Lars Bioec 2013 · COLTIVAZIONE&DI&BATTERI&ED&ESTRAZIONE&DEI&PLASMIDI& ... LB&Broth&...

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LARS – BIOTEC 2013

Laboratorio di Ricerca sperimentale nel settore delle Biotecnologie ________________________________________________________________________________________________

!

LICEO&“GANDHI”&MERANO&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&LARS&BIOTECNOLOGY!

!

! 2!

Indice&

ABSTRACT&...................................................................................................................................&3!

PCR&(POLYMERASE&CHAIN&REACTION)&.........................................................................................&4!

DEFINIZIONE&DEI&PRIMER&.............................................................................................................&5!

Enzimi&di&restrizione&..................................................................................................................................................&7!

PROTOCOLLO&PER&PCR&.................................................................................................................&9!

Strumenti&e&reagenti&..................................................................................................................................................&9!

Procedimento&............................................................................................................................................................&9!

Reaction&mix&............................................................................................................................................................&10!

Schema&per&PCR&.......................................................................................................................................................&12!

PCR:&AmpR&..............................................................................................................................................................&13!

DIGESTIONE&ENZIMATICA&..........................................................................................................&14!

Reaction&mix&per&digestione:&...................................................................................................................................&14!

PURIFICAZIONE&DEL&DNA&...........................................................................................................&15!

Protocollo&con&centrifugazione&................................................................................................................................&15!

ELETTROFORESI&E&ANALISI&GEL&...................................................................................................&16!

Protocollo&per&la&preparazione&del&gel&in&Agarosio:&..................................................................................................&16!

Protocollo&per&la&colorazione&del&gel&........................................................................................................................&16!

Analisi&Gels&..............................................................................................................................................................&17!

COLTIVAZIONE&DI&BATTERI&ED&ESTRAZIONE&DEI&PLASMIDI&.........................................................&20!

Coltivazione&di&batteri:&............................................................................................................................................&20!

LB&Broth&(coltura&liquida)&.........................................................................................................................................&20!

LB&Agar&(coltura&solida)&............................................................................................................................................&20!

ampicillina&...............................................................................................................................................................&20!

PROTOCOLLO&PER&LA&PREPARAZIONE&DELLE&COLTURE&BATTERICHE:&..........................................&21!

PROTOCOLLO&PER&ESTRAZIONE&DI&PLASMIDI&.............................................................................&23& !

LICEO&“GANDHI”&MERANO&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&LARS&BIOTECNOLOGY&!

! 3!

Abstract&!Studio&e&definizione&dei&Primers!Utilizzando!il!programma!freeware!“SerialCloner!“si!studia!il!plasmide!Pet16B!(expression!vector)!e!

si! decide! di! individuare! il! gene! per! la! resistenza! all’ampicillina! (AmpR).! Si! passa! quindi! alla!

definizione! dei! Primers! (20mer)! per! isolare! tale! gene! e! si! disegnano! primers! (30! mer)! con!

mutazioni! puntiformi,! che! permettano! un! taglio! enzimatico! specifico! successivo,! tale! da! poter!

inserire!il!gene!nel!“multiJcloningJsite”!di!un!plasmide.!

!

Definizione&del&protocollo&per&PCR&Preparazione! del! reaction) mix! per! PCR! e! amplificazione! di! un! gene! con! primers! diversi! e! con!

diverse!temperature!di!annealing.!!

Purificazione&del&DNA&amplificato&Uso!del!kit!di!purificazione!del!DNA!prodotto!con!la!PCR!

&

Digestione&del&DNA&amplificato&Digestione&del!DNA!prodotto!con!la!PCR!con!diversi!enzimi!di!restrizione&!

Analisi&del&DNA&in&gel&in&Agarosio&Preparazione!del!gel!in!Agarosio.!

Corsa!elettroforetica!del!DNA!prodotto!e!digerito.!

Analisi! del! gel!utilizzando!un! foglio!di! calcolo!dei! frammenti!di!DNA! separati! con!elettroforesi! e!

interpretazione!dei!dati!ottenuti.!

!

Coltivazione&di&batteri&Per! la! coltivazione! di! batteri! (Eschirichia! coli)! viene! preparato! il! terreno! di! coltura! che!

successivamente!viene!incubato.!

La!coltura!batterica!viene!trattata!con!ampicillina.!

In!conclusione!viene!estrazione!il!DNA!(plasmidico)!dai!batteri.!

! &


!

! 4!

PCR&(Polymerase&Chain&Reaction)&!

La!PCR!(!polymerase!chain!reaction)!è!un!procedimento!che!permette!di!amplificare!un!segmento!specifico!di!DNA,!

Per!tale!tecnica!devono!essere!disponibili!nucleotidi!per!la!formazione!delle!copie!di!nuovo!DNA!,!un!enzima!specifico!

