelto come area di studio.

Al fine di rilevare le variazioni dei livelli degli xenobiotici e le più

importanti caratteristiche del cavedano comune nei diversi siti e nei

diversi periodi, sono state effettuate cinque campagne di

biomonitoraggio.

Nelle prime tre campagne sono stati monitorati tre siti:

- Merone sito pulito

- Canonica sito ad inquinamento intermedio

- Brugherio sito inquinato

Merone è stato scelto come sito di riferimento perché la sua posizione più a monte permette di avere

una migliore qualità delle acque. La scelta degli altri due siti è stata fatta sulla base di dati storici e

su conoscenze inerenti all’urbanizzazione e all’industrializzazione di queste aree. La scelta dei siti è

stata obbligata dal fatto che oltre il limite di Brugherio vi è un cambiamento repentino della qualità

dell’acqua che rende impossibile il reperimento dei pesci; mentre nei siti più puliti a monte di

Merone non sono disponibili Ciprinidi, ma solo Salmonidi. La possibilità di un biomonitoraggio

basato sui biomarcatori in questi siti è quindi da escludere.

Sulla base dei dati ottenuti con i parametri biologici classici, le analisi chimiche e i dati sui

biomarcatori delle prime campagne di monitoraggio, si è concluso che la qualità dell’acqua nel sito

di riferimento non era ottimale e che la situazione dei siti di Canonica e Brugherio era molto simile

e per questo motivo si è pensato, per gli esperimenti in gabbia, di ridurre a due i siti di

biomonitoraggio: Merone e Brugherio.

Per il biomonitoraggio dei fiumi olandesi e tedeschi sono stati scelti

come bioindicatori l’Abramis brama (abramide), prelevato dal fiume

allo stato libero, e il Cyprinus carpio (carpa) mantenuto in gabbia nei

siti oggetto di studio.

12

Introduzione

La scelta dei siti è stata fatta sulla base dei diversi tipi di

inquinanti che si riversano nelle acque del fiume. Molte

informazioni in questo senso sono state ottenute tramite

le indagini sulla macrofauna che fornisce soprattutto dati

sulla variabilità delle specie e degli habitat.

1.6 METALLI PESANTI E ORGANISMI ACQUATICII metalli pesanti sono elementi con densità superiore a 5 g/cm3, che sono presenti nei tessuti in

concentrazioni di “tracce”; in relazione alla loro azione possono essere distinti in essenziali, non

essenziali e tossici. La classificazione è spesso ambigua poiché anche un elemento essenziale può

essere tossico se supera certe concentrazioni o se si hanno alterazioni dei meccanismi omeostatici.

Alcuni metalli pesanti considerati soltanto per la loro nocività sono comunque sospettati di svolgere

anche un ruolo biologico. I metalli pesanti essenziali comprendono in particolare lo zinco e il rame

quali importanti cofattori di metallo-enzimi, mentre cadmio, mercurio e piombo sono noti

soprattutto per la loro tossicità.

Sono ancora scarsi gli studi sui meccanismi di assorbimento di metalli presenti in tessuti di pesci e

molluschi.

Gli animali acquatici sono naturalmente esposti a varietà di metalli le cui forme chimiche e

concentrazioni sono governate da processi geochimici naturali e da attività antropogeniche. Questi

metalli includono sia gli elementi essenziali richiesti per supportare i processi biologici, sia i metalli

non essenziali con funzioni biologiche non note. I metalli come lo zinco, il rame, il cadmio, il

mercurio, l’argento, il nichel ed il cobalto sono presenti nell’ambiente in quantità generalmente

bassa, essendo sequestrati maggiormente nei sedimenti e nei giacimenti minerari, ma per effetto

antropico possono essere accumulati nei tessuti degli organismi viventi. La tossicità dei metalli può

essere attribuita alla loro disfunzione e all’interazione con strutture cellulari inappropriate.

Una volta entrati nell’organismo, i metalli sono generalmente tossici se si trovano nella cellula in

forma libera. Essi non subiscono biotrasformazione e la tolleranza biologica nei loro confronti non

può essere realizzata, come nel caso delle sostanze organiche, da processi di demolizione in prodotti

meno tossici. Pertanto la loro omeostasi è correlata a meccanismi molecolari adibiti al trasporto ed

al deposito di metalli in forma non tossica. Questi meccanismi sono rappresentati dalle

metallotioneine (MT), proteine a basso peso molecolare in grado di fornire complessi con i metalli

pesanti. Le MT sono particolarmente abbondanti nei tessuti parenchimatosi (fegato e rene) e sono

presenti anche in altri tipi di tessuti e tipi cellulari .

13

Introduzione

1.6.1 Regolazione dei metalli L’ambiente acquatico a differenza di quello terrestre è caratterizzato da una grande variabilità di

parametri chimici e fisici. All’interno degli organismi marini, il mantenimento dell’omeostasi

cellulare è fondamentale. In particolare gli organismi acquatici devono mantenere una

concentrazione ionica intracellulare costante e compatibile con i processi biochimici e fisiologici,

pur vivendo immersi in un mezzo le cui caratteristiche ioniche e spesso osmotiche possono risultare

abbastanza diverse.

I metalli pesanti possono essere disciolti nell’ambiente acquoso o presentarsi adsorbiti su materiale

articolato e possono essere assorbiti dalle branchie e/o dal canale digerente. L’iniziale assorbimento

sulla superficie cellulare è seguito dal successivo trasporto attraverso la membrana plasmatica. I

metalli, una volta all’interno della cellula, possono legarsi a specifiche proteine citosoliche ed essere

accumulati come metalloproteine.

Gli sforzi per individuare il modello generale di risposta ai metalli negli animali acquatici sono

complicati dall’ampia diversità delle specie.

Oggi è di particolare interesse il monitoraggio attraverso bioindicatori. Esistono organismi modello,

come la trota, che possono essere impiegati come indicatori dell’inquinamento da metalli pesanti

rispettivamente negli ecosistemi terrestri e di acqua dolce (Morris, 1999).

Molto interessanti per lo studio dei meccanismi coinvolti nella detossificazione risultano non solo le

specie che vivono in ambienti fortemente inquinati, ma anche quelli sottoposti a un minimo livello

di contaminanti.

Schema generale per l’assorbimento, traslocazione, accumulo e rilascio dei metalli in animali acquatici.

14

Sangue/emolinfa

Reni

Intestino

Fegato

Cibo

Interno

Esterno

Branchie

Acqua

Introduzione

Una volta assorbiti attraverso le barriere epiteliali delle branchie o i sistemi digestivi, i metalli sono

distribuiti all’interno degli organi e sono rilasciati dagli organismi attraverso meccanismi di

escrezione (Roesijadi, 1992).

Le branchie, il tratto digestivo e la superficie epiteliale rappresentano i siti di assorbimento dei

metalli, che attraverso il sangue e l’emolinfa sono successivamente trasportati agli organi interni per

l’utilizzazione, il deposito e il rilascio.

La speciazione chimica dei metalli nei sistemi acquatici è dipendente da specifici fattori chimico-

fisici che prevalgono in un ambiente. Fattori come la salinità, composti organici dissolti, pH,

durezza, e carico sedimentario influenzano le forme chimiche prevalenti di metalli nei sistemi

acquatici e influenzano la biodisponibilità dei metalli e la loro tossicità.

Forme di particolato includono quelle assorbite minerali sospesi e particelle organiche. Le forme

chimiche solubili includono semplici ioni metallici di animali acquatici, complessi ioni metallici

con legandi organici come ammine, acido fulvico, acido umico.

Perciò, l’effettiva esposizione di individui non è determinata dalla concentrazione totale del metallo

in un particolare ambiente, ma dalle concentrazioni delle forme chimiche individuali. Queste non

sono ugualmente biodisponibili e gli effetti di una singola specie di metallo possono avere

importanza maggiore chiarendo la risposta biologica rispetto alla concentrazione totale del metallo.

I metalli legati alle particelle sono spesso ingeriti dagli organismi acquatici in associazione con il

cibo. Il tratto digestivo degli invertebrati generalmente manca di condizioni fortemente acide che

aiutano a solubilizzare metalli in condizioni extracellulari. L’endocitosi di particelle di cibo e la

digestione attraverso i lisosomi giocano un ruolo importante nella trasformazione delle particelle

metallo-associate e i metalli possono essere solubilizzati dall’attività lisosomale.

Ci si potrebbe aspettare che i metalli dissolti siano assorbiti attraverso le superfici del corpo

esposte, come le branchie. I metalli particolati sono più comunemente ingeriti e quindi assorbiti

dopo solubilizzazione nell’intestino. Possono anche essere fagocitati e solubilizzati in vesciche

fagocitotiche in vescicole endocitotiche. E’ noto che l’endocitosi è usata dagli invertebrati per

l’assorbimento di materiali dall’ambiente (McLusky et al., 1978).

Le cellule digestive di molti invertebrati sono in grado di effettuare la fagocitosi e la digestione

intracellulare di particelle di cibo. Inoltre, anche gli organi esterni, come le branchie, sono in grado

di fagocitare le particelle dell’ambiente. I metalli associati con particelle possono essere accumulati

attraverso meccanismi endocitotici in varie specie di invertebrati (McLusky et al.,1978).

15

Introduzione

L’assorbimento dei metalli negli animali acquatici implica il trasferimento dei metalli al sistema

circolatorio attraverso le branchie, il sistema digestivo o la superficie epiteliale. Questo

trasferimento lungo le cellule epiteliali include tre elementi basilari:

- l’assorbimento attraverso la membrane apicale, l’interfaccia con l’ambiente esterno

- il movimento attraverso le cellule e l’interazione con i ligandi intracellulari

- l’efflusso attraverso la membrana basolaterale, l’interfaccia del sistema circolatorio (Verbost et al.,

1989).

Gli organi deputati all’assorbimento (branchie, intestino, ghiandole digestive) tendono inoltre a

concentrare i metalli e perciò presentano un potenziale relativamente alto per il bioaccumulo.

Di particolare interesse sono le strategie di disintossicazione messe in atto dagli organismi acquatici

per neutralizzare concentrazioni troppo elevate di metalli pesanti: un meccanismo comune prevede

la produzione di granuli contenenti elevate quantità di questi elementi in forma insolubile, quindi

meno dannosa, e la loro escrezione nelle urine quando gli organismi sono dotati di reni ben

sviluppati. Un ruolo fondamentale nella disintossicazione è quello attribuito alla metallotioneina,

una proteina a basso peso molecolare ricca di cisterna, ubiquitaria nel mondo animale, in grado di

complessare sette ioni di metallo bivalente per molecola. L’espressione delle MT è indotta in

seguito all’esposizione dell’organismo ad elevate concentrazioni di metalli pesanti e costituisce una

difesa rapida ed efficiente da parte degli organismi viventi all’esposizione indesiderata ai metalli

tossici come il cadmio. La sintesi della metallotioneina può essere indotta non soltanto dai metalli

pesanti, ma anche in risposta a stimoli quali il digiuno, stress fisici ed infiammatori, infezioni,

endotossine, glucocorticoidi, raggi X.

Il fatto che la metallotioneina sia influenzata dallo stato fisiologico complessivo dell’organismo

depone a favore dell’idea che la vuole protagonista di una funzione regolatrice più generale della

semplice disintossicazione da metalli pesanti. In circa 80 specie di pesci ed invertebrati acquatici

sono state isolate proteine con le caratteristiche tipiche della metallotioneina, tuttavia tra queste solo

per poche specie si è giunti a un livello strutturale. Gli organi eletti per la sintesi della

metallotioneina sono i reni, le branchie ed il fegato. Poiché esiste una forte correlazione fra

l’esposizione a metalli pesanti, il loro accumulo e l’induzione di metallotioneina, questa proteina è

stata proposta come un utile biomarcatore per studi di ecotossicologia degli animali acquatici al fine

di comprendere il grado di esposizione di questi organismi ai metalli pesanti nel loro ambiente

naturale (Carpenè et al., 1995).

I pesci d’acqua dolce, come i teleostei, hanno una salinità nei fluidi corporei maggiore rispetto a

quella dell’ambiente (iperosmotici) e tendono ad assumere acqua dalle branchie per osmosi e ad

eliminarla in grande quantità attraverso l’urina, mentre le cellule situate nelle branchie assorbono i

sali disciolti nell’acqua. I teleostei di acqua salata presentano una salinità nei fluidi minore rispetto

a quella dell’ambiente (ipoosmotici) e tendono a perdere acqua per osmosi attraverso un trasporto

16

Introduzione

attivo di ioni che ha luogo in complessi sistemi cellulari e paracellulari. La diversa morfologia

dell’epitelio branchiale orienta nei pesci d’acqua dolce un flusso netto di NaCl verso l’interno, e in

quelli d’acqua salata verso l’esterno. L’epitelio svolge quindi un ruolo fondamentale nei processi di

regolazione iono-osmotica dei teleostei. L’enzima chiave in questi processi è la (Na+, K+)-ATPasi,

considerata una vera e propria pompa ionica, che trasporta contro gradiente di concentrazione fuori

dalla cellula 3 ioni Na+ e all’interno 2 ioni K+ con idrolisi di una molecola di ATP.

