Determinazione della concentrazione di IgG tramite saggio immunoenzimatico competitivo

COATING

Preparare 10 mL di una soluzione di IgG di rabbit 1g/mL in tampone carbonato 0.05M pH 9.6

(soluzione A) a partire da una soluzione di un 1mg/mL.

Addizionare 200L della soluzione A in ciascun pozzetto e lasciare incubare per 1 h a temperatura

ambiente (RT);

Preparare 250 mL di PBS + TWEEN 0.05%.

Effettuare 3 lavaggi con 200L di PBS + TWEEN 0.05%.

BLOCCAGGIO

Preparare 5 ml di BSA 5% in carbonato

Addizionare nei pozzetti 200L di una soluzione al 5% di BSA in tampone carbonato (1h RT);

3 lavaggi con 200L di PBS + TWEEN 0.05%.

COMPETIZIONE

Preparare, per diluizioni successive, 1 ml di 5 soluzioni standard di IgG (in PBS):

100, 10, 1, 0.1, 0.01 g/mL.

Preparare 5 mL di una soluzione di Mab-AP 1:1000 (v/v). Successivamente, preparare 10 mL di una

soluzione 1:10000 (v/v) per diluizione 1:10 (v/v) della soluzione di Mab-AP precedente.

Secondo lo schema riportato in figura, addizionare in ogni pozzetto 100 L di IgG di rabbit alle

concentrazioni sopra indicate e 100 L di MAb-AP (1:10000 in PBS) . Porre nei pozzetti 7A, 7B, 7C, al

posto dello standard, 100 L del campione incognito.

* nei 3 pozzetti (1A,1B,1C) di non competizione porre 100 L di MAb-AP + 100 L di PBS.

Incubare 1h a RT.

3 lavaggi con 200L di PBS + TWEEN 0.05%.

LETTURA

Preparare 50 mL di una soluzione di 4-nitrofenilfosfato (11 mM) preparata in tampone Carbonato 0.05M

pH= 9.6 + MgCl2 1mM

Porre in ogni pozzetto 200L di una soluzione di 4-nitrofenilfosfato (11 mM) preparata in tampone

Carbonato 0.05M pH= 9.6 + MgCl2 1mM

Eseguire la lettura della piastra a 405 nm dopo 5, 10, 15 min.

ELABORAZIONE DATI

Riportare in grafico le assorbanze lette a 405nm in funzione delle concentrazioni utilizzate;

dalla curva ottenuta ricavare la concentrazione del campione incognito.

1 2 3 4 5 6

A

B

C

1 2 3 4 5 6 7

A

B

C

?

?

?

7

0* 0.01 0.1 1 10 100 ? 0* 0.01 0.1 1 10 100 ?

dcx

daxf

b

)/(1

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