(DNA!polimerasi),!delle!sequenze!di!innesco!(primers)!e!un!particolare!ambiente!(pH!e!opportune!temperature).!

Viene! utilizzato! un! termociclatore,! cioè! uno! strumento! che! permette! di! controllare! una! sequenza! di! cicli! di!

riscaldamento! e! raffreddamento! in! tempi! prefissati! della! soluzione! di! reazione,! in! modo! che! avvengano!

successivamente! la! denaturazione! del! DNA! iniziale,! l’accoppiamento! degli! inneschi! e! lo! scorrimento! della! DNA!

polimerasi!con!conseguente!duplicazione!del!segmento!!!

Inizialmente ogni ciclo il DNA raddoppia, ma tale incremento si riduce. Si può ricorre alla seguente formula per stabilire il numero di filamenti dopo n cicli:

Yn = A· (1+ E)n

Yn = DNA prodotto dopo n cicli

A =quantità iniziale di DNA presente n = numero di cicli di PCR effettuati E = efficienza dell'amplificazione (in genere compresa tra 0,7 e 0,8 !

! !


! 5!

Definizione&dei&Primer&!

Un! primer! (innesco)! è! un! tratto! di!DNA! con! funzione!di! innesco,! infatti! la!DNAJpolimerasi! non! sintetizza! un! nuovo!

filamento,!ma!riesce!solo!a!completare!un!filamento!iniziale.!Per!la!PCR!vengono!utilizzati!primers!sintetici,!definiti!forward!e!reverse,!il!primo!precede!la!sequenza!da!amplificare!e!

il!secondo!la!segue.!

Un! parametro! importante! è! la! melting( temperature( (temperatura! di! denaturazione),! che! corrisponde! alla!

temperatura! in!cui! il!DNA! inizia!a!denaturare.! La!melting!T!dipende!dal! contenuto!di!AT!o!CG!e!dalla! lunghezza!del!

primer.!Normalmente!è!compresa!tra!i!55!e!i!65°C!

!

Funzionamento(dei(Primers(nella(PCR:(!

!

!

!!

La!prima!fase!corrisponde!allo!studio!e!alla!definizione!dei!Primers:!

Utilizzando! il!programma! freeware!“SerialCloner!“si! studia! il!plasmide!Pet16B! (expression!vector),! che!è! il!plasmide!

estratto!da!E.coli!non!patogeno.!Si!decide!di!individuare!il!gene!per!la!resistenza!all’ampicillina!(AmpR).!Si!passa!quindi!

alla!definizione!dei!Primers!(20mer!cioè!costituiti!da!20!basi)!per!isolare!tale!gene!e!si!disegnano!primers!30!mer!(cioè!

di!30!basi)!con!mutazioni!puntiformi,!che!permettano!un!taglio!enzimatico!specifico!successivo,!tale!da!poter!inserire!il!

gene!nel!“multiJcloningJsite”!di!un!plasmide.!

!

( (


!

! 6!

Primer((20(mer)!per!isolare!il!gene!di!resistenza!all’ampicillina!nel!vettore!pET816b!(basi!209!81066,!per!un!totale!di!858!basi):!!

Questi! primers! sono! le! sequenze! di! 20! basi! che! precedono! e! seguono! la! sequenza! che! vogliamo! duplicare;! vanno!

sempre!scelti!in!direzione!5'JJ>3'!:! AmpRf&&aa&tat&tga&aaa&agg&aag&agt&&&AmpRr&&ta&aac&ttg&gtc&tga&cag&tta&!

Si!può!osservare!che!il!primer!AmpRf!(forward)!corrisponde!alle!20!basi!che!precedono!la!sequenza!scelta!(in!verde)!

sulla!riga!in!alto.!!!

Si!può!osservare!che!il!primer!AmpRr!(reverse)!corrisponde!alle!20!basi!che!seguono!la!sequenza!scelta!(in!verde)!sulla!

riga!in!basso:!

!!!

! (


! 7!

Enzimi&di&restrizione&

Gli!enzimi!di!restrizione!sono!enzimi!che!catalizzano!il!taglio!in!una!sequenza!specifica!(spesso!sono!sequenze!

palindromiche).!Le!estremità!del!taglio!possono!essere:!

blunt(ends(;(sticky(ends(L'enzima!NdeI,!ad!esempio,!produce!un!taglio!sfalsato!creando!due!estremità!(dette!coesive!o!sticky&ends)!a!singolo!filamento!al!5':!

!

5'...C!!!!ATATG...3'!

!!!!!!!|!!!!!!!!!!!!!!|!!

3'...GTATA!!!!C...5'!!

!

Le!estremità!coesive!(cioè!"appiccicose")!che!si!sono!create,!possono!appaiarsi!con!sequenze!complementari.!

!