Nei pesci d’acqua salata l’attività dell’enzima nelle branchie è più elevata rispetto ai pesci d’acqua

dolce. Tra le strategie adottate per raggiungere l’omeostasi ionica ed osmotica le ATPasi attivate da

cationi monovalenti sembrano rappresentare il fulcro comune. Infatti nei tessuti osmoregolatori

(branchie, reni, intestino) di varie specie eurialine (Ventrella et al., 1993), le attività enzimatiche e

una seconda ATPasi sono state individuate nella frazione esterna, il plasmalemma. Spesso in tessuti

della stessa specie sono state rilevate attività diverse delle due ATPasi come pure differenti rapporti

reciproci. Il coinvolgimento e la regolazione ionica ed osmotica suggerisce che le due attività

enzimatiche abbiano compiti distinti e/o complementari nei processi di regolazione ionica-osmotica

degli animali acquatici in dipendenza della specie e del tessuto considerato e della salinità

ambientale.

Osmoregolazione in un pesce marino e in un pesce di acqua dolce

17

ioni acqua

diffusione attraverso la pelle diffusione attraverso la pellesecrezionetrasporto attivo

cibocibo

urina concentrataurina diluitadiffusione attraverso le branchie diffusione attraverso le branchie

acqua di mare

ACQUA DOLCE ACQUA SALATA

Introduzione

1.6.2 Metabolismo dello zinco e del rame nei teleosteiNonostante il metabolismo di questi elementi sia stato estesamente studiato nei mammiferi, si è

lontani da una completa comprensione dei processi molecolari coinvolti nelle strutture zinco e rame

dipendenti, soprattutto per gli organismi acquatici. Negli animali acquatici rispetto a quelli terrestri

vi è un ulteriore complicazione in quanto parte dei metalli può venire assorbito attraverso le

branchie. A tal riguardo risulta difficile dosare la concentrazione del metallo nell’acqua, in

particolare in quella di mare, conoscerne la speciazione e i meccanismi di trasporto che spesso

dipendono dalla specie chimica. Fattori come il pH, la concentrazione del calcio e la salinità

dell’acqua di mare, la temperatura e l’ossigeno disciolto sono i principali parametri che ne

influenzano l’assorbimento. Si può ipotizzare la presenza di un trasporto attivo per certe forme

ioniche, mentre dei metallocomplessi apolari potrebbero facilitare la diffusione dell’elemento

attraverso la membrana cellulare (Simkiss, 1983). Il calcio sembra modificare i flussi di entrata

dello zinco attraverso le branchie alterando la loro permeabilità. Nella trota (Salmo trutta) il

trasporto dello zinco a livello delle branchie ha un andamento bifasico sia in acque dure che in

acque prive di calcio (Everall et al., 1989), con una prima fase rapida di circa 12 ore ed un più lenta

di 36 ore. Dati sulla cinetica di assorbimento indicano che il trasporto è collegato a fenomeni di

saturazione dovuti o a leganti o a “pori” selettivi, i dati a disposizione non permettono di stabilire

quale dei due meccanismi sia più probabile (Spry e Wood, 1988). Attraverso l’apparato digerente

vengono assorbiti sia i metalli presenti nella fase acquosa che quelli nella fase solida costituita

principalmente dalla dieta. Soltanto una parte dello zinco e del rame presente nell’alimento può

essere assimilata, e nuovamente è la specie chimica sotto cui questi elementi vengono somministrati

che determina le quote di metallo che attraverseranno la mucosa gastrointestinale. La

concentrazione di zinco nella dieta può a sua volta influenzare la digeribilità delle proteine: in trote

alimentate con mangime contenente 5 ppm di zinco la digeribilità saliva dal 66% al 98%. La carenza

di zinco probabilmente provoca una inibizione delle proteasi quali la carbossipeptidasi che è un

metalloenzima contenente zinco (Ogino e Yang, 1978).

La crescita di trote (Salmo gairdneri) raggiunge un livello stazionario quando vengono aggiunti 20

ppm di zinco nell’alimento, con rese che dipendono dalla specie chimica: Zn-SO4 - Zn NO3 - ZnCl2

(Satoh et al., 1987). I dati sulla capacità di accumulo di Zn nei diversi tessuti sono controversi,

comunque in alcuni teleostei i meccanismi omeostatici devono essere molto efficienti se Ovemell et

al. (1988) non hanno visto alcun effetto sul metabolismo dello zinco nel rombo alimentato anche

con dosi elevate di metallo. La presenza di acido fitico e fosfato tricalcico può ridurre notevolmente

la biodisponibilità dello zinco che deve essere aggiunto in eccesso. È evidente che il contenuto di

metalli nei tessuti è legato anche alla quota di elemento che viene escreto attraverso le branchie,

l’urina, la bile e l’apparato digerente. Quando Gasterosteus aculeatus viene trasferito da acque

ricche di zinco ad acque che ne sono prive, circa il 50% del metallo precedentemente assorbito viene

18

Introduzione

rilasciato nelle prime 4 ore. Con l’eliminazione dello zinco si osserva un contemporaneo ripristino

delle lesioni branchiali, determinate dall’esposizione a tale elemento (Mathiessen e Brafield, 1973).

Studi effettuati con radioisotopi dello zinco hanno evidenziato che la parte del metallo eliminata con

le urine è trascurabile mentre elevata è la quota di zinco che si trova nell’acqua interbranchiale.

Nelle feci, è stato trovato circa il 27% di tutto lo zinco somministrato con gli alimenti nonostante

l’alimento fosse stato completamente digerito, la percentuale trattenuta può essere compresa in

generale tra il 35% e il 59% (Hardy et al., 1987).

Il rene è uno dei tessuti più ricchi di zinco, ma il sospetto che tale fenomeno possa essere in qualche

modo legato ad una funzione escretoria sembra privo di fondamento. In carassi (Carassius auratus)

iniettati con zinco, è stato rilevato un aumento del metallo nel fegato mentre un aumento dello zinco

nella bile potrebbe indicare che questo organo è coinvolto nell’escrezione (Carpenè et al., 1989). In

carpe esposte al rame si è notato un aumento del metallo sia nelle branchie che nei visceri in

relazione alla sua concentrazione nell’acqua. Diversamente dallo zinco, non è stato evidenziato un

accumulo di rame quando dei pesci rossi venivano iniettati intraperitonealmente con questo

elemento (Carpenè et al., 1989). In Fundulus, l’assorbimento del rame attraverso le branchie cresce

con l’aumentare della salinità, anche se lo stress osmotico agisce in modo diverso dipendentemente

dall’età degli individui. In ambiente ipertonico è probabile che la quantità di rame che entra in

contatto con la mucosa intestinale aumenti e, di conseguenza, aumenti l’assorbimento del metallo

per diffusione passiva, attraverso il canale

alimentare (Bennett e Dooley, 1982). I

livelli di rame plasmatico possono

dipendere da quelli presenti nell’alimento

anche se in ricerche effettuate con trote

alimentate con dosi elevate di rame (oltre

500 ppm) non sono stati notati aumenti

significativi (Lanno et al., 1985). In altri

studi compiuti su Salmo gairdneri, sono

stati osservati ritmi di crescita analoghi, quando i pesci venivano nutriti con razioni contenenti

rispettivamente 15 e 150 ppm di rame (Knox et al., 1984). Nel pesce gatto (Ictalurus punctatus)

diete carenti di rame provocano la riduzione dell’attività della citocromo ossidasi e della

superossido dismutasi, due enzimi che contengono rame (Gatlin et al., 1986). Sia rame che zinco

possono provocare delle lesioni evidenziabili a livello istologico o molecolare che comunque

possono essere ridotte da periodi di esposizione a concentrazioni subacute. Non sembra che tra i due

metalli ci siano dei meccanismi di protezione vicendevoli indicando che l’adattamento è metallo

specifico (Dixon e Sprague, 1981). I teleostei hanno una discreta capacità di regolare la

concentrazione tissutale di rame attraverso l’escrezione a livello di diversi organi. Nella bile di trote

19

Introduzione

(Salmo gairdneri) alimentate con diete ricche di rame si nota un aumento del metallo, indice di

un’attiva partecipazione del fegato e della cistifellea nel metabolismo del rame (Knox et al.,1984);

rimane comunque importante il ruolo svolto dalle branchie. come è stato dimostrato da Anderson e

Spear (1980) in Lepomis gibbosus. Nelle anguille (Anguilla anguilla) l’adattamento alle variazioni

di salinità è preceduto da modificazioni nel contenuto delle cellule a cloruri; un fenomeno simile si

nota esponendo i pesci al rame. Sembra quindi che le cellule a cloruri non siano soltanto preposte

all’escrezione dei cloruri ma anche alla regolazione di metalli pesanti quali zinco e rame

(Matthiessen e Brafield, 1973). Le concentrazioni di zinco e rame non sono uniformi nei diversi

tessuti, indicando che le caratteristiche metaboliche del tessuto influenzano il contenuto in metalli

essenziali. Nell’ambito di uno stesso tessuto possono esserci delle variazioni significative di

elementi traccia. Il muscolo laterale dei teleostei ha una composizione caratteristica per tipo di fibre

muscolari (Carpenè et al., 1982) e può essere facilmente distinto in muscolo bianco e muscolo rosso,

quest’ultimo ha generalmente un contenuto superiore di rame forse legato ad un maggior contenuto

della citocromo ossidasi (Carpenè et al., 1990). Sempre nel muscolo dei pesci è stato riscontrato un

accrescimento per acquisizione di nuove fibre (Carpenè e Veggetti, 1981) che potrebbe influenzare

il profilo dello zinco che in questo organo gioca un ruolo fondamentale nella sintesi proteica; dati

preliminari ottenuti in esperimenti effettuati con il pescegatto (Ictalurus melas) sembrano

confermarlo. Infatti proprio nel periodo autunnale quando nel cefalo si osserva questo fenomeno, nel

pesce gatto si presenta un picco di zinco significativamente diverso dalle altre stagioni. Negli

animali eterotermi soggetti a cicli di crescita annuali lo zinco potrebbe funzionare da regolatore del

metabolismo in senso lato, attivandolo nei mesi caldi e inibendolo nel periodo invernale. Nell’uomo

con l’invecchiamento, la diminuzione dell’attività metabolica è collegata ad una diminuzione dello

zinco plasmatico. Ricerche effettuate su Pleuronectes platessa fanno ritenere che le concentrazioni

di zinco libero nel cervello potrebbero essere regolate da leganti specifici in accordo con

l’importanza della neurochimica di questo elemento (Prohaska, 1987) che sembra confermata dalla

presenza di zincoproteine nel cervello di mammiferi (Itoh et al., 1983). Alcuni risultati confermano

che nel cervello dei pesci questo metallo è mantenuto piuttosto costante e le concentrazioni sono

simili a quelle riportate per i mammiferi.

1.6.3 Metalli “tossici” (cadmio, mercurio, piombo) nei teleosteiIl metabolismo del cadmio è legato soprattutto a quello della metallotioneina che può essere

facilmente indotta nei tessuti parenchimatosi dei vertebrati. La tossicità del metallo varia molto da

specie a specie, il cadmio è a lungo termine accumulato nel rene che costituisce un organo bersaglio.

Nel pesce gatto le concentrazioni di metallo sono inversamente correlate al pH e al calcio dell’acqua

(Bentley P.J., 1991). L’assorbimento del cadmio attraverso il tratto digerente potrebbe essere

mediato da aminoacidi, come sembrano confermare dei risultati ottenuti nella carpa, Centropristis

20

Introduzione

striata (Fair e Stick, 1984). La facilità con cui questo elemento viene a localizzarsi nel rene e fegato

ha fatto rilevare alte concentrazioni in molte specie di organismi acquatici, pesci inclusi (Kay,

1985). Alcune caratteristiche chimiche del cadmio a volte “confondono” le strutture cellulari e

permettono che venga confuso con il calcio. Di conseguenza può interferire con il sistema

calcio/calmodulina dipendente, come è stato osservato in cellule (RTG-2) di Salmo gairdneri (Behra

e Gall, 1991). Nella carpa esposta al cadmio è stata osservata una conseguente diminuzione dello

zinco e dell’attività di metalloenzimi quali la fosfatasi alcalina (Ikeda et al., 1986). Quanto riportato

è sufficiente per indicare la pericolosità di questo elemento non soltanto per l’acquacoltura, ma

anche per la salute umana.

Il mercurio, diversamente dal cadmio, è stato oggetto di estese ricerche poiché è presente in

concentrazioni elevate nel muscolo e spesso come metilmercurio, che è alquanto neurotossico. È

considerato tra gli 11 elementi traccia più importanti quali inquinanti ambientali. Il mercurio

inorganico può indurre la sintesi di metallotioneina, ma nei pesci non sembra un buon induttore

(Barghigiani et al., 1989). Il metilmercurio attraversa facilmente le membrane cellulari inserendosi

nella frazione lipidica e alterando a livello del sistema nervoso centrale i meccanismi che regolano il

potenziale di membrana. L’accumulo del mercurio nei tessuti dei teleostei è spesso legato alle

dimensioni dell’animale. È evidente che una corretta legislazione, che regoli il contenuto di

mercurio nel pesci, deve tener conto di tutti questi aspetti metabolici. Purtroppo se sono ancora

carenti le conoscenze riguardanti il metabolismo di zinco, rame e cadmio, per il mercurio tale

osservazione è ancora più valida, poiché la maggior parte dei lavori si limitano a riportare soltanto le

concentrazioni tissutali di esemplari pescati mentre scarsi sono invece i dati sperimentali.

Concentrazioni letali di mercurio provocano delle alterazioni branchiali in Salmo gairdneri,

facilmente evidenziabili a livello istologico. Le lesioni subletali possono essere rivelate da

alterazioni di attività enzimatiche come riportato per Channa punctatus esposto a cloruro mercurico

(Sastry e Rao, 1982). Il selenio sembra svolgere un ruolo protettivo nei confronti del mercurio; è

quindi sempre interessante valutare oltre al contenuto di metallo tossico anche quello del selenio il

cui rapporto (Hg/Se) è comunque molto variabile (Ruiter, 1977).

