•Clonaggio

•PCR

Amplificazione DNA

Vettori di clonaggio

Plasmidi

Virus

Trasposoni

Minicromosomi artificiali

Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

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sito di restrizione

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Gli enzimi di restrizione possono generare diversi tipi di estremità

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Uso degli enzimi di restrizione

•Clonaggio

•Mappa di restrizione

•Polimorfismi di restrizione (RFLP)

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Preparazione dei frammenti di DNA da clonare

Giunzione del DNA da clonare al vettore

Introduzione nella cellula ospite

Selezione

Scelta e preparazione del vettore

Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi

Analisi dei prodotti

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Vettori plasmidici

1.Origine di replicazione

2.Marcatore di selezione

3.Sito di restrizione unico

Elementi di un vettore plasmidico

Preparazione dei frammenti di DNA da clonare

Scelta e preparazione del vettore

Giunzione del DNA da clonare al vettore

Introduzione nella cellula ospite

Selezione

Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi

Analisi dei prodotti

Preparazione del DNA da clonare

Frammento di DNA genomicoche può contenere regionitrascritte o non trascritte

cDNA: DNA ottenuto per trascrizione inversa dell’mRNA, che quindi contiene tutto o parte di una regione trascritta

frammentato conenzimi di restriz.

frammentazionemeccanica

DNA specifico

Collezione DNA(banca, genoteca)

Digestione clone già esistente

PCR

Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

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PREPARAZIONE del cDNA

RNA

DNA

Preparazione dei frammenti di DNA da clonare

Scelta e preparazione del vettore

Giunzione del DNA da clonare al vettore

Introduzione nella cellula ospite

Selezione

Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi

Analisi dei prodotti

Inserzione di un frammento di DNA in un vettore circolaremediante ligasi di estremità coesive

GAATTCCTTAAG

GAATTCCTTAAG

GAATTCCTTAAG

GCTTAA

AATTC G

EcoRI

GAATTC

CTTA

AGGAATT

CCTT

AAG

DNA ligasi

AATTC G

GCTTAA

EcoRI

VETTORE

INSERTO

Unione, mediante ligasi,di estremità coesive create da un enzima di restrizione

GAATTCCTTAAG

G CTTAA

AATTC G

EcoRI

GAATTCCTTAAG

GAATTCCTTAAG

DNA ligasi

GAATTCCTTAAGVETTORE

G CTTAA

AATTC G INSERTO

•strategie

•controlli

Reazione di ligasi

Inserzione di un frammento di DNA in un vettore circolaremediante ligasi di estremità coesive

GAATTCCTTAAG

GAATTCCTTAAG

GAATTCCTTAAG

GCTTAA

AATTC G

EcoRI

GAATTC

CTTA

AGGAATT

CCTT

AAG

DNA ligasi

AATTC G

GCTTAA

EcoRI

VETTORE

INSERTO

trattamento del vettore con fosfatasi

GCTTAAp

pAATTC G

G A

ATTC

CTTA

ApGG

pAATT

C

CTT

AA G

DNA ligasi

pAATTC G

GCTTAAp

EcoRI

GCTTAA

AATTC G

fosfatasi

GAATTCCTTAAG

GAATTCCTTAAG

Clonaggio con singola digestione

Clonaggio con doppia digestione

GAATTCCTTAAG

GAATTCCTTAAG

AAGCTTTTCGAA

GCTTAA

AGCTT A

EcoRI

AAGCTT

TTCGAAGAATT

CCTT

AAG

DNA ligasi

AATTC G

ATTCGA

EcoRI HindIII

AAGCTTTTCGAA

HindIII

Preparazione dei frammenti di DNA da clonare

Scelta e preparazione del vettore

Giunzione del DNA da clonare al vettore

Introduzione nella cellula ospite

Selezione

Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi

Analisi dei prodotti

Introduzione del DNA nella cellula ospite

Trasformazione: CaCl2

Impacchettamento e infezione fagica

In E.coli Elettroporazione

In cellule dieucarioti superiori

Trasfezione (transiente o stabile): Calcio fosfato

Liposomi

Elettroporazione

Microiniezione

DNA gun

Preparazione dei frammenti di DNA da clonare

Scelta e preparazione del vettore

Giunzione del DNA da clonare al vettore

Introduzione nella cellula ospite

Selezione

Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi

Analisi dei prodotti

Vettori plasmidici

Strategie di selezione nel clonaggio

AMPICILLINA

AMPICILLINA

resistenza

Preparazione dei frammenti di DNA da clonare

Scelta e preparazione del vettore

Giunzione del DNA da clonare al vettore

Introduzione nella cellula ospite

Selezione

Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi

Analisi dei prodotti

1200 bp

SacI

EcoRI

1.lisi cellulare

2.deproteinizzazione

3.concentrazione

Isolamento acidi nucleici

•Spettrofotometro (quantitativa)

•Elettroforesi su gel (qualitativa, semiquantitativa)

Analisi acidi nucleici

Spettro di assorbimento del DNA

220 240 260 280 300 320

0.5

1.0

1.5

lunghezza d’onda (nm)

Assorbanza(OD)

1 OD260=50g/ml

OD260/OD280=1,8-2,0

Elettroforesi di acidi nucleici

•Gel di agarosio

•Gel di acrilammide

Elettroforesi su gel di agarosio

Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

Migrazione del DNA su gel

Le molecole lineari di dsDNA migrano a velocità

inversamente proporzionali al logaritmo in base 10 del

numero di paia di basi.

Fattori che influenzano la migrazione

•Peso molecolare

•Concentrazione di agarosio

•Conformazione DNA

•Voltaggio applicato

•Intercalanti

•Tampone di elettroforesi

Visualizzazione del DNA

Marcatori di peso molecolare

HindIII

Tecniche di trasferimento su membrana (Blotting)

•Southern (blot)

•Northern (blot)

•Western (blot)

BLOTTING (TRASFERIMENTO)

Molecole trasferite

Sonda Gel

Southern DNADNA o RNA

Agarosio o acrilammide

Northern RNADNA o RNA

Agarosio o acrilammide

Western Proteine Anticorpi Acrilammide

Metodi di trasferimento

•Capillare

•Elettroblot

carta 3MM

membrana nylon

gel

supporto

}

carta 3MM

tampone

vaschetta

Assemblaggio del blot capillare

Fattori che influenzano l’ibridazione

•Temperatura

•Forza ionica

•pH