Altri!enzimi!producono!blunt!ends;!ad!esempio!il!taglio!di!SmaI!non!produce!estremità!coesive,!ma!estremità!"piatte"!

(blunt&ends):!!

5'...CCC!!GGG...3'!

!!!!!!!|||!!!|||!!

3'...GGG!!CCC...5'!!

!

Alcuni!esempi:!

Enzima! Organismo&di&origine! Sequenza&consenso! Taglio!

EcoRI! Escherichia)coli! 5'GAATTC!!

3'CTTAAG!!

5'JJJG!!!!!AATTCJJJ3'!!

3'JJJCTTAA!!!!!GJJJ5'!!

NdeI! Neisseria)denitrificans! 5'CATATG!!

3'GTATAC!

5'JJJCA!!!!!TATGJJJ3'!!

3'JJJGTAT!!!!!ACJJJ5'!

BamHI! Bacillus)amyloliquefaciens! 5'GGATCC!!3'CCTAGG!!

5'JJJG!!!!!GATCCJJJ3'!!

3'JJJCCTAG!!!!!GJJJ5'!!

XhoI! Xanthomonas)holcicola! 5'CTCGAG!!

3'GAGCTC!

5'JJJC!!!!!TCGAGJJJ3'!!

3'JJJGAGCT!!!!!CJJJ5'!

PstI! Providencia)stuartii! 5'CTGCAG!!

3'GACGTC!

5'JJJC!!!!!TGCAGJJJ3'!!

3'JJJGACGT!!!!!CJJJ5'!

!

!

&Primers(che(contengono(le(sequenze(degli(enzimi(di(restrizione&necessari!per!inserire!i!geni!specifici!nel&Sito)multiplo!di!clonaggio!(Multiple!cloning!site!MCS).!

!I!primers!saranno:!

• CG!rich,!cioè!se!possibile!scelti!con!alta!frequenza!di!guanina!e!citosina!all’inizio!e!alla!fine!della!sequenza!(perché!

tra!C!e!G!si!formano!tre!legami!ad!H,!tra!A!e!T!solo!due,!quindi!l’annealing!è!più!resistente!)!

• 28J30!mer!(!in!italiano!“30!mero”!costituito!da!30!basi)!

• il!reverse!deve!contenere!la!sequenza!dell’enzima!(deve!essere!a!destra!della!tripletta!di!stop!TAA)!

• possono!avere!mutazioni!puntiformi!(meno!sono!e!più!efficace!è!il!funzionamento)!che!devono!essere!all’incirca!a!

metà!del!primer!

!

!

esempi:!

!!!!!!!!!!!!!!!!inizio!sequenza!genica!del!βJlactamase!

....A!A!G!A!G!T!A!T!G!A!G!T!A!T!....!

!!!!!!!!!!!!!!!!C!A!T!A!T!G!!!!

!!!!!!!!!!!!!!!!NdeI!!!

!

In!grigio!sono!evidenziate!le!due!mutazioni!puntiformi!da!indurre!per!inserire!la!sequenza!del!NdeI!nelle!copie!clonate!

Quindi!il!primer!dovrà!contenerle!nella!zona!centrale.!!


!

! 8!

I!primers!vengono!perciò!individuati!analizzando!la!sequenza!de!Plasmide!:!

!

Forward((con!NdeI:!CATATG!!

AmpRf&NdeI&caa&taa&tat&tga&aaa&agg&aag&cat&atg&agt&att&c&&&originale!senza!mutazione:!

caa!taa!tat!tga!aaa!agg!aag!agt!atg!agt!att!c&!

Reverse!con!BamHI:!GGATCC!

(AmpRrBamHI&1:!cta&aag&tat&ata&tga&gga&tcc&ttg&gtc&tga&cag&&originale!senza!mutazione:!

cta!aag!tat!ata!tga!gta!aac!ttg!gtc!tga!cag!

&3’>5’filamento&inferiore:&&gac&agt&ctg&gtt&caa&atg&agt&ata&tat&gaa&atc!!

AmpRrBamHI&2:!g&gat&ctt&cac&ctg&gat&cct&ttt&aaa&tta&aaa&atg&&originale!senza!mutazione:!

g!gat!ttc!cac!cta!gat!cct!ttt!aaa!tta!aaa!atg)!

&3’>5’filamento&inferiore:&&gta&aaa&att&aaa&ttt&tcc&tag&atc&cac&ttc&tag&g!!

legenda:)sequenza&del&gene&AmpR!mutazione!puntiforme!

allineamento&!

Una!volta!definiti!i!Primers!vengono!ordinati!online,!!inserendo!la!sequenza!di!basi.!

((Primers((!AmpRf!!aa!tat!tga!aaa!agg!aag!agt!!

!

AmpRr&!ta!aac!ttg!gtc!tga!cag!tta!

!