Dei tre metalli tossici trattati (cadmio, mercurio e piombo) il piombo è senz’altro quello più diffuso

nell’ambiente a causa del suo ampio impiego da parte dell’uomo, in modo particolare come additivo

nei combustibili per i mezzi di trasporto. Il piombo è scarsamente solubile nell’acqua di mare,

si ritiene quindi che soltanto concentrazioni elevate siano dannose agli organismi acquatici;

Krajnovic Ozretic e Ozretic (1980) riportano comunque che cefali (Mugil auratus) esposti a 0,5

ppm di piombo presentano un continuo accumulo del metallo durante un periodo di 82 giorni;

inoltre si ha, dopo la seconda settimana, una inibizione del 40% della ALA-D (deidratasi dell’acido

delta aminolevulinico). Quando nitrato di piombo (0,5 ppm) viene aggiunto in acqua dolce, soltanto

21

Introduzione

una percentuale limitata (8%) si trova in forma ionica (0,04 ppm), comunque sufficiente a dare dei

fenomeni di accumulo come è stato dimostrato nel pesce rosso (Merlini e Pozzi, 1977).

E’ presente un’ampia letteratura che tratta le concentrazioni tissutali del metallo nei teleostei, ma

pochi sono i dati riguardanti il metabolismo.

1.6.4 Assorbimento epiteliale dei metalli dissolti

Le branchie (Roesijadi, et al.., 1989) e l’intestino (Schoenmakers et al., 1992) sono i siti

fondamentali per l’assorbimento dei metalli solubili negli ambienti acquatici. In alcuni invertebrati

anche la superficie corporea può essere un sito importante per l’assorbimento dei metalli solubili,

che non è basato sul trasporto attivo contro il gradiente di concentrazione.

Il rapido legame a ligandi intracellulari e l’efflusso di ioni metallici attraverso la membrana baso-

laterale (Schoenmakers et al., 1992) può diminuire il gradiente di concentrazione, e perciò la

necessità di meccanismi di trasporto attivo alla membrana apicale. La diffusione o il trasporto

facilitato sono le due modalità più probabili per l’assorbimento dei metalli solubili (Bobilya et al.,

1992). L’assorbimento dei metalli essenziali come Ca, Cu, Fe e Zn spesso coinvolge specifici

meccanismi; per esempio, i canali del Ca (Foulkes, 1989) e specifiche membrane trasportatrici per il

Fe e Cu (Percival et al., 1990) sono coinvolti nell’assorbimento di questi elementi. I metalli non

essenziali, importanti dal punto di vista tossicologico, come Cd e Hg, non sembrano avere

meccanismi di assorbimento specifici.

L’identificazione (Birkenmeier et.al, 1991) di proteine intestinali ricche in cisteina (CRIP) come

proteine trasportatrici di zinco nelle cellule epiteliali intestinali dei mammiferi (Hempe et al., 1992)

ha fatto nuova luce sui meccanismi intracellulari associati al trasporto transmurale dei metalli e

getta dubbi che la MT sia un trasportatrice intracellulare di metalli.

E’ stato proposto che CRIP lavori in associazione con la MT; questa può competere con CRIP in

virtù della sua induzione da parte dello Zn e della sua maggiore affinità per i metalli. Il legame dello

Zn alla MT tende a ridurre il legame a CRIP, ritardare il trasporto transmurale del metallo al sangue

ed aumentare la ritenzione del metallo nelle cellule intestinali. Queste osservazioni sono in linea con

un ruolo della MT nel sequestro dei metalli intracellulari piuttosto che nel trasporto dei metalli. Il

comportamento coordinato di CRIP e MT può regolare l’assorbimento dello zinco.

22

Introduzione

Modello per l’assorbimento dei metalli attraverso le branchie e le ghiandole digestive basate sul

comportamento di CRIP e MT durante l’assorbimento intestinale di Zn nei mammiferi. (M, metallo; ML,

complesso metallo-ligando non tioneinico; Th, apotioteina).

1.7 METALLOTIONEINELe metallotioneine (MTs) sono proteine a basso peso molecolare, solubili, ricche di gruppi

sulfidrilici, con una particolare sequenza amminoacidica, rappresentata da una distribuzione

caratteristica di residui cisteinici come Cis-X-Cis, Cis-Cis, Cis-XY-Cis, dove X e Y sono

amminoacidi diversi dalla cisteina (Kägi e Shaffer, 1988), che legano i metalli e svolgono la

funzione di regolazione dei metalli essenziali come Cu, Zn, e nella detossificazione di questi e di

metalli non essenziali come Cd e Hg (Roesijadi G.,1992).

La MT ha un’alta affinità e capacità di legame per i metalli pesanti

essenziali (Zn, Cu, etc) e non essenziali (Cd, Hg, Ag, etc.). Comunque,

la metallotioneina mostra diversa affinità per i cationi di metalli pesanti

(Viarengo, 1989). La MT non presenta elevata assorbanza a 280 nm, a

causa dell’assenza di amminoacidi aromatici, ma mostra tipica

asssorbanza per particolari interazioni di differenti cationi in metalli

tiolati (Cd=254 nm, Cu =272nm, Zn=212nm). Il ruolo delle MTs nel

sequestrare i metalli è ben noto e la loro induzione in seguito

all’esposizione ai metalli è associata alla protezione verso il metallo

tossico. Gli studi sulla regolazione dell’espressione genetica della

metallotioneina hanno stabilito che l’induzione da parte dei metalli è una risposta diretta

all’aumento della concentrazione intracellulare del metallo (Thiele, 1992).

La capacità di indurre la metallotioneina è maggiore nei tessuti attivi nell’assorbimento, accumulo

ed escrezione. Negli animali acquatici le metallotioneine sono state ben identificate nel piccolo

23

CRIP

M-CRIP

M-plasma proteina

Plasma proteina

InternoEsterno Cellula epiteliale

membrana basolaterale

membrana basolaterale

Introduzione

intestino (Sherars M.A. et al., 1984), nel fegato (Sherars et al., 1985) e nelle branchie (Olsson et al.,

1987) dei pesci, nelle ghiandole digestive (Viarengo et al., 1984) e nelle branchie (Roesijadi et al.,

1989) di molluschi e crostacei. Questa induzione risulta in concentrazioni relativamente alte di

metalli legati alla metallotioneina in questi organi . Nell’intestino dei mammiferi, il legame con la

metallotioneina ritarda il trasferimento dei metalli al sangue per il successivo trasporto agli organi

interni.

Il legame dei metalli alle metallotioneine indotte nell’intestino e nelle branchie degli animali

acquatici, ha probabilmente un effetto sull’assorbimento dei metalli simile a quello rilevato

nell’intestino dei mammiferi. Il legame dei metalli alla metallotioneina aumenta il bioaccumulo in

questi organi, così come nel fegato e nei reni.

La metallotionenina ha un ruolo centrale nella regolazione della disponibilità di Cu e Zn

intracellulare, per le funzioni cellulari: può donare Zn, e Cu a metalloproteine, tra cui anidrasi

carbonica, piridossal-chinasi ed emocianina (Brouwer et al., 1992) ed attivarle.

Aumentati livelli di metallotioneine e metalli legati alla MT sono caratteristici dell’esposizione a

Cd, Cu e probabilmente Zn negli animali acquatici. La capacità delle metallotioneine di sequestrare

i metalli è inequivocabilmente legata a una funzione di detossificazione dei metalli (Hamer et al.,

1985). Benché ciò debba essere ancora confermato, le interazioni cellulari che coinvolgono le MTs

possono seguire due linee generali: intercettazione e legame degli ioni metallici e rimozione dei

metalli da ligandi non tioneinici che includono i bersagli cellulari di tossicità e che può

rappresentare una funzione di salvataggio per le strutture danneggiate in modo reversibile dal

legame di metalli non appropriati. E’ ancora da verificare se l’induzione della MT possa interferire

con la normale regolazione dei sistemi metallo-dipendenti.

In questo contesto, la sintesi di tioneina indotta da metallo può determinare risultare in un

incremento di ligandi che possono rimuovere in modo inappropriato metalli essenziali da siti attivi

di altre molecole e interferire con le funzioni cellulari.

La misurazione dell’induzione di metallotioneina è stata proposta come indicatore cellulare di

esposizione ai metalli e tossicità negli animali acquatici (Roesijadi G., 1992). Questa induzione

conferisce una maggior tolleranza verso i metalli sia nelle cellule (Gick et al., 1982) che negli

individui (Aoki et al., 1989). L’organismo non soccombe velocemente alla tossicità del metallo e

inoltre il turnover relativamente lungo dei metalli legati alla MT fa sì che possa essere accumulata

una quantità di metalli maggiore, consentendo che l’organismo possa tollerare un carico di metalli

superiore. Una possibile conseguenza di ciò è l’incremento del potenziale di trasferimento trofico

del metallo, con possibili conseguenze a livello ecologico e della salute pubblica, quando le specie

sono utilizzate come cibo per l’uomo.

A basse dosi gli ioni metallici si legano alla MT, mentre ad alte dosi si legano a proteine ad alto

peso molecolare e causano danno tissutale . La velocità della biosintesi di MT potrebbe essere

24

Introduzione

importante per la funzione della stessa come chelante per la detossificazione dei metalli.

Ovviamente più velocemente può essere prodotta la MT, minori sono le possibilità che il metallo

raggiunga altre proteine intracellulari di importanza fisiologica.

Per via delle loro caratteristiche biochimiche funzionali, le metallotioneine sono in grado di

proteggere le strutture cellulari da interazioni non specifiche con cationi di metalli pesanti penetrati

in eccesso nella cellula (Viarengo et al, 1993). A causa dell’inducibilità da metalli pesanti, le

metallotioneine sono solitamente considerate un importante biomarcatore specifico per la

rilevazione della risposta degli organismi a inquinanti inorganici come Cd, Hg, Cu, Zn presenti

nell’ambiente acquatico. Gli organismi bioindicatori che sono stati comunemente impiegati nelle

applicazioni di metallotioneina come biomarcatore sono pesci (Hylland, 1996), molluschi

(Viarengo, 1989) e crostacei (Pedersen et al., 1997). L’importanza della metallotioneina come

strumento per attività di biomonitoraggio è aumentata dal fatto che le MTs sono proteine ubiquitarie

e dunque possono essere studiate in molti organismi viventi (Hamer, 1986).

25

Introduzione

1. 8 METALLOTIONEINA COME BIOMARCATORE NEI PESCI La MT è un biomarcatore di esposizione e monitoraggio della contaminazione dai metalli nei pesci,

perché ha un’alta specificità e abilità a legare gli ioni metallo.

La metallotioneina è usata come biomarcatore di esposizione perché facilmente quantificabile con

l’uso di tecniche di biologia molecolare, come la PCR e i saggi immonochimici.

Sperimentalmente è stato dimostrato che il livello epatico di MT nei pesci è dose-dipendente dopo

esposizione al cadmio, a rame e zinco (Hogstrand et al., 1991).

Il concetto di biomarcatore è ancora controverso perché spesso è difficile stabilire una chiara

relazione fra il livello di esposizione e l’ampiezza della risposta del biomarcatore (Huggett et al.,

1992). Normalmente i biomarcatori non forniscono informazioni relative all’impatto fisiologico

dell’esposizione all’inquinante, nè informazioni relative alla popolazione, alla comunità e agli effetti

sull’ecosistema. Depledge (1995) mostrò che la risposta dei biomarcatori potrebbe essere correlata a

una certa condizione di riduzione della crescita, emissione riproduttiva, o utilizzazione di energia

che direttamente coinvolge la sopravvivenza e la fertilità di un organismo. Questo approccio può

essere, comunque, difficoltoso da applicare in studi di campo. Prove su biomarcatori e altri

indicatori di stress a vari livelli biologici possono anche fornire preziose informazioni sul

monitoraggio dell’ambiente naturale.

Molti studi hanno mostrato che grossolane analisi sulle acque e i sedimenti per metalli tossici non

possono essere usati per predire o fissare un impatto ambientale poiché la maggior parte di questi

metalli sono presenti in forme non direttamente accessibili agli organismi. Gli organismi sono in

grado di accumulare concentrazioni di metalli migliaia di volte in più rispetto a quelli presenti nelle

acque in cui vivono, e numerosi studi si sono focalizzati sull’accumulo dei metalli negli animali

acquatici che provengono da sistemi inquinati (Mason et al., 1995). L’uso di queste proteine

intracellulari come biomarcatori per elevati livelli di metalli in ambienti acquatici sono stati dunque

recentemente proposti come un mezzo efficace in studi ecotossicologici (Depledge, 1994; George et

al.,1994). I cambiamenti a livello biochimico offrono vantaggi come biomarcatori, poiché le

alterazioni molecolari sono normalmente la prima risposta rilevabile e quantificabile ai cambiamenti

ambientali e possono dunque servire come marcatori sia di esposizione che di effetto (Hugget,

1992). Il legame dei metalli alla metallotioneina sono spostati solamente da metalli con più alta

affinità; l’affinità di legame decresce nell’ordine Cu > Cd > Zn (Kagi, 1993).

