MICROSCOPIA A FLUORESCENZA

Microscopia a fluorescenza

FluorescenzaCapacità di assorbire radiazioni elettromagnetiche di una certa lunghezza d'onda e di emettere una frazione dell’energia assorbita con radiazione elettromagnetiche di una lunghezza d’onda differente e superiore a quella assorbita.

Microscopia a fluorescenza Usa la luce ultravioletta, a una lunghezza d’onda 200-400 nanometri le strutture sono analizzate in base alla fluorescenza che emettono nello spettro visibile.

AUTOFLUORESCENZA Prodotta da sostanze normalmente presenti nel tessuto. Es: citoplasma (debole luce bluastra), i granuli (intensa luce giallognola), e i mitocondri (forte emissione fluorescente). Il nucleo, al contrario, non è autofluorecente. FLUORESCENZA SECONDARIAIndotta da una colorazione con sostanze fluorescenti, dette fluorocromi (fluoresceina o rodamina).

Microscopia a fluorescenza

Studio morfologia nucleare: COLORAZIONE CON HOECHST

Il colorante HOECHST fa parte della famiglia di coloranti che evidenziano il DNA al microscopio a fluorescenza.

Pertanto è utilizzato per visualizzare i nuclei e i mitocondri.

Microscopia a fluorescenza

Studio morfologia nucleare: COLORAZIONE CON ARANCIO DI ACRIDINA

L’arancio di acridina è un colorante fluorescente per gli acidi nucleici. In particolare colora in verde il DNA e in rosso l’ RNA

Microscopia a fluorescenza

Immunofluorescenza UTILIZZO DI ANTICORPI MARCATI CON UNA SOSTANZA

FLUORESCENTE TRATTAMENTO DELLE SEZIONI ISTOLOGICHE CON GLI

ANTICORPI MARCATI OSSERVAZIONE AL MICROSCOPIO A FLUORESCENZA

METODO DIRETTOLa sostanza fluorescente è legata direttamente all’anticorpo prodotto contro l‘antigene cercato.

METODO INDIRETTOAnticorpo primario che riconosce l’antigene cercato.

Antcorpo secondario, a cui è legata la sostanza fluorescente, che riconosce l’anticorpo primario

Immunofluorescenza modello di membrana a mosaico fluido

- ESTRAZIONE proteine di membrana- INOCULAZIONE in conigli diversi- ESTRAZIONE dei 2 tipi di anticorpi- MARCATURA differenziale anticorpi

- FUSIONE CELLULARE (Virus Sendai)

- TRATTAMENTO con i due anticorpi

- OSSERVAZIONE della marcatura al microscopio a fluorescenza

Topo Uomo

Microscopia a fluorescenza

Immunofluorescenza

Microscopia a fluorescenza

MICROSCOPIA ELETTRONICA

Microscopia elettronica

Limite di risoluzione molto più elevato di quello ottico Non viene utilizzata la luce per rivelare il preparato, ma un

fascio di elettroni accelerato fortemente Immagini ultrastrutturali del preparato in bianco e nero, e

non colorate come nella microscopia ottica

1) MICROSCOPIA ELETTRONICA A TRASMISSIONEIl preparato è sezionato e sono visualizzate le strutture interne

2) MICROSCOPIA ELETTRONICA A SCANSIONEIl preparato NON è sezionato e sono visualizzate le strutture

esterne, quindi la struttura tridimensionale del campione

Microscopia elettronica a trasmissione

Microscopio elettronicoa trasmissione

filamento(catodo)

anodo

condensatore

preparato

obiettivo

proiettore

schermofluorescente

Microscopia elettronica a trasmissione

PrelievoLavaggio in tampone fisiologico

Taglio in frammenti molto piccoli (1mm diametro)

FissazioneGlutaraldeide

lavaggi in tampone Tetrossido di osmio (OsO4)

DisidratazioneEtanolo, simile alla microscopia ottica

InclusioneResine liquide che solidificano a 70°C

Piccoli contenitori cilindrici

Microscopia elettronica a trasmissione

Sezionamento- Lama di diamante

- Sezioni ultrafini (50-70 nm) - Retini dotati di griglia

ColorazioneSali di metalli pesanti

- URANIO (acetato di uranile) Lavaggi in acqua distillata- PIOMBO (citrato di piombo)

Ultramicrotomo

Microscopia elettronica a trasmissione

Microfotografia al microscopio elettronico di un linfocita B umano

Mitocondrio

Microscopia elettronica a trasmissione

Microscopia elettronica a scansione

MICROSCOPIO ELETTRONICO A TRASMISSIONE: gli elettroni accelerati attraversano la sezione del campione e raggiungono uno schermo fluorescente (immagine in bianco e nero, stuttura interna del campione)

MICROSCOPIO ELETTRONICO A SCANSIONE: gli elettroni colpiscono il campione NON sezionato, che produce elettroni secondari, che raggiungono uno schermo, dove vengono integrati gli impulsi provenienti da tutte le direzioni (immagine in bianco e nero, struttura esterna tridimensionale del campione)

Microscopia elettronica a scansione

Procedura- Prelievo- lavaggio- Fissazione- Essiccamento (essiccatore)- Metallizzazione (metallizzatore) (ricopertura con oro o argento)

Il fascio elettronico urta il campione. Produzione di elettroni secondari raccolti da un sensore ed integrati in un monitor a formare l’immagine tridimensionale della struttura esterna

Microscopio elettronico a scansione

Microscopia elettronica a scansione

Microscopia elettronica

Tecnica dell’immunogold (Immunolocalizzazione al microscopio elettronico) • Particelle sferoidali di oro colloidale (5-30 nanometri) coniugate con

anticorpi specifici per l’antigene cercato

• Oro è opaco agli elettroni

• Possibilità di localizzazioni multiple

Trasmissione Scansione