AmpRfNdeI&caa!taa!tat!tga!aaa!agg!aag!cat!atg!agt!att!c!!

&AmpRrBamHI&1:&cta!aag!tat!ata!tga!gga!tcc!ttg!gtc!tga!cag!

&AmpRrBamHI&2:&g!gat!ctt!cac!ctg!gat!cct!ttt!aaa!tta!aaa!atg


! 9!

Protocollo&per&PCR&&&

Strumenti&e&reagenti&!

• TermiciclatoreThermocycler!

• Template!(campione!di!DNA!di!partenza)!

• Primers!(inneschi,!disegnati!sempre!in!direzione!5’>3’,!complementari!quindi!al!filamento!agli!estremi!3’)!

• Nucleotides!dNTP!(desossiribonucleotidi!trifosfati,!i!mattoni!necessari!per!completare!il!filamento!denaturato!

del!template)!

• DNA!polymerase!(l’enzima!che!promuove!la!duplicazione)!!

• Buffer! (il! tampone! che! creerà! le! condizioni! ottimali! perché! gli! enzimi! siano! attivi,! come! pH! specifico! o!

presenza!di!determinati!reagenti,!come!ioni!Mg2+)!

!

Procedimento&(

1. Si!parte!a!94°C!per!denaturare!(separare!i!due!filamenti!della!doppia!elica)!il!DNA!del!nostro!template!per!30!

secondi:!fase!di!denaturazione.!2. Si! raffredda! a! 50°C! per! 1! minuto! per! la! fase! di! annealing! cioè! l’allineamento! di! filamenti! di! DNA!

complementari,!tra!primer!e!template!oppure!anche!nuovamente!tra!i!due!filamenti!di!DNA!del!template,!in!

questo! secondo! caso! il! prodotto! non! verrà! utilizzato,! al! termine! di! tutti! i! cicli! previsti! il! quantitativo! di!

template!residuo!sarà!trascurato.!

MeltingTemperature:! importante! è! conoscere! la! temperatura! di! fusione! del! primer! (ad! esempio! da!

invitrogen:!AmpRf!!Melt!Temperature!=!69.2!(1M),!47.6!(50mM)).!Con!temperature!inferiori!alla!melting!T!si!

osserva!l’annealing.!

3. Si!riporta!la!soluzione!a!72°C!!per!2min/Kbp!,!cioè!per!2!minuti!ogni!mille!basi!della!sequenza!da!moltiplicare!

(nel! nostro! caso! il! gene! dell’AmpR! è! di! circa! 1000! basi! e! quindi! sono! sufficienti! 2! minuti).!

Questa!fase!è!detta!extension!(prolungamento)!e!corrisponde!alla!sintesi!da!parte!della!DNA!polimerasi!del!

filamento!complementare!a!quello!denaturato.!La!temperatura!di!72°C!è!ottimale!per!il!funzionamento!della!

polimerasi!di!batteri! termofili! che!rimangono! funzionali!ad!alte! temperature,!ad!esempio! la!Taq!polimerasi!

proveniente!dal!batterio!termofilo!Thermophilus!aquaticus.!!

4. Ripetere!i!precedenti!cicli.!Dopo!30!cicli!si!ha!un!contenuto!del!99,99%!della!sequenza!nucleotidica!stabilita.!5. Per!digerire!successivamente!il!DNA!ottenuto!sarà!necessaria!una!purificazione!del!prodotto,!per!eliminare!le!

sostanze! del! buffer! che! potrebbero! alterare! la! funzionalità! degli! enzimi! di! restrizione.! Useremo! dei! kit! di!

purificazione!! !


!

! 10!

Reaction&mix&!10x!buffer!! 5!μL!

template!!! 1!μL! ⇒1ng!

primer!+!! 1!μL!⇒!50!pmol/μL!

primerJ! ! 1!μL⇒!50!pmol/μL!

dNTP!! ! 6&μL!⇒!250μM!finale!⇒!10mM!

Taq! ! 1!μL!

dH2O! ! 35!μL!

!

totale! ! 50!μL!

!

!Per!sterilizzare!con!autoclave:!3L!di!dH2O!per!70!minuti,!compreso!il!tempo!di!riscaldamento!(sufficienti!50!min).!

! ! !

!

!

!

)


! 11!

Per!il!template:!abbiamo!inizialmente!200!μL!contenenti!10μg!

Abbiamo!diluito!10!μL!in!500μL!e!preparato!4!Eppendorf!con!100!μL!in!ognuna,!con!concentrazione!1!ng/μL.!

Quelle!segnate!con!pallino!sono!quelle!utilizzate,!dopo!averle!scongelate!3J4!volte!vanno!eliminate.!

!

Per!i!primers:!hanno!quantitativi!diversi,!ad!esempio:!21,6!nmol!di!primer!AmpRf,!viene!idratato!in!216!μL!,così!che!si!

arrivi!ad!una!concentrazione!100!μM.!!