L’induzione della metallotioneina può essere considerata come un marcatore biochimico di

esposizione e può essere utilizzata per evidenziare l’esposizione ai metalli. Tuttavia alcuni autori

hanno osservato che l’induzione della MT può essere influenzata da altri fattori fisiologici o

patologici. Gli stress patologici sono infatti un fattore determinante in questo senso (Viarengo et al.,

1998). Il nostro lavoro riguarda quindi l’applicabilità della metallotioneina come biomarcatore,

utilizzando come organismo bioindicatore il pesce, a protocolli di biomonitoraggio della qualità

26

Introduzione

delle acque dei fiumi, se non altro come primo marcatore di inquinamento da metalli pesanti. Questi

dati sono stati ottenuti nell’ambito delle attività relative al progetto Europeo e sono in particolare

esposti nella prima parte di questo lavoro.

Nella seconda parte del lavoro si riportano i dati di una serie di esperimenti effettuati utilizzando

come bioindicatore un modello di tipo vegetale.

1.9 BIOINDICATORI VEGETALITra i vantaggi più interessanti offerti dall’utilizzo delle piante come bioindicatori si possono

elencare i seguenti:

- la coltivazione è facile, poco costosa e la produzione di tessuto analizzabile è elevata

- si possono propagare da semi che si conservano anche per lunghi periodi e sono disponibili come

cloni, eliminando così i problemi di variabilità genetica

- sono più sensibili a determinanti gruppi d’inquinanti (es: erbicidi)

- trovandosi alla base della catena alimentare, subiscono gli effetti degli xenobiotici prima degli altri

livelli trofici, evidenziando così il danno prima che l’intero ecosistema ne venga interessato

- sono organismi statici e quindi sono permanentemente esposti all’azione delle sostanze tossiche e ne

indicano la distribuzione sul territorio

- possono essere validi bioaccumulatori. Ciò è importante perché, anche in mancanza di evidenti

alterazioni, rappresentano una potenziale fonte di contaminazione per gli animali.

Ecco perché nell’analisi dei sistemi ambientali terrestri lo studio delle piante è prioritario e può

indicare, in modo relativamente rapido e sintetico, la qualità dell’ambiente considerato. Per queste

ragioni, numerosi autori hanno proposto di includere sistematicamente i test di fitotossicità con

piante superiori nei programmi di biomonitoraggio ambientale (Taraldsen e Norberg-King, 1990).

1.9.1 Importanza del biomonitoraggio con organismi vegetaliIl monitoraggio biologico valuta la qualità dell’ambiente mediante l’utilizzo di bioindicatori,

organismi viventi che subiscono variazioni (biochimiche, fisiologiche, morfologiche) in seguito

all’esposizione ad agenti inquinanti. Queste variazioni possono essere stimate a vari livelli di

organizzazione biologica, da quello biomolecolare fino alla comunità.

Il biomonitoraggio può essere eseguito con due diverse modalità. In un caso è possibile lavorare in

laboratorio, in condizioni controllate dall’operatore, esponendo una singola specie o più specie

diverse (possibilmente omogenee dal punto di vista genetico e mantenute in condizioni standard) a

campioni ambientali prelevati nei siti di interesse. Nel secondo caso i bioindicatori vengono

osservati direttamente nell’ambiente di studio o prelevati da esso.

L’uso dei test di tossicità per analizzare il rischio ecologico ha tradizionalmente privilegiato

l’utilizzo di organismi animali (Lewis, 1993), in virtù dell’erronea convinzione che solo questi siano

27

Introduzione

veramente suscettibili ai tossici ambientali e che al contrario le piante siano estremamente resistenti

all’effetto di tali agenti. In realtà le piante presentano una sensibilità pari o superiore rispetto alle

specie animali per tensioattivi, pesticidi, composti organici e metalli. L’uso esclusivo dei test con

animali è chiaramente in contrasto con i principi dell’ecologia che riconoscono il ruolo

fondamentale delle piante come produttori primari della catena trofica (APHA, AWWA, WEF,

1995). Inoltre, le piante, essendo organismi statici, riflettono meglio la condizione di specifici

habitat. Per queste ragioni, numerosi autori hanno proposto di includere sistematicamente i test di

fitotossicità con piante superiori nei programmi di biomonitoraggio ambientale (Taraldsen et al.,

1990).

Tra i test di fitotossicità quelli di germinazione ed allungamento radicale, basati sull’uso di semi di

diverse specie, si sono rivelati estremamente utili per valutare la potenziale tossicità di campioni

liquidi contenenti sostanze organiche o miscele complesse in effluenti, e di camponi solidi come

sedimenti e fanghi di depurazione (Baudo et al., 1999).

Gli stadi iniziali di sviluppo sono i più sensibili alle alterazioni ambientali. I semi delle piante,

infatti, sopportano periodi prolungati di essiccamento ma, quando reidratati, vanno incontro a rapidi

cambiamenti diventando altamente suscettibili a stress ambientali che possono influenzare i primi

stadi di sviluppo. Possono essere facilmente presi in considerazione “end point” diversi quali

sopravvivenza, germinazione, modalità di accrescimento. La crescita radicale in particolare è stata

spesso utilizzata per valutare la tolleranza delle piante ai metalli.

28

Introduzione

1.10 DANNI DOVUTI DALL’ESPOSIZIONE AGLI INQUINANTI INORGANICI La tossicità dei metalli pesanti si esplica attraverso l’attivazione di reazioni ossidoriduttive e

l’interazione con macromolecole biologiche come gli acidi nucleici (DNA e RNA) e le proteine

(Briat et al., 1999).

1.10.1 Attivazione dei processi di riduzione dell’ossigenoLe forme ridotte dell’ossigeno vengono prodotte, per assunzione da parte dell’ossigeno molecolare

di elettroni provenienti da altre molecole, durante i processi ossidoriduttivi, essenziali per la vita

della cellula. Molte reazioni cellulari portano alla formazione di anione superossido (O2•-) e da

questo a perossido di idrogeno (H2O2) per azione della superossido dismutasi (SOD). Sebbene

queste molecole non siano di per sé molto reattive, esse possono formare, per catalisi da parte di

metalli di transizione (M), radicali idrossilici (•OH) responsabili del danno ossidativo di molti

sistemi biologici (reazione di Haber-Weiss).

Mn + O2 ↔ Mn+1 + O2•-

Mn+1 + O2•- → Mn + O2

Mn + H2O2 → Mn+1 + OH- + •OH

La reazione è generalmente riassunta come segue:

H2O2 + O2•- → O2 + OH- + •OH

Questa prende il nome di “reazione di Fenton”, quando il metallo di transizione è rappresentato dal

ferro.

Gli ioni metallici hanno un ruolo importante anche nelle modificazioni ossidative degli aminoacidi

liberi e delle proteine (Stadtman, 1993). La presenza di radicali liberi dell’ossigeno espone i residui

di istidina, arginina, lisina, prolina, metionina e cisteina, che costituiscono i più comuni punti di

ossidazione delle proteine, alla degradazione per opera di proteasi (Briat e Lebrun, 1999).

I radicali idrossilici, prodotti in prossimità del DNA, possono rimuovere o aggiungere atomi di

idrogeno alla macromolecola, portando così all’alterazione delle basi e della struttura

tridimensionale.

L’ossigeno e i metalli di transizione, in particolare il ferro, sono implicati nella perossidazione

lipidica, quindi un’alterazione degli equilibri ossido-riduttivi può portare a modificazioni della

struttura degli acidi grassi e conseguentemente ad alterazioni di processi fondamentali a livello delle

membrane (Briat e Lebrun, 1999).

29

Introduzione

1.10.2 Interazione con le macromolecole biologicheEsistono diversi meccanismi con cui gli ioni metallici possono provocare effetti deleteri in

importanti macromolecole biologiche come le proteine e gli acidi nucleici (Eichhorn, 1975).

Effetti tossici possono derivare dallo spiazzamento di metalli essenziali dal sito attivo della

molecola proteica (metallo-enzima) da parte di un altro metallo.

Il legame del metallo tossico con la molecola può riguardare anche siti diversi da quello attivo. I

gruppi funzionali interessati a questo legame sono quelli imidazolici, idrossilici, sulfildrilici,

carbossilici, amminici, peptidici, per quanto riguarda le proteine, mentre a livello degli acidi

nucleici i metalli si legano alle basi eterocicliche, agli idrossili del ribosio e ai gruppi fosfato.

Il legame del metallo con le basi nucleotidiche interferisce con l’instaurarsi dei legami idrogeno che

tengono appaiati i due filamenti del DNA provocando la distruzione della doppia elica. Il legame ai

gruppi fosfato dello scheletro desossiribonucleico provoca, al contrario, una stabilizzazione

dell’elica del DNA rafforzata da possibili legami crociati tra i due filamenti coordinati dai metalli.

Entrambi questi effetti genotossici si riflettono in un’alterata sintesi proteica dovuta ad uno scorretto

appaiamento delle basi e alla possibile depolimerizzazione degli acidi nucleici. Il legame ai gruppi

fosfato destabilizza il legame fosfodiestereo dell’RNA rendendolo maggiormente suscettibile

all’idrolisi da parte delle fosfodiesterasi.

Le piante, come tutti gli organismi viventi, hanno sviluppato diversi meccanismi di risposta ai

metalli pesanti per evitare gli effetti tossici da essi indotti.

Gli sforzi della pianta sono inizialmente indirizzati verso la prevenzione di questi effetti limitando

l’accumulo dei metalli nella cellula mentre la produzione di proteine che possono resistere agli

effetti di tali tossici avviene in un secondo momento (Hall, 2002).

La prima risposta riguarda la regolazione della captazione del metallo a livello dell’apparato

radicale che rappresenta il primo sito di esposizione e accumulo.

Il trasporto del metallo tossico all’interno della cellula può essere limitato dal legame con la parete

cellulare oppure con essudati extracellulari. La membrana plasmatica, inoltre, riduce la captazione e

stimola l’efflusso attivo del metallo penetrato nel citoplasma. A livello intracellulare le Heat Shock

Proteins (HSPs) sono coinvolte nella riparazione sia del danno della membrana plasmatica che delle

strutture proteiche. Per mantenere gli ioni metallici intracellulari in forma non tossica, la cellula

provvede alla loro chelazione con ligandi endogeni e alla loro compartimentalizzazione in strutture

subcellulari, allontanandoli dai processi metabolici. In ultimo, quando la concentrazione

intracellulare di metallo sovrasta le capacità di detossificazione e di stoccaggio della cellula, si

attivano meccanismi che arginano la produzione di specie reattive dell’ossigeno (Briat e Lebrun,

1999).

30

Introduzione

Risposte ai metalli pesanti: 1) riduzione del movimento del metallo verso le radici ad opera della cuffia

ectomicorrizale; 2) legame alla parete cellulare e agli essudati delle radici; 3) ridotto passaggio attraverso la

membrana; 4) efflusso attivo del metallo; 5) chelazione del metallo nel citosol da parte di vari ligandi,

fitochelatine (PCs), metallotioneine (MTs) e acidi; 6) riparazione e protezione della membrana plasmatica; 7)

trasporto del complesso PC-M nel vacuolo; 8) trasporto e accumulo di metallo nel vacuolo.

31

Introduzione

1.11 LE PIANTE E I METALLI PESANTILe piante assumono micronutrienti come rame e zinco dall’ambiente acquatico e terrestre, il quale

può fornire loro anche alcuni metalli tossici come cadmio, piombo e mercurio. La concentrazione di

questi metalli varia a seconda del grado di inquinamento e delle caratteristiche naturali

dell’ambiente in cui si trovano e pertanto nelle piante, organismi statici, i meccanismi deputati al

mantenimento dell’omeostasi dei metalli sono di fondamentale importanza.

Le piante mantengono i livelli di metalli essenziali a concentrazioni comprese tra un livello minimo,

sotto il quale l’organismo si trova in uno stato di carenza dannoso, ed uno massimo che provoca

tossicità. Per quanto riguarda i metalli non essenziali, gli sforzi della pianta sono rivolti al

mantenimento della loro concentrazione intracellulare a valori inferiori a quelli tossici. I metalli

vengono definiti pesanti quando la loro densità è superiore ai 5 g/cm3 (Sanità di Toppi e Gabrielli,

1999). Alcuni di essi, in particolar modo rame, zinco e ferro, sono micronutrienti essenziali per i

processi fisiologici in vegetali e animali, in quanto fanno parte di enzimi e macromolecole di

numerose vie metaboliche. Elevate concentrazioni di questi elementi, tuttavia, possono determinare

l’attivazione di processi tossici per la cellula.

Ioni di metalli pesanti non essenziali, quali cadmio, cromo, piombo e mercurio, costituiscono

importanti inquinanti inorganici ambientali, particolarmente concentrati in aree di intensa pressione

antropogenica

Esistono delle molecole contenenti gruppi funzionali SH nei meccanismi di difesa dagli effetti dei

metalli pesanti.

1.11.1 Chelazione dei metalli Una volta penetrati nella cellula, gli ioni metallici vengono chelati da ligandi endogeni come le

proteine, i peptidi e piccole molecole organiche. Questo meccanismo è di primaria importanza per la

sopravvivenza cellulare e determina anche la compartimentalizzazione del tossico.

Le due principali proteine implicate nel legame con i metalli pesanti sono le ferritine e le

metallotioneine. Le fitochelatine sono invece peptidi sintetizzati enzimaticamente in grado di

complessarsi con i metalli. In aggiunta alle proteine e ai peptidi, un gran numero di piccole molecole

organiche sono coinvolte nel legame con i metalli e, tra queste, le più interessanti sono gli acidi

organici, gli aminoacidi e i derivati del fosfato.

1.11.2 FerritineLe ferritine sono una classe di proteine che legano il ferro codificate da una famiglia di geni e

localizzate nei plastidi (Briat e Lobréaux, 1998).