Si!preparano!poi!2!Eppendorf!con!20!μL!con!concentazione!!50!μM!(diluendo!quindi!10!μL!(di!primer!idratato)+!10!μL!

di!H2O.!

!

Soluzioni!primers:!50!μM!in!stock:!!

AmpRf! AmpRr! AmpRfNdeI! AmpRrBamHI!1! AmpRrBamHI!2!

Eppendorf! gialle!

(con!scritta!rossa)!

Eppendorf!gialle! Eppendorf!arancione!

!

Eppendorf!verde!

!

Eppendorf!azzurro!

!

!

!

!

Per!i!dNTP:!mescoliamo!25!μL!di!ogni!base!(10!mM)!in!una!Eppendorf,!ottenendo!così!100!μL!con!concentrazione!di!

2,5!mM!(2500!μM!)per!ogni!base,!per!poi!usarne!6&μL!nel!reaction!mix!in!modo!che!la!concentrazione!finale!sia!250μM.!

! !


!

! 12!

Schema&per&PCR&&!

!

! ! ! temperatura! tempo! note!

! 0! Hot!Start! 94°C! 5!min! per!denaturare!il!DNA!

ciclo! 1! denaturation! 94°C! 30!sec! !

2! annealing! 45°C! 1!min! MeltingTemperature:!importante!è!

conoscere!la!temperatura!di!fusione!

del!primer!(ad!esempio!da!

invitrogen:!AmpRf!!Melt!

Temperature!=!69.2!(1M),!47.6!

(50mM)).!Con!temperature!inferiori!

alla!melting!T!si!osserva!l’annealing!

3! extension! 72°C! 2!min/Kbp! Il!gene!AmpR!ca!1000!bp!quindi!2!

min.!

! ! Ripetere!ciclo! ! minimo!20!cicli! Dopo!30!cicli!99,99%!quindi!la!pcr!

durerà!92!min!

! 4! termination! 72°C! 7!min! !

! 5! hold! 4°C! 1h! Fino!a!quando!non!si!preleva!e!si!

congela!o!si!purifica.!Si!imposta!

almeno!per!1!h.!

!

Importante&:&inserire&la&TAQ&dopo&lo&&Hot&start;!mettere!in!pausa!il!termociclatore,!prestare!attenzione!al!

coperchio!del!ciclatore!perché!è!impostato!ad!una!temperatura!di!120°C,!inserire!la!DNAJPolimerasi,!richiudere!e!

riavviare!il!processo.!E’!necessario!inserire!la!Taq!dopo!lo!Hot!start!perché!l’enzima!si!denaturerebbe!a!94°C!per!5!

minuti!(!30!secondi!vengono!sopportati).!

!

! Termocycler) !

!

!

!


! 13!

PCR:&AmpR&&&Reaction&mix&Iniziare!con! dH2O! !

!

35!μL! !

! 10x!buffer!

!

5!!!μL! !

! template!!!

! !

1!!!μL! !

! primer!+!

!

1!!!μL! !

! primer!–!

!

1!!!μL! !

! dNTP!

!

6&&&μL! !

Inserire!dopo!

Hot!start:!5!min.!!

94°C!

Taq! 1!!!μL! !

! ! ! !

! totale! 50!μL! !

!

&&Schema&per&PCR&&! ! ! temperatura! tempo! note!

! 0! hot!start! 94°C!

!

5!min! !

ciclo!

1! denaturation! 94°C!

!

30!sec! !

2! annealing! 45°C!

!

1!min! !

3! extension! 72°C!

!

2!min! 2!min/Kbp!(ampR!ca!1000bp)!

! ! Numero!!cicli! 20!

!

!

! 4! termination! 72°C!

!

7!min! !

! 5! hold! 4°C!

!

! !

!


!

! 14!

Digestione&enzimatica&!!Reaction&mix&per&digestione:&!0,1!μg!DNA:!10!μL!

5!μL!Buffer!4!

0,1!μL!R.E.!

35!μL!H2O!

__________!

50!μL!totale!

!

!

Normalmente!si!usano!5U/!μg!DNA!di!enzima!(R.E.)!

!

Abbiamo!una!concentrazione!degli!enzimi!di!20.000!U/ml!

se!usiamo!100!ng!di!DNA!abbiamo!quindi!bisogno!di!0,5U!che!corrispondono!ad!un!volume!di:!

20.000:!1ml!=!0,5!:!x!

x=!0,25!10J1!μL!=!0,025!μL!

Purtroppo!la!nostra!micropipetta!ha!una!sensibilità!certa!di!0,1!μL!

!

! Buffer! t! BSA!

NdeI! 4! 37°C! /!

BamHI! 4! 37°C! /!

PstI! 4! 37°C! /!

!

Tempo!di!digestione!1!h!a!37°C!