La loro espressione è ampiamente regolata e può essere attivata da diversi segnali ambientali e in

particolare da un eccesso di ferro. Nella regolazione genica di queste proteine sono implicate due

32

Introduzione

vie cellulari: una coinvolge l’acido abscissico e l’altra, indipendente da questo ormone dello stress,

è modulata da antiossidanti e inibitori delle fosfatasi serina/treonina (Savino et al., 1997). Le

ferritine hanno un ruolo importante nelle risposte agli stress ossidativi nelle piante e probabilmente

partecipano alla protezione dei plastidi dal danno provocato da un eccesso di ferro libero. Uno stress

ossidativo ferro-mediato porta sia ad un accumulo di ferritina che ad un aumento dell’affinità di

legame della proteina con il metallo.

È importante sottolineare che, sebbene questo fenomeno non sia documentato nelle piante, le

ferritine animali sono in grado di legare anche rame, zinco, cadmio, piombo, berillio e alluminio

(Briat e Lebrun, 1999). Un aumento dell’espressione di mRNA codificante per la ferritina e

dell’abbondanza della proteina è stata osservata in cellule di Xenopus leavis dopo esposizione al

cadmio e al rame (Muller et al., 1991).

1.11.3 MetallotioneineLe metallotioneine sono proteine ubiquitarie di piccole dimensioni (6-7 kDa), codificate da una

famiglia di geni e ricche di residui cisteinici, che permettono di complessare molti metalli e

principalmente zinco, rame e cadmio. La loro espressione è indotta dai metalli per attivazione della

trascrizione genica.

Le metallotioneine contengono in genere due dominii di legame per i metalli che conferiscono alla

proteina una tipica conformazione a manubrio (Cobbett et al., 2002). Queste proteine sono in grado

di legarsi sia a cationi monovalenti che bivalenti grazie alla presenza di numerosi gruppi sulfidrilici

in ogni dominio. In particolare, a quello α della proteina si legano quattro molecole di cationi

bivalenti, per esempio di zinco (II), mentre al dominio β se ne legano tre. Per quanto riguarda i

cationi monovalenti come il rame (I), si legano sei ioni per dominio proteico (Minami et al., 2002).

33

Scopo della tesi

2- SCOPO DELLA TESI

Scopo di questo lavoro è quello di valutare l’applicabilità della metallotioneina, come biomarcatore,

dosata nel pesce catturato allo stato libero o esposto in gabbia, al monitoraggio della qualità delle

acque ed in particolare a quella relativa a fiumi europei. A questo fine i dati dell’espressione della

metallotioneina verranno posti in confronto ai dati storici e dati chimici riguardanti l’inquinamento

da metalli pesanti.

Ulteriore scopo di questa ricerca è quello di valutare la possibilità di uno studio preliminare della

qualità dell’acqua utilizzando un modello di germinazione in vitro.

Il recupero dei fiumi urbani è un importante aspetto del recupero ambientale, soprattutto nell’ottica

di un miglioramento della qualità della vita per gli abitanti delle città. Tali fiumi sono in genere

pesantemente inquinati da miscele complesse di contaminanti provenienti da sorgenti diffuse e

puntiformi.

Sebbene si possano predire somiglianze nelle caratteristiche chimico-fisiche dei fiumi che

attraversano gli agglomerati urbani (come ridotti livelli di ossigeno disciolto e aumentati livelli di

ammoniaca), ci si può attendere che esistano caratteristiche di contaminazione specifiche per ogni

corso d’acqua. Per questo, la valutazione dei rischi ecologici ed i criteri delle qualità dell’acqua

necessitano di essere elaborati per ciascun fiume.

Il progetto “Modelling Ecological Quality of Urban Rivers: Ecotoxicological Factors Limiting

Restoration of Fish Population” (CITYFISH) intende contribuire allo sviluppo di metodologie per la

valutazione del rischio e della qualità delle acque dei fiumi che attraversano le città e su cui sia

possibile basare i piani di intervento. Questi criteri dovranno essere sviluppati nell’ambito del pesce

quale indicatore primario dello stato di salute delle acque e si propongono di valutare i fattori sub-

letali che limitano il recupero della fauna ittica nei fiumi inquinati.

Allo stato attuale i metodi a disposizione e previsti dai protocolli ufficiali utilizzano la mortalità

come misura dell’effetto tossico e dell’impatto ambientale. Il limite maggiore di questo approccio è

la difficoltà nel predire l’impatto di interazioni sinergiche tra inquinanti o tra miscele di inquinanti e

altri stress chimico-fisici (come la temperatura) o l’impatto di prodotti chimici che influenzano la

popolazione attraverso effetti non letali (come i composti estrogenici).

La ricerca è stata svolta su fiumi urbani in differenti paesi europei.

Sono disponibili osservazioni compiute in un periodo che può essere considerato sufficiente per

determinare la qualità delle acque attraverso metodologie di carattere chimico o biologico. Una serie

ben definita di biomarcatori di esposizione a tossici sono stati studiati in ciprinidi direttamente

pescati nei siti o esposti in gabbie nei vari siti su ogni fiume.

34

Scopo della tesi

Questi dati sono stati posti in relazione a parametri chimici indicativi della qualità dell’ambiente

(livelli di ossigeno e di ammoniaca) e con le specifiche classi di inquinanti (xenobiotici e sostanze

estrogeniche), misurate su campioni di tessuti di pesci pescati.

Lo studio di queste relazioni è destinato a rivelare l’efficienza dei singoli biomarcatori nel

descrivere il rischio ecologico.

Un’iniziale valutazione dell’inibizione della germinazione e dell’allungamento radicale, in germogli

di Lepidium sativum e Zea mays esposti a varie concentrazioni di bicromato di potassio in

condizioni controllate (72 h, 25°C e al buio), ci ha permesso di stabilire il grado di suscettibilità del

sistema all’esposizione al cromo.

Accanto alla valutazione morfologica, come nel pesce, sono stati selezionati parametri molecolari di

risposta attraverso la valutazione delle metallotioneine.

35

Materiali e metodi

3- MATERIALI E METODI

3.1 SPECIE SCELTE COME BIOINDICATORICome bioindicatore negli studi di monitoraggio della qualità delle acque è stato scelto il pesce con

particolare riferimento al cavedano, all’abramide comune e alla carpa. La scelta del pesce è dovuta

al fatto che si tratta di un indicatore primario dello stato di salute ecologico; infatti appartiene

all’apice della piramide trofica.

L’utilizzo di specie selvatiche nei programmi di screening degli agenti inquinanti è limitato dalla

natura mobile dei pesci. Tali limitazioni possono essere eliminate utilizzando pesci di allevamento

portati nei siti di monitoraggio (Hanninen et al., 1991) ed esposti, in gabbia, alle acque del fiume

per 4 settimane.

3.1.1 Sistematica dei pesci

Regno: Animale

Phylum: Cordati

Subphylum: Vertebrati

Superclasse: Pesci

Classe Sottoclasse Superordine

Condritti Elasmobranchi Squaliformi

Batoidei

Squatinomorfi

Galeomorfi

Olocefali

Osteitti Attinopterigi Condrostei

Olostei

Teleostei

Sarcopterigi Dipnoi

Crossopterigi

Il cavedano, l’abramide comune e la carpa sono inclusi nei Teleostei, superordine della sottoclasse

degli Attinopterigi.

37

Materiali e metodi

CAVEDANO

NOME LATINO: Leuciscus cephalus

FAMIGLIA: Ciprinidi

ORDINE: Cipriniformi

- Morfologia: corpo slanciato ed affusolato a sezione circolare; bocca grande e terminale; grosse

squame circolari con margine finemente punteggiato; colorazione verdastra sul dorso, si attenua sui

fianchi, bianco giallastra sul ventre.

- Taglia: 20-40 cm a 7-10 anni (600-1000 g), raramente fino a 60 cm (4 kg).

- Distribuzione: è comune nei fiumi e nei laghi di quasi tutta l’Europa ed è presente in tutta la penisola

con due sottospecie.

- Habitat: prevalentemente in acque correnti limpide, anche a velocità discreta, ma anche nelle zone

litorali dei laghi di grandi e medie dimensioni. Da giovane è gregario e di superficie; nell’età matura

abita a una certa profondità e tende a divenire solitario.

- Alimentazione: finché è giovane si ciba di vermi; più tardi si trasforma in un vero e proprio

predatore, insidiando accanitamente pesciolini, piccoli crostacei e rane; divora anche le uova appena

deposte da altri pesci.

- Riproduzione: la deposizione avviene tra Aprile e Giugno in acque litorali, sulle pietre e la

vegetazione del fondo; le uova sono molto piccole (0,7 mm); la schiusa avviene entro circa una

settimana. L'accrescimento è moderatamente rapido (ad un anno misurano 9 cm di lunghezza) e la

maturità è raggiunta dai maschi a 3-4 anni e dalle femmine a 4-5 anni.

38

Materiali e metodi

ABRAMIDE

NOME LATINO: Abramis brama

FAMIGLIA: Ciprinidi

ORDINE: Cipriniformi

- Morfologia: corpo compresso e a forma ellissoidale, con testa piccola e bocca subterminale

lievemente rivolta verso l’alto; la colorazione è grigio piombo sul dorso e bianca sul ventre.

- Taglia: lunghezza massima: 80 cm; peso massimo: 3 kg.

- Distribuzione: abita l’Europa centrale, settentrionale e orientale, nonché l’Irlanda e l’Inghilterra.

- Habitat: è comunissima nelle acque a corso lento dei laghi e dei fiumi, dove vive in gruppi talora

numerosissimi. In genere è solita trattenersi sul fondo, in mezzo alle erbe che vi si allignano.

- Alimentazione: vermi, larve d’insetti (in particolare di Chironomidi), piccoli crostacei, molluschi e

piante.

- Riproduzione: il periodo riproduttivo va da Maggio a Giugno. Per lo più l’emissione delle uova ha

luogo di notte presso le rive. Pochi giorni dopo la loro deposizione, i bassifondi delle rive

formicolano di milioni di avannotti, i quali per qualche tempo si aggirano in prossimità delle

sponde, poi scendono sul fondo seguendo gli adulti.

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Materiali e metodi

CARPA

NOME LATINO: Cyprinus carpio

FAMIGLIA: Ciprinidi

ORDINE: Cipriniformi

- Morfologia: corpo di forma ovale, meno accentuata nella forma selvatica; bocca protrattile con

labbra carnose munite di quattro barbigli; colorazione bruno-verde sul dorso, spesso con riflessi

bronzei, gialla sul ventre.

- Taglia: 20-40 cm (300-1000 g) a 3-4 anni; raramente 100 cm (25-30 kg) e 40 anni di età.

- Distribuzione: in acque stagnanti o a debolissima corrente in tutta Europa, Italia compresa.

- Habitat: tra la vegetazione di riva ed in stretta vicinanza con fondali di tipo melmoso. È specie

eurialina, adattandosi così anche ad ambienti salmastri

- Alimentazione: invertebrati di fondo, larve di insetti, detrito vegetale, ma anche anfibi ed avannotti

di altri pesci.

- Riproduzione: ha luogo in acque molto basse, in Maggio-Giugno, con temperatura compresa tra 17 e

20 °C; uova assai piccole (1 mm) rimangono attaccate alle piante e schiudono in 3-8 giorni; le larve

restano inattive sul fondo fino al riassorbimento del sacco vitellino (2-3 giorni). L'accrescimento è

rapido: ad un anno di età la lunghezza può raggiungere i 15 cm ed il peso i 200 g. La maturità

sessuale è raggiunta a 3 anni nei maschi e a 3-4 nelle femmine

40

Materiali e metodi

3.1.2 Prelievo del fegatoIl fegato prelevato dai pesci di ciascun gruppo è accuratamente perfuso con tampone fosfato 20 mM

contenente KCl 0.15 M e EDTA 1 mM, immediatamente trasferito in azoto liquido e quindi

conservato a -80°C fino al momento dell’estrazione della metallotioneina.

3.1.3 Estrazione della metallotioneinaI campioni sono sottoposti ad una doppia estrazione con solventi (Beattle e Richards, 1995).

Al fine di estrarre le metallotioneine, un grammo di tessuto viene omogeneizzato (Ultraturrax T25,

Janke& Kunkel-IKA, Taufen, D) in 2 ml di acqua e centrifugato (Beckman L60) a 35000 rpm ad

una temperatura di 4°C per 10 minuti. A centrifugazione ultimata il surnatante viene riposto in

provette di poliallomero e ad esso viene aggiunta una miscela di etanolo/acetonitrile (1:3 v/v) in

quantità tale da rappresentare l’80% del volume finale, che determina la precipitazione delle

proteine.

Dopo centrifugazione, nelle medesime condizioni della precedente, il precipitato viene risospeso in

200 µl di acqua e centrifugato a 15000 rpm (Eppendorf centrifuge, Brinkman, Westbury, NY) per 5

minuti. Il surnatante viene infine sottoposto ad elettroforesi capillare MECC (Micellar Elettrokinetic

Chromatography Capillary).

41

Materiali e metodi

3.2 BIOIDICATORI VEGETALII bioindicatori vegetali utilizzati nella seconda parte del lavoro sono:

- Zea mays

- Lepidium sativum

3.2.1 Estrazione delle proteine I germogli cresciuti in presenza di acqua (controllo) e di bicromato di potassio vengono asciugati

con carta assorbente e per il mais si procede all’eliminazione dell’endosperma attraverso l’uso di un

bisturi.

Schema dell’eliminazione dell’endosperma dal seme di mais e foto in sezione trasversale.