!

Per!sicurezza!abbiamo!utilizzato!un!reaction!mix!con!queste!concentrazioni:!

45!μL!DNA!

5!μL!buffer!

0,1!μL!R.E.!!

1! 2! 3! 4! 5! 6!

0! PstI! PstI!

BamHI!

BamHI!

NdeI!

PstI!

NdeI!

BamHI!

NdeI!

!Incubatore)basculante) ! Microcentrifuga)

!

!

!


! 15!

Purificazione&del&DNA&!

Protocolli!per!la!purificazione!del!DNA!ottenuto!con!PCR;!la!purificazione!è!necessaria!per!eliminare!il!buffer!e!i!dNTP!

residui.!

(

Protocollo&con&centrifugazione&!Dopo!i!cicli!di!PCR!attendere!la!fase!“Hold”!di!raffreddamento!prima!di!proceder!alla!purificazione.!

Per!la!centrifugazione!bilanciare!con!una!Eppendorf!con!500!μL!di!H20!e!quando!c’è!il!washing!buffer!arrivare!a!1!ml!

!

Binding&the&DNA&Legame(del(DNA(alla(colonnina(

• Aggiungere!al!prodotto!della!PCR!un!uguale!volume!di!!Buffer!per!la!purificazione!della!PCR!(Purification!

Buffer)!:!aggiungere!!50!μl!di!Purification!Buffer!50!μl!di!prodotto!!della!PCR.!Centrifugare!brevemente.!

• Trasferire!la!soluzione!in!una!colonna!per!la!purificazione!inserita!in!un!microtubo!da!centrifuga!

• Centrifugare!la!colonna!per!!30/60!secondi!a!10.000!xg!

• Procedere!al!lavaggio!della!colonna!(Washing!the!Column)!

! "S!

Washing&the&Column&Lavaggio(della(colonnina!

• Aggiungere!500!μl!di!Buffer!di!lavaggio!(Wash!Buffer)!alla!colonnina!

• Centrifugare!la!colonnina!/microtubo!a!10.000!xg!per!1!minuto!

• Elimina!la!soluzione!defluita!e!il!tubo!di!raccolta!

• Centrifugare!anche!dopo!il!washing!!a!vuoto!(per!30sec!),!cioè!dopo!aver!svuotato!il!fondo!

• Elimina!il!residuo!di!soluzione!defluita!e!il!tubo!di!raccolta!

• Inserire!la!colonnina!in!un!nuovo!microtubo!sterile,!quindi!procedere!con!l’eluizione!del!DNA!(Eluting!the!

DNA)!

Eluting&the&DNA&Eluizione(del(DNA(

• Aggiungere!!50!μl!di!buffer!di!eluizione!!(Elution!Buffer)!e!incubare!a!temperature!ambiente!per!1!minuto!

• Centrifugare!la!colonnina!/microtubo!a!10.000!xg!per!!30/60!secondi.!La!soluzione!defluita!contiene!il!DNA!

• Conservare!il!DNA!a!4°C!per!uso!immediato!o!a!J30°C!per!una!lunga!conservazione.!!

Il!DNA!è!quantificato!mediante!spettrofotometro!(la!concentrazione!proporzionale!all’assorbanza!in!UV!a!260nm).!

!

! &


!

! 16!

Elettroforesi&e&analisi&gel&&!

Protocolli!per!la!preparazione!di!gels!in!Agarosio!e!analisi!dei!gels!ottenuti.!

Protocollo&per&la&preparazione&del&gel&in&Agarosio:&!500ml!Buffer!(50X)!TAE!(tris!Acetate!EDTA):!

!

si!diluiscono!10ml!buffer!(50X)!in!500ml!soluzione!finale.!

Per!una!cella!elettroforetica!(Biorad)!necessri!250!ml!di!TAE!buffer!1x!

!

Per!il!gel:!!

1g!di!Agarosio!(Le!Multipurpose)!in!100ml!di!TAE!Buffer!1x:!

In!agitatore!magnetico!con!piastra!riscaldante!fino!a!quando!la!soluzione!diventa!trasparente!e!successivamente!farlo!

raffreddare!fino!a!50°C!

!

Per!il!casting!!

riempire!fino!a!coprire!i!dentini!(in!ogni!pozzetto!ci!staranno!ca!10!μL)!

per!un!gel!con!spessore!0,5!cm!sono!sufficienti!30!ml!di!gel!!

!

Celle!elettroforetiche:!

Il!nero!è!negativo!quindi!i!pozzetti!vanno!sul!nero!(il!dna!si!muove!verso!il!rosso)!

Con!una!differenza!di!potenziale!di!100!V!sono!necessari!50/60!minuti!per!completare!l’elettroforesi!(quando!la!banda!

violetta!arriva!a!7/8!cm)!

!