Il materiale, costituito da 10 germogli per il mais e 50 per il crescione, viene triturato in un mortaio

in presenza di azoto liquido e pesato per poter aggiungere il tampone di estrazione (sample buffer

con β-mercaptoetanolo 2% v/v) in rapporto 1:4 (p/v) (Laemmli, 1970). I campioni vengono

omogeneizzati (Ultraturrax T25, punta S 25 N-10 G, IKA Werke Janke & Kunkel GmbH & Co. KG,

Staufen, D) e sottoposti a 3 cicli di sonicazione con impulsi di 30 secondi ciascuno (Sonoplus HD

2070, punta UW 2027, Bandelin electronic GmbH & Co. KG , Berlin D). Questi procedimenti

determinano la rottura della parete cellulare e la fuoriuscita del contenuto citoplasmatico nel

tampone di estrazione. La presenza del β-mercaptoetanolo permette la rottura dei ponti disolfuro

delle proteine, mentre l’SDS (sodio dodecil solfato) si interpone tra coppie di catene laterali,

orientandosi con la coda apolare verso la stringa (-CH-CO-NH-)n e la testa ionizzata del solfato

verso l’esterno. In media si lega una molecola di SDS ogni due residui aminoacidici. Il legame

dell’SDS annulla il contributo delle catene laterali della proteina alla carica superficiale del

complesso che viene quindi dettata unicamente dai gruppi solfato del detergente anionico.

42

Endosperma

Materiali e metodi

Schema dell’interazione tra molecole di SDS e una catena polipeptidica.

I campioni vengono successivamente centrifugati ad una velocità di 4.000 rpm per 20 minuti a 4°C

(4233R, ALC Cologno Monzese, Mi), in modo da separare i residui cellulari dalla componente

proteica. Il surnatante viene prelevato e fatto bollire per 5 minuti per favorire il processo di

denaturazione e riduzione. I campioni vengono conservati a -20°C.

Sample buffer

Stacking buffer 40%

SDS 2%

Blu di bromofenolo 2%

Glicerolo 30%

β-mercaptoetanolo 4%

Composizione del tampone di estrazione (Sample buffer).

43

rivestimento di molecole di SDS

catena polipeptidica

Materiali e metodi

Stacking buffer 5x

Tris (C4H11NO3) 0,6 M

Sodio Azide 15 mM

pH 6,8 con HCl

Composizione dello Stacking buffer.

3.2.2 Estrazione delle metallotioneineI germogli, cresciuti in presenza di acqua (controllo) e di soluzioni a concentrazione crescente di

metalli pesanti, vengono sottoposti ad una doppia estrazione con solventi (Beattle e Richards, 1995).

Un grammo di campione (mais privato dell’endosperma) viene omogeneizzato (Ultraturrax T25,

punta S 25 N-10 G) in 2 ml di acqua e centrifugato (Beckman L60, Beckman Instrument, Fullerton,

CA, USA) a 35.000 rpm a 4°C per 10 minuti. Al surnatante viene aggiunta una miscela di

etanolo/acetonitrile (1:3 v/v) in quantità tale da rappresentare l’80% del volume finale.

Dopo un’ulteriore centrifugazione, nelle medesime condizioni della precedente, il precipitato viene

risospeso in 200 µl di acqua e centrifugato a 15.000 rpm (Eppendorf centrifuge, Brinkman,

Westbury, NY) per 5 minuti. Il surnatante viene infine sottoposto ad elettroforesi capillare (MECC).

3.3 ELETTROFORESI CAPILLARELa valutazione quantitativa della metallotioneina è stata effettuata attraverso elettroforesi capillare

sui campioni di metallotioneina estratta dal fegato di pesci o dai germogli delle specie vegetali.

L’elettroforesi capillare è una tecnica analitica separativa che può essere impiegata per separare

un’ampia gamma di composti biologici come amminoacidi, peptidi, proteine ed acidi nucleici così

come qualsiasi altro tipo di composto organico di piccola dimensione (Issaq Haleem, 1999). I

recenti avanzamenti nella strumentazione e nelle metodologie di separazione hanno permesso lo

sviluppo di numerose applicazioni in campo farmaceutico, chimico, biotecnologico e ambientale.

La tecnica si basa sulla differente migrazione di molecole cariche sotto l’influsso di un campo

elettrico generato nel mezzo di separazione da un generatore di tensione in grado di erogare tensioni

da 10 a 50 kV. La separazione dei costituenti del campione avviene all’interno di un capillare di

silice di diametro variabile da 20 a 100 µm e di lunghezza compresa tra 20 e 100 cm. Il capillare può

essere rivestito o non rivestito. Un sistema di rilevazione ad UV posto in prossimità del catodo

consente di determinare l’analita.

Dopo l’iniezione del campione, solitamente all’estremità anodica del capillare, viene applicata una

differenza di potenziale alle due estremità che genera un campo elettrico. Le molecole del campione

44

Materiali e metodi

vengono attratte verso il polo elettrico di carica opposta e cominciano a migrare con una velocità

proporzionale all’intensità del campo elettrico:

V= µeE

E= intensità campo elettrico

µe= mobilità elettroforetica

La mobilità elettroforetica è in funzione della carica e del volume (massa e forma) della proteina e

dipende dalle proprietà del mezzo di separazione (pH, forza ionica del tampone).

Gli analiti, indipendentemente dalla loro carica, vengono spinti verso il catodo per il fenomeno

dell’elettroendosmosi. Il flusso del tampone contenuto nel capillare è definito flusso

elettroendosmotico (EOF) e viene originato dal movimento, verso il catodo, dei cationi legati ai

gruppi silanolici del capillare. Il flusso elettroendosmotico è maggiore rispetto alla mobilità

elettroforetica e di conseguenza sia gli anioni che i cationi si spostano verso il catodo. La velocità di

migrazione dei cationi è aumentata dal flusso elettroendosmotico e pertanto essi raggiungono il

catodo più velocemente. Gli anioni, attratti dall’anodo, vengono trasportati, meno velocemente,

verso il catodo dal flusso elettoendosmotico del tampone. I cationi con elevato rapporto

carica/massa migrano per primi, seguiti da quelli con basso rapporto carica/massa. I composti neutri

migrano alla stessa velocità dell’EOF seguiti dagli anioni con basso rapporto carica/massa e da

quelli con alto rapporto.

La presenza di surfattanti quali il sodio dodecil solfato nel tampone di corsa è alla base della tecnica

MECC il cui meccanismo di separazione si basa sulla ripartizione dell’analita neutro tra la fase

micellare e quella del tampone. Le micelle si formano quando il surfattante viene aggiunto a

concentrazioni superiori rispetto alla concentrazione critica micellare. Le micelle sono cariche

negativamente ma migrano verso il catodo sospinte dall’EOF ad una velocità inferiore rispetto al

flusso del tampone acquoso a causa della loro attrazione verso l’anodo. Le molecole neutre idrofile

migrano insieme al tampone acquoso mentre quelle lipofile vengono rallentate dalla ripartizione con

la fase micellare. Questa tecnica è stata utilizzata per separare le molecole di metallotioneine e per

valutarne l’induzione nei campioni trattati con soluzioni di metalli pesanti rispetto al controllo.

45

Materiali e metodi

Rappresentazione schematica della cromatografia capillare elettrocinetica micellare, MECC.

3.3.1 Quantificazione delle MTs Per effettuare l’analisi delle metallotioneine si utilizza il sistema P/ACE 2100 i cui costituenti

principali sono rappresentati da:

- un autocampionatore costituito da due dischi rotanti dove vengono alloggiati i campioni da

analizzare e le soluzioni richieste per l’analisi, ovvero il tampone di corsa (borato 300mM, SDS

85 mM a pH 8.4) e le soluzioni di lavaggio (NaOH 0.1 N e H2O deionizzata).

- una cartuccia contenente un capillare non rivestito lungo 50 cm con diametro interno di 75 µm e il

sistema di refrigerazione.

- un alimentatore ad alto voltaggio impostato a

10000 V.

- un modulo ottico e un detector UV (200 nm).

- un sistema di controllo della temperatura

impostata a 25°C.

- un iniettore del campione che consente di

caricare il campione sotto pressione in 5 sec.

- un computer per l’impostazione dei parametri e per l’analisi dei risultati.

L’identificazione del picco è in base al tempo di ritenzione di un campione standard di

metallotioneina (fegato di coniglio).

Dopo aver posizionato 5 µl di campione e le soluzioni per i lavaggi e la corsa in vials

nell’autocampionatore, lo strumento procede con due lavaggi di 5 minuti, uno con NaOH 0.1 N e ad

un altro con H2O distillata, seguito da un ulteriore lavaggio di 10 minuti con il tampone di corsa.

Prima dell’iniezione di ogni campione viene effettuato un prelavaggio di 5 min con tampone di

corsa. La durata della corsa di ogni campione è di 20 minuti. Al termine delle corse si procede al

calcolo delle aree dei picchi dei cromatogrammi, corrette in base al tempo di ritenzione ed

all’elaborazione dei dati utilizzando il programma System Gold (Beckman Instruments, Inc).

46

Materiali e metodi

Fasi rappresentative di una corsa elettroforetica

47

fotocatodo

Anodo +

computer

Catodo-

Tempo (min)

lampada

Fotocatodo

Tampone

Materiali e metodi

3.3.2 Vantaggi dell’EC rispetto all’elettroforesi classica- Elevata efficienza di separazione

- Richiesta di piccole quantità di campione

- Velocità di separazione

- Automazione

- Quantificazione

- Riproducibilità

- Possibilità di associare tale metodica a uno spettrometro di massa

- Costi limitati

48

Risultati

4- RISULTATI

4.1 IDENTIFICAZIONE DEL PICCO DELLA METALLOTIONEINAL’identificazione dei picchi della metallotioneina nei cromatogrammi è stata effettuata in base al

tempo di ritenzione descritto in letteratura e al tempo di ritenzione di uno standard di

metallotioneina pura iniettato nelle stesse condizioni sperimentali (Beattie, 1998). Inoltre ad

ulteriore convalida è stata eseguita una corsa elettroforetica con rivelazione delle proteine a 280 nm.

Nessuno dei picchi messi in evidenza a 200 nm è stato rivelato a 280 nm, poiché nella struttura della

metallotioneina sono assenti aminoacidi aromatici che hanno un caratteristico assorbimento alla

lunghezza d’onda di 280 nm.

49

__________ Rivelazione delle proteine a 200 nm

__________ Rivelazione delle proteine a 280 nm

Risultati

La concentrazione di MTs presenti in campioni estratti dal fegato di cavedani mantenuti inacqua controllata e non inquinata è stata confrontata con quella di MT estratta da pesciesposti per via intraperitoneale a CdCl2, noto induttore della MT stessa.

La MT estratta da cavedani trattati ha mostrato una concentrazione superiore rispetto al cavedano

controllo, validando il metodo utilizzato.

L’aumento del picco identificato in campioni estratti dal fegato di pesci esposti a metalli pesanti

rispetto a pesci “controllo” ha fornito inoltre altre indicazioni utili al fine della sua identificazione.

50

___________ Metallotioneina estratta dal fegato di cavedano

“controllo”

_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Metallotioneina estratta dal fegato di cavedano

trattato con CdCl2

Risultati

4.2 CAMPAGNE DI MONITORAGGIO EFFETTUATE NEL FIUME LAMBROIl Lambro è lungo 130 Km. Nasce dal monte Forcella, alimenta il lago di Pusiano, attraversa la

Brianza, bagna Monza e i quartieri orientali di Milano e confluisce infine da sinistra nel Po presso

Orio Litta.

Sono stati scelti i seguenti tre siti di studio, caratterizzati dalla differente qualità dell’acqua (dalla

migliore alla peggiore):

- sito A: Merone (CO)

- sito B: Canonica (MI)

- sito C: Brugherio (MI)

La diminuzione complessiva della qualità dell’acqua rilevata dalla sorgente al sito più a valle è

dovuta a scarichi domestici, inquinamento agricolo diffuso ed immissioni puntuali di industrie

(tessili, metallurgiche, chimiche).

La specie scelta come bioindicatore è stato il cavedano (Leuciscus Cephalus), dal momento che

questo pesce è ben rappresentato lungo il segmento di fiume scelto come area di studio.

Le analisi quantitative della metallotioneina effettuate tramite elettroforesi capillare hanno dato i

risultati riportati alla pagina seguente.

51

Lambro medio

Risultati

Le analisi quantitative della metallotioneina effettuate tramite elettroforesi capillare, relative alle

campagne III e V mostrano bassi livelli della proteina nel sito A, come atteso.

I risultati della campagna I e IV, invece, mostrano livelli di MTs molto elevati anche nel sito di

Merone (sito di riferimento), non statisticamente differenti dai livelli di MTs nel sito B. Occorre

però considerare che, all’altezza di Brugherio, dove sono stati eseguiti i campionamenti per la

metallotioneina, confluisce nel Lambro il Canale Villoresi che bagna zone intensamente agricole e

non industriali, diluendo la concentrazione dei tossici inorganici presenti nelle acque.

Gli istogrammi relativi alle campagne IV e V mostrano risultati discordanti tra loro, ma va tenuto

presente che i dati raccolti in entrambe le campagne sono stati pochi a causa dell’elevata mortalità

dei pesci dovuta soprattutto al carattere turbolento del fiume Lambro e delle intense precipitazioni

verificatesi nei periodi di svolgimento delle due campagne.

In particolare, durante la campagna IV, sono state osservate infezioni nei cavedani rimasti vivi. E’

noto che l’induzione della sintesi di metallotioneina avviene, oltre che per la presenza di metalli

pesanti nell’ambiente, anche a causa di stress vari tra cui gli stati infettivi.

52

0

0,5

1

1,5

2

2,5

campagna I campagna II campagna III campagna IV campagna V

MT

(mg/

g)

sito Asito Bsito C

http://people.a2000.nl/phyde/Images/amstel_magere_brug.jpg

Amsterdam – Veduta sul fiume Amstel

Risultati

4.3 CAMPAGNE DI MONITORAGGIO EFFETTUATE IN OLANDALe campagne condotte sul fiume Amstel nei Paesi Bassi rientrano in un lavoro eseguito dall’Istituto

di Ricerche OMEGAM di Amsterdam.

Il fiume Amstel è un piccolo fiume canalizzato (20 km) della provincia dell’Olanda Sett. Navigabile,

attraversa Amsterdam e sbocca in un’insenatura dell’Ijsselmeer.

L’analisi quantitativa della metallotioneina effettuata tramite elettroforesi capillare è stata effettuata

su campioni di fegato di abramide e di carpa provenienti dai seguenti siti lungo il fiume Amstel:

sito A1: Vrouwenakker - sito interessato da inquinamento agricolo

sito A2: Uithoorn (Cindu) - sito interessato da inquinamento industriale

sito A3: Amsterdam (Weespertrekvaart) - sito interessato da inquinamento urbano

53

Risultati

Campagna primavera 2000

Nella primavera 2000, si notano differenze significative fra i 3 siti in esame. Il sito A2 risulta essere

più inquinato rispetto ai siti A1 e A3.

Campagna autunno 2000

Nell’autunno del 2000, il sito A3 risulta il più inquinato rispetto all’A1 e A2, tra i quali non si

notano sensibili differenze.

54

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

Site A1 Site A2 Site A3

MT

(mg/

g)

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

A1 A2 A3

MT

(mg/

g)

Risultati

Campagna primavera 2001

Nella primavera 2001, invece il sito A1 risulta più inquinato, anche se le differenze rispetto agli altri

due siti non sono significative.

Campagna autunno 2001

La campagna condotta nell’autunno del 2001 mostra il sito A2 più inquinato rispetto al sito A3.

55

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

A2 A3

MT

(mg/

g)

0,00

0,40

0,80

1,20

1,60

A1 A2 A3

MT

(mg/

ml)

Risultati

Al fine di una corretta interpretazione dei dati ottenuti è importante prendere in considerazione le

analisi chimiche dei sedimenti ed analizzare in questo modo i dati ottenuti alla luce della quantità di

metalli pesanti presenti nei siti di provenienza degli abramidi.

Metalli

Vrouwenakke

r

(A1)

Uithoor

n

(A2)

Amsterda

m

(A3)

Arsenico mg/kg

dw

2.9 42 37

Cadmio mg/kg

dw

<0.2 1.5 2.2

Cromo mg/kg

dw

11 30 64

Rame mg/kg

dw

6 180 110

Mercuri

o

mg/kg

dw

<0.04 3.8 0.92

Piombo mg/kg

dw

15 350 190

Nichel mg/kg

dw

8 48 34

Zinco mg/kg

dw

40 620 500

Negli animali acquatici l’aumento di metallotioneina appare caratteristico dell’esposizione a

cadmio, rame e zinco.

Le analisi quantitative della metallotioneina hanno confermato una maggiore induzione di questa

proteina nel fegato degli abramidi provenienti dal sito A2; tuttavia, vista la scarsa percentuale di

cadmio, rame e zinco nei sedimenti del sito A1 rispetto a quelli degli altri due siti, la differenza di

induzione di metallotioneina nel sito A1 rispetto ai siti A2 ed A3 non è così rilevante come atteso, in

particolare nell’istogramma relativo alle campagne dell’anno 2000. Inoltre le analisi statistiche non

hanno mostrato differenze significative tra i siti A2 e A3.

Il fatto che i dati ottenuti dalle analisi della metallotioneina rispecchino l’andamento delle analisi

chimiche, ma le differenze tra i valori assoluti di A1 rispetto ad A2 e A3 non siano rilevanti, è

56

Risultati

prevedibile, dal momento che l’utilizzo di specie selvatiche nei programmi di monitoraggio della

qualità delle acque è limitato dalla natura mobile dei pesci, dalla disomogeneità genetica, dalla

storia di esposizione e dalle differenze di età e di sesso. Tali limitazioni possono essere eliminate

utilizzando pesci di allevamento portati nei siti di monitoraggio (Hanninen et al., 1986). I pesci

provengono da uno stesso stock ed è quindi possibile conoscerne le caratteristiche genetiche e la

storia espositiva. Durante lo stoccaggio vengono mantenuti in condizioni di allevamento standard

per quanto riguarda la temperatura, la dieta (controllata per il contenuto in inquinanti) e la qualità

dell’acqua. Tale tipo di approccio consente anche di confrontare i dati tra i vari gruppi di pesci.

Al riguardo è stata effettuata una campagna lungo il fiume Amstel, in cui è stato scelto come

bioindicatore la carpa, i cui campioni posizionati nei tre siti di studio provenivano da un

allevamento in cui erano mantenuti in acque pulite. Di questi pesci era pertanto possibile conoscere

le caratteristiche genetiche, il sesso, l’età, l’alimentazione.

Campagna con carpe in gabbia

Nella campagna olandese effettuata esponendo le carpe in gabbia per 4 settimane, i livelli di MTs

sono superiori nel sito A3 rispetto al sito A2 e A1.

Nonostante i dati ottenuti con questo tipo di monitoraggio siano migliori, le differenze sono ancora

molto limitate; inoltre non si conoscono gli effetti di possibili patologie infettive che sono un reperto

comune nei pesci allevati in gabbia a causa dell’intensività.

57

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

Site A1 Site A2 Site A3

MT

(mg/

g)

A1 A2 A3

Risultati

4.4 CAMPAGNE DI MONITORAGGIO EFFETTUATE IN GERMANIAI campioni di fegato da cui è stata estratta la metallotioneina sono stati prelevati da abramidi

provenienti da fiumi della Germania.

Le analisi quantitative della metallotioneina effettuate tramite elettroforesi capillare hanno dato i

seguenti risultati:

Campagna autunno 2000

Nei tre fiumi monitorati si evidenziano quantitativi di inquinamento simili, senza significative

differenze fra i siti.

Campana autunno 2001

In questa campagna i siti valutati non mostrano significative differenze tra di loro.

58

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

Havel Spree Dahme

mg

MT/

g

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

A1 A2 A3

MT

(mg/

g)

Risultati

Campagna primavera 2002

I dati indicano l’assenza di differenze significative tra i siti in esame; non è pertanto posssiblie

indicare con precisione il sito ad inquinamento maggiore.

Anche in Germania sono state effettuate alcune campagne utilizzando pesci esposti in gabbia alle

acque dei siti da valutare.

Prima campagna con pesci in gabbia, primavera 2001

I livelli di MT sono maggiori nel sito A2 rispetto ai siti A1, A3, A4.

59

0,05

0,15

0,25

0,35

0,45

de1 de2 de3

MT

(mg/

g)

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

A1 A2 A3 A4

MT

(mg/

g)

Risultati

Seconda campagna con pesci in gabbia, autunno 2001

Il sito A2 mostra livelli di metallotioneine superiori al sito A1.

Dai risultati delle nostre ricerche, per ora si può concludere che la metallotioneina è in grado di

evidenziare differenze fra siti in cui le alterazioni dei livelli chimici di metalli pesanti sono franche e

nette. Questa osservazione trova ulteriore conferma nei dati ottenuti con i pesci in gabbia. Conferme

a quanto fino ad ora osservato derivano dai dati ottenuti con i pesci del fiume Amstel catturati allo

stato libero ed in gabbia. In questi esperimenti le differenze osservate con i pesci in gabbia erano

nettamente più marcate rispetto a quelle ottenute con i pesci catturati.

60

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

A1 A2

MT

(mg/

g)

Risultati

4.5 ESPOSIZIONE AI METALLI NELLE PIANTELe piante come tutti gli organismi viventi hanno sviluppato diversi meccanismi di risposta ai metalli

finalizzati a diminuirne l’effetto tossico.

Questi meccanismi tendono in primo luogo a limitarne l’ingresso nella cellula attraverso la

riduzione del movimento e il legame con la parete cellulare. La membrana plasmatica inoltre è in

grado di ridurne la captazione o espellerli attraverso meccanismi di trasporto attivo.

Una volta nella cellula, per mantenerli in forma non tossica, i metalli vengono chelati a ligandi

endogeni come le fitochelatine, le metallotioneine e gli acidi carbossilici oppure

compartimentalizzati nel vacuolo grazie a complessi con le fitochelatine o ad antiporti con

l’idrogeno.

4.5.1 Identificazione del picco delle fitochelatine Le fitochelatine rappresentano una delle possibili risposte delle piante all’esposizione ai metalli

pesanti. La loro composizione, ricca di residui cisteinici, e la loro struttura tridimensionale sono

molto simili a quelle delle metallotioneine tanto che spesso vengono erroneamente classificate come

appartenenti alla classe III delle MTs.

Per escludere che i picchi considerati non siano in realtà attribuibili a complessi molecolari di

fitochelatine sono state effettuate delle corse elettroforetiche con standard di PCn prodotti

enzimaticamente presso il Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare dell’Università degli

studi di Parma.

Campione di Zea mays trattato con cromo (sinistra) e standard di fitochelatine (destra).

61

Metallotioneine Fitochelatine

Risultati

4.5.2 Analisi delle metallotioneineL’area dei picchi riconducibili alle metallotioneine è stata calcolata in base al tempo di ritenzione. I

risultati sono riportati come variazione percentuale rispetto al controllo (campione trattato con

acqua). Il grafico mostra l’induzione delle metallotioneine nel Lepidium sativum trattato con

K2Cr2O7.

Induzione delle metallotioneine nel Lepidium sativum trattato con K2Cr2O7. I dati cerchiati non mostrano tra

loro una differenza statisticamente significativa.

È evidenziabile un incremento dose dipendente nell’espressione delle metallotioneine all’aumentare

della concentrazione di metallo.

Già a basse dosi d’esposizione si ha un induzione elevata rispetto il controllo fino a raggiungere il

massimo (400%) a concentrazioni di 200 mg/l.

Induzione delle metallotioneine in Zea mays trattato con K2Cr2O7. I dati cerchiati non mostrano tra loro una

differenza statisticamente significativa.

62

0.01 0.10

100

200

300

400

500

600

1 10 100mg/l K2Cr2O7

Var

iazi

one

% /

cont

rollo

0.010.10

250

5002000

10 100 1000mg/l K2Cr2O7

Var

aizi

one

% /

cont

rollo

Risultati

Anche nel mais, l’induzione delle metallotioneine si presenta già a basse concentrazioni di

bicromato, ma aumenta considerevolmente solo a concentrazioni superiori a 300 mg/l, fino a

raggiungere un valore massimo di induzione del 2.000% a 1.500 mg/l.

4.5.3 Determinazione del cromo nei germogliDopo 72 h di esposizione dei semi alle diverse concentrazioni di bicromato è stata determinata la

quantità di metallo assorbita dai germogli, mediante spettroscopia ad assorbimento atomico.

Accumulo di cromo in germogli di Z. mays trattati con concentrazioni crescenti di K2Cr2O7.

Per i semi di mais la quantità di cromo presente nei germogli e nell’endosperma è stato calcolato

separatamente.

I dati ottenuti mostrano che l’accumulo del metallo è dose dipendente ed interessa principalmente il

germoglio, arrivando a concentrazioni simili a quelle esterne. Nell’endosperma questo accumulo è

invece decisamente inferiore.

63

0 250 500 750 1000 1250 15000

500

1000

1500GermoglioEndospermaSomma

K2Cr2O7 (mg/l)

ppm

Cr

0 50 100 150 2000

1000

2000

K2Cr2O7 (mg/l)

ppm

Cr

Risultati

Accumulo di cromo in germogli di L. sativum trattati con concentrazioni crescenti di K2Cr2O7.

Anche i semi di crescione presentano un accumulo di cromo dose dipendente.

Rispetto al mais, però, la concentrazione interna è fino a 10 volte superiore a quella esterna.

I dati su entrambe le specie ci permettono di concludere che il cromo viene assorbito dai germogli

durante le prime fasi di crescita e di escludere l’impermeabilità come eventuale meccanismo di

risposta al tossico.

64

Risultati

4.5.4 Metallotioneine e cromoConfrontando i dati ottenuti dall’accumulo del cromo e dall’induzione delle metallotioneine nei

semi esposti al bicromato, si può osservare come i due parametri siano correlati tra loro e come la

concentrazione di MTs aumenti in relazione al cromo accumulato. Nel mais tale aumento si presenta

lineare a tutte le concentrazioni interne di cromo rilevate. Nel crescione invece si osserva un

andamento di tipo parabolico con il raggiungimento di un plateau per valori superiori a 1.000 ppm.

Relazione tra il cromo assorbito e l’induzione delle metallotioneine in Z. mays trattato con K2Cr2O7.

Relazione tra il cromo assorbito e l’induzione delle metallotioneine in L. sativum trattato con K2Cr2O7.