Loading!buffer!2!μL!+!10!μL!di!DNA!

Standard!5!μL!!

!!

Protocollo&per&la&colorazione&del&gel&Green(Gel(Post(Staining(protocol(!Tempo(richiesto:((60)min.)per)la)colorazione)!

1. Diluire&il&reagente.&Diluire!la!soluzione!stock!di!Green!Gel!da!10.000x!di!3.300!volte!per!arrivare!a!una!concentrazione!3x:!

(45!µL!in!150!ml!di!soluzione!con!dH20)!

Si!può!aggiungere!NaCl!0,1!M!alla!soluzione!per!aumentare!la!sensibilità!ma!può!provocare!la!precipitazione!del!

colorante!se!il!gel!viene!riutilizzato.!

2. Sistemare&accuratamente&il&gel&in&un&contenitore&in&polipropilene.&&Aggiungere!delicatamente!il!colorante!sufficiente!a!sommergere!il!gel.&

3. Lasciare&colorare&&il!gel!al!buio!per!almeno!un’ora,!a!temperature!ambiente.!

4. Illuminare&il&gel&colorato&con!un!transilluminatore!a!254!nm.!

5. Riutilizzo&della&soluzione.&La!soluzione!colorante!può!essere!usata!4/5!volte.!Va!conservata!a!temperatura!ambiente,!protetta!dalla!luce!

perché!il!Green!Gel!è!fotosensibile.! &


! 17!

Analisi&Gels&!

!Elettroforesi&del&30.01.2013!Con!il!programma!“logger!Pro”!si!può!calcolare!il!fit!logaritmico!utilizzando!lo!standard,!per!calcolare!poi!con!grande!

precisione!la!dimensione!del!filamento!del!campione!DNA!,!infatti!i!filamenti!si!muovono!con!proporzionalità!inversa!

al!log10!della!massa.!

Si è tentato di stabilire due curve di calibrazione diverse: una per i pesi molecolari più bassi (1000-4000bp) e l'altra per quelli più elevati (3000-6000). ! ! !

!

!

!


!

! 18!

!!

!

Elettroforesi&30.01.213:&&1! 2! 3! 4! 5! 6! 7! 8! 9! 10!

DNAJladder!

!

5!μL!

O!

!

10!μL!

PstI!

!

10!μL!

PstI!

BamHI!

10!μL!

BamHI!

NdeI!

10!μL!

PstI!

NdeI!

10!μL!

PstI!

BamHI!

NdeI!

10!μL!

PCR!no!

Taq!

10!μL!

PCR!

!

10!μL!

!PCR!

Purificata!

10!μL!

&La&corsia&1!è!stata!caricata!con!lo!standard!(EZ!Load!500bp:!parte!da!500bp!e!gli! intervalli!sono!di!500bp).!In!questo!caso!la!banda!delle!500bp!non!è!visibile!e!quindi!la!banda!più!bassa!corrisponde!a!quella!delle!1.000bp.&La&corsia&2!è!stata!caricata!con!il!plasmide!non!linearizzato!e!il!risultato!sono!due!bande,!una!in!corrispondenza!delle!

3500!basi!e!una!intorno!alle!7000.!Considerando!che!il!nostro!plasmide!è!costituito!da!circa!5000!basi,!si!intuisce!che!

lo!sdoppiamento!della!banda!e!una!banda!con!dimensioni!maggiori!indicano!qualche!fenomeno!riconducibile!alla!non!

linearizzazione!del!DNA.!

Il)DNA)linearizzato)si)muove)con)proporzionalità)inversa)al)log10)della)massa)(come)hai)plottato)nel)grafico).)Il)DNA)non)linearizzato)si)trova)invece)in)due)forme)topologiche)principali,)supercoiled)(compatto))e)nicked)(circolare)aperto))con)proprietà)di)migrazione)molto)diverse.) Il)DNA) in) forma)supercoiled)essendo)più)compatto)ha)dimensioni)minori) e)migra) più) velocemente) della) forma) lineare.) Se) invece) uno) dei) due) filamenti) del) DNA) è) tagliato) (nicked)) il)plasmide)assume)la)sua)forma)circolare)rilassata)e)quindi)le)dimensioni)sono)molto)maggiori)rispetto)al)DNA)lineare.)Il)DNA) con) filamenti) intatti) e) quindi) supercoiled) è) presente) in) maggior) quantità) e) quindi) le) proporzioni)supercoiled/nicked)che)vediamo)nel)gel)corrispondono.)La&corsia&3!è!stata!caricata!con!il!plasmide!digerito!con!PstI!e!quindi!linearizzato.!La!banda!è!posizionata!poco!sopra!

quella!delle!5.500bp,!infatti!il!Pet!16B!è!costituito!da!5.746bp.!

La&corsia&4!è!stata!caricata!con!il!plasmide!digerito!con!PstI!e!BamHI!che!producono!due!filamenti!uno!di!1.108bp!e!

uno!di!4.638!bp!che!corrispondono!alle!bande!visibili!nel!gel.!

La& corsia& 5! è! stata! caricata! con! il! plasmide! digerito! con! BamHI! e! NdeI! che! producono! due! filamenti! uno! di! 11bp!

(troppo!piccolo!e!quindi!non!visibile!perché!uscito!dal!gel)e!uno!di!5.738!bp!che!corrisponde!alla!banda!visibile!nel!gel.!

La&corsia&6!è!stata!caricata!con!il!plasmide!digerito!con!PstI!e!NdeI!che!producono!due!filamenti!uno!di!1.119bp!e!uno!

di!4.627!bp!che!corrispondono!alle!bande!visibili!nel!gel.!

La&corsia&7!è!stata!caricata!con!il!plasmide!digerito!con!PstI,!BamHI!e!NdeI!che!producono!tre!filamenti!uno!di!1.108bp!

e!uno!di!4.627!bp,! che! corrispondono!alle!bande!visibili! nel! gel! e!uno!di!11bp! (troppo!piccolo!e!quindi!non!visibile!

perché!uscito!dal!gel).!

La&corsia&8!è!stata!caricata!con!il!prodotto!di!una!PCR!senza!utilizzo!della!DNAJPolimerasi!e!quindi!non!si!è!prodotto!

nulla;!pertanto!non!è!visibile!nessuna!banda.!

La&corsia&9!è!stata!caricata!con!il!prodotto!di!una!PCR!in!cui!è!stato!amplificato!un!gene!di!898bp!(858!bp!per!il!gene!+!

20!bp!per!ogni!primer).!

La&corsia&10&è!stata!caricata!con!il!prodotto!della!stessa!PCR,!in!cui!è!stato!amplificato!un!gene!di!898bp!(858!bp!per!il!

gene! +! 20! bp! per! ogni! primer),! purificato! con! il! kit,! in! cui! è! stato! però! commesso! un! errore! nel! procedimento! e!

pertanto!si!sono!prodotti!molti!frammenti!di!dimensioni!diverse.!

!

!

!

!

!

!

!

!

!

!

!

!

!

!

!

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! 19!

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! ! !

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!

!

!

Elettroforesi&del&28.02.2013&!

La&corsia&1!è!stata!caricata!con!lo!standard!(EZ!Load!500bp:!parte!da!500bp!e!gli! intervalli!sono!di!500bp).!In!questo!caso!la!banda!più!bassa!corrisponde!a!quella!delle!500bp.!


20!bp!per!ogni!primer)!con!temperatura!di!annealing!di!35°C.!


20!bp!per!ogni!primer)!con!temperatura!di!annealing!di!45°C.!


20!bp!per!ogni!primer),!con!temperatura!di!annealing!di!45°C,!purificato.!

La&corsia&5&è!stata!caricata!con!il!plasmide!digerito!con!PstI!due!settimane!prima!e!conservato!a!J30°C.!Non!si!osserva!

nessuna!banda.!

Nelle!corsie!2,3!e!5!si!osservano!macchie!sfumate!nella!zona!bassa!del!gel!che!corrispondono!ai!nucleotidi!presenti!nel!

buffer,!confermato!anche!dal!fatto!che!nella!corsia!4!sono!assenti.! !


!

! 20!

Coltivazione&di&batteri&ed&estrazione&dei&Plasmidi&Protocollo!per!la!produzione!di!colonie!batteriche!di!E.coli,!non!patogeno,!trattate!con!ampicillina!e!protocollo!per!

estrazione!dei!plasmidibatterici,!ottimizzato!per!il!kit!della!SigmaJAldrich.!

Coltivazione&di&batteri:&!

Materiale:&Capsule!Petri!

2!Beute!da!100ml!per!50!ml!di!coltura!per!ognuna!

carta!stagnola!!

becker!!

!

Per! la! coltivazione! batterica! è! necessaria! una! sorgente! di! Carbonio! (estratto! di! lievito! )! e! del! Cloruro! di! sodio;! in!

particolare!per!le!due!colture:!

LB&Broth&(coltura&liquida)&Ttriptone!10!g!per!Litro!(peptone!from!casein)!

Yeast!extraxt!5!g!per!Litro!

Cloruro!di!Sodio!10n!g!per!Litro!

LB&Agar&(coltura&solida)&&(lo(abbiamo(pronto(e(va(diluito(35(g(su(Litro)(Ttriptone!10!g!per!Litro!

Yeast!extraxt!5!g!per!Litro!

Cloruro!di!Sodio!10n!g!per!Litro!

Bactogar!15!g!per!litro!

ampicillina&Stock!solution!ampicillina!100!mg/ml!(Noi!abbiamo!la!soluzione!stock!già