65

0 250 500 750 1000 1250 1500 17500

100

200

300

400

500

R2 = 0.9777

Cromo (ppm)

MT

s (%

/ co

ntro

llo)

0 250 500 750 1000 12500

100

200

300

400

500

R2 = 0.9738

Cromo (ppm)

MT

s (%

/ co

ntro

llo)

Risultati

4.5.5. Test di fitotossicità cronica brevePer valutare gli effetti prodotti dai metalli pesanti sulla germinazione e allungamento radicale si

sono effettuati saggi di tossicità cronica breve esponendo i semi di entrambe le specie vegetali

considerate a concentrazioni crescenti di CdCl2, CuCl2 e K2Cr2O7. La valutazione dell’allungamento

radicale e della germinazione è stata effettuata dopo 72 ore ottenendo un indice IG% (indice di

germinazione inibita percentuale rispetto al controllo) che tiene conto di entrambi i parametri.

Le concentrazioni di tossico utilizzate variano per le due specie in base alla diversa suscettibilità ai

tossici:

L. sativum 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 mg/l per ogni metallo.

Z. mays 2, 5, 20, 50, 100, 300, 600 mg/l per CdCl2, CuCl2 e 2, 5, 20, 50, 100, 300, 600, 900, 1200,

1500 mg/l per K2Cr2O7.

Il controllo è rappresentato dai semi fatti germinare con acqua deionizzata.

Indice di germinazione inibita percentuale del L. sativum trattato con CuCl2, K2Cr2O7 e CdCl2.

Come si può osservare nella figura, l’inibizione della germinazione e dell’allungamento radicale nel

Lepidium sativum aumenta con la concentrazione di metallo.

L’efficacia di CuCl2 e K2Cr2O7 nell’inibire la germinabilità e l’allungamento radicale del L. sativum

è simile, raggiungendo un IG% dell’80% per concentrazioni di 200 mg/l. Tuttavia a basse

concentrazioni si ha inibizione maggiore dopo esposizione dei semi a CuCl2. Gli effetti del CdCl2 e

K2Cr2O7 al contrario sono simili in tutto l’intervallo di concentrazioni considerato.

66

0.01 0.10

25

50

75

100

K2Cr2O7

CdCl2

CuCl2

10 100

Conc mg/l

IG%

/ C

ontr

ollo

Risultati

Indice di germinazione inibita percentuale di Z. mays trattato con CuCl2, K2Cr2O7 e CdCl2.

Per quanto riguarda i germogli di Zea mays è evidente come l’effetto del bicromato si discosti da

quello degli altri metalli: oltre ad avere una potenza inferiore, l’inibizione della germinazione e

dell’allungamento radicale (IG%) raggiunge un valore massimo del 75% alla concentrazione di

1500 mg/l. L’effetto dell’esposizione a concentrazioni crescenti di CdCl2 è più rilevante e determina

un valore di IG% del 92% a 600 mg/l. L’IG% massimo, ottenuto a 600 mg/l di CuCl2, è dell’83%.

67

0.01

0.10

25

50

75

100

K2Cr2O7CdCl2CuCl2

10 100

1000

Conc mg/l

IG%

/ C

ontr

ollo

Discussione

5- DISCUSSIONE

Il problema dell’inquinamento delle acque è di estrema attualità dal momento che ogni giorno

vengono immessi in laghi e fiumi scarichi industriali di origine agricola ed urbana che riversano

nelle acque sostanze organiche ossidabili, organismi patogeni e sostanze tossiche.

Uno dei metodi utilizzati per verificare se un certo ecosistema è affetto da una contaminazione tale

da determinare effetti rilevanti a carico di una o più delle sue componenti è quello del monitoraggio

chimico, che può essere condotto attraverso l’analisi di tracce di composti tossici nelle acque. Tale

approccio è piuttosto costoso, richiede strumentazioni complesse e personale specializzato.

Un secondo sistema di monitoraggio si basa su parametri biologici rilevati nelle specie esposte sia in

campo che in laboratorio. Mentre i dati biologici integrano gli effetti di inquinanti noti e non noti, le

analisi chimiche valutano la situazione ambientale esclusivamente sulla base dei composti presi in

considerazione. La moderna tossicologia ambientale ha pertanto sottolineato l’importanza di

monitorare le acque dal punto di vista biologico. Uno degli strumenti applicabili ai protocolli di

monitoraggio biologico è costituito dai biomarcatori. Il vantaggio fondamentale nell’utilizzo dei

biomarcatori consiste nel fatto che forniscono una misura dello stress in corso nell’organismo ed

una risposta immediata all’esposizione agli agenti inquinanti prima del verificarsi di effetti deleteri.

A questo si aggiunga che i biomarcatori riflettono l’esposizione a specifici tossici o a gruppi di

tossici aggiungendo informazioni al monitoraggio biologico classico, che invece riflette

esclusivamente la situazione generale dello stato dell’ambiente senza fornire indicazioni specifiche

sui tipi di inquinanti coinvolti.

Recentemente sono stati compiuti molti progressi nella messa a punto delle metodiche relative

all’elettroforesi capillare, che attualmente offre la possibilità di separare e quantizzare molti tipi di

composti biologici. Si tratta di una tecnica versatile e idonea ad essere applicata in laboratori

dedicati al monitoraggio ambientale che prevede batterie di test per la misurazione di numerosi

parametri proteici.

In questo lavoro l’elettroforesi capillare è stata applicata alla valutazione dei livelli di

metallotioneine in specie acquatiche sentinella esposte o catturate in acque dolci.

La validazione del metodo è stata effettuata mediante confronto con gli standard di metallotioneina

pura, l’utilizzo di una lettura spettrofotometrica a lunghezza d’onda diversa che si basa sulle

proprietà chimiche specifiche delle metallotioneine e sulla base del dosaggio di campioni estratti da

fegato di animali controllo e trattati con un agente che induce in modo specifico la sintesi delle

metallotioneine.

Recentemente il ruolo fondamentale delle MTs è stato considerato nell’omeostasi di elementi

traccia essenziali, come il rame e lo zinco, e nella detossificazione dei metalli non essenziali

(Viarengo, 1998). Inoltre si tratta di un biomarcatore sensibile e specifico per i metalli pesanti già

68

Discussione

utilizzato in altri lavori effettuati su specie acquatiche. Sulla base di queste osservazioni abbiamo

cercato di applicare questo parametro per lo studio dei livelli di inquinamento da metalli pesanti in

alcuni fiumi europei.

Lo studio delle MTs nelle nostre condizioni sperimentali non ha fornito risultati soddisfacenti.

Infatti è stata osservata una mancanza di riproducibilità dei dati ed una scarsa correlazione con i dati

chimici. Questo è stato osservato sia in pesci catturati allo stato libero che in pesci esposti in gabbia.

Il fatto che l’espressione delle MTs nei pesci sia in grado di discriminare in modo netto solo siti

molto inquinati rispetto quelli non inquinati e che altri fattori fisiologici e infettivi possano

interferire con questo parametro rende di difficile applicazione il suo utilizzo nel monitoraggio dei

fiumi da noi considerati e non consente conclusioni definitive. Quindi si sta cercando di valutare dei

bioindicatori in alternativa all’utilizzo dei pesci e nei quali le MTs vengano espresse in modo più

riproducibile e riflettano meglio la situazione ambientale. Sulla base dei vantaggi offerti dai

bioindicatori vegetali abbiamo iniziato una ricerca preliminare in laboratorio per studiare

l’espressione delle MTs in un modello vegetale. L’accumulo di metalli pesanti nella catena trofica,

dovuto alla loro persistenza e all’impossibilità di essere metabolizzati, ed il ruolo delle piante come

principale punto di ingresso degli inquinanti nella catena alimentare, hanno motivato lo studio dei

meccanismi alla base della risposta tossica in organismi vegetali.

Sono state selezionate due specie vegetali: Lepidium sativum L. (crescione), già utilizzato nei

protocolli di monitoraggio ambientale per la sua nota sensibilità agli inquinanti, e Zea mays L.,

meno suscettibile all’effetto di tali tossici ed il cui genoma è stato parzialmente sequenziamento.

In entrambi i modelli l’inibizione della germinazione e dell’allungamento radicale, espressa come

IG%, aumenta in funzione della concentrazione del metallo. L’inibizione sembra inoltre essere

correlata ad un livello soglia che nel mais si presenta a concentrazioni superiori (10 mg/l per il

crescione e 100-300 mg/l per il mais). Inoltre per poter osservare una risposta fitotossica

paragonabile a quella del crescione, nel mais è stato necessario aumentare la concentrazione dei

metalli considerati oltre i 600 mg/l, ottenendo comunque un IG% inferiore.

La valutazione dell’accumulo del cromo nei germogli ha consentito di osservare che entrambe le

specie non sono impermeabili al metallo e che l’accumulo è dose-dipendente. Però, mentre nel mais

la concentrazione interna di cromo non supera mai quella esterna, nel crescione le concentrazioni

nel seme raggiungono valori 10 volte superiori a quelli esterni. Ciò suggerisce che possa esserci un

fenomeno di trasporto attivo del metallo all’interno del germoglio del crescione.

In entrambi i campioni è stata valutata l’induzione di metallotioneina mediante elettroforesi

capillare (MECC). Nelle due specie vegetali considerate, in seguito all’esposizione al cromo è stata

osservata una differenza nei livelli di MTs. Nel crescione l’induzione di MTs aumenta in funzione

della concentrazione esterna del metallo fino a raggiungere il massimo a concentrazioni di 200 mg/l

(400% rispetto il controllo). Nel mais l’induzione, pur presentandosi già a basse concentrazioni,

69

Discussione

mostra un aumento considerevole solo a concentrazioni superiori a 300 mg/l di K2Cr2O7 fino a

raggiungere un valore massimo di induzione del 2000% a 1500 mg/l.

Confrontando i dati ottenuti dall’accumulo del cromo e dall’induzione delle metallotioneine nei

semi esposti al bicromato, si può osservare come i due parametri siano correlati tra loro e come la

concentrazione di MTs aumenti in relazione al cromo accumulato. Nel mais tale aumento si presenta

lineare a tutte le concentrazioni interne di cromo rilevate. Nel crescione invece si osserva un

andamento di tipo parabolico con il raggiungimento di un plateau per valori superiori a 1000 ppm.

Ciò suggerisce che le metallotioneine abbiano un ruolo essenziale nella detossificazione da cromo e

possano conferire resistenza al metallo legandone gli ioni come già suggerito per il sorgo .Sulla base

di queste prime osservazioni si può concludere che esiste una buona correlazione fra l’espressione

delle MTs e l’esposizione ai metalli pesanti, che appare lineare già per basse concentrazioni di

esposizione. Si può proporre direttamente un’indagine delle acque basate su questi test, che

possiedono il vantaggio di essere economici e di evitare eventuali problemi sulla sperimentazione

animale. Successivamente si potrebbero completare le ricerche riguardanti l’espressione delle MTs e

confermare l’esposizione a metalli pesanti utilizzando specie di invertebrati, come su protocolli già

messi a punto.

L’applicazione di questo parametro ad altri modelli vegetali in campo richiede invece un notevole

approfondimento e studio.

70

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Curriculum vitae

Dati anagrafici

Nome e Cognome Fortunato La RoccaLuogo e data di nascita Milano, 10 Maggio 1977Residenza Viale Lucania, 15 - 20139 MilanoCittadinanza ItalianaRecapiti telefonici Casa 02.45.49.32.86 - Cell. 338.96.17.900E-mail fortu77@libero.itStato civile CelibePosizione di leva Assolto

Esperienze professionali

Febbraio 2003Ho lavorato presso l’istituto di Scienze Farmacologiche di Milano, nell’ambito di un programma di ricerche approvato dalla Comunità Europea.

Dicembre 2004Collaborazione presso D.H.L. in via Fantoli - Milano, come magazziniere.

Settembre 2003Collaborazione nel call center presso I.N.R.A. Demoskopea in via Muratori - Milano.

Gennaio 2002Addetto alla sicurezza presso il negozio Gucci in via Montenapoleone, 5 - Milano, per conto della società AVOGADRO Srl.

Settembre 2000 Addetto al servizio ospitalità nelle manifestazioni organizzate dall’agenzia Clear Channel e in alcune trasmissioni televisive organizzate dalla Trident Agency, per conto della societàALLWORKS.

Gennaio 1999Collaborazione lavorativa presso la Cooperativa “Copat” in via Arese - Milano, con funzioni di addetto alla logistica.

Istruzione

Laurea in Scienze Naturali con indirizzo Conservazione della Natura e le sue Risorse.

Titolo della tesi:BIOMARCATORI E BIOINDICATORI NELLA VALUTAZIONE DELLA QUALITÀ DELLE ACQUE INTERNE.Condotta sotto la guida del (relatore) Prof. Giordana Barbara presso i laboratori del Dipartimento di Scienze Farmacologiche dell’Università degli Studi di Milano coordinato dalla Dott. Agradi Elisabetta (tale lavoro di tesi ha avuto la durata di 15 mesi).

Diploma di Perito Tecnico Agrario Industriale conseguito presso l’I.T.A.S. “Gregorio Mendel” di Noverasco Milano, nell’anno 1996.

Lingue straniere

Discreta conoscenza della lingua inglese parlata e buona dimestichezza con l’inglese tecnico.

Conoscenze informatichee strumentali

Uso continuato per due anni del Personal Computer (Ambiente Windows) come normale mezzo di lavoro, sviluppando così padronanza nell’uso delle applicazioniMicrosoft (Word, Power Point Excel...).

Buona abilità nella navigazione internet e nell’utilizzo della posta elettronica.

Buona conoscenza nell’utilizzo di apparecchiature di analisi quali: Elettroforesi Capillare.

Io sottoscritto, Fortunato La Rocca , autorizzo il trattamento dei propri dati personali in conformità alle disposizioni della legge n° 675/96.

Fortunato La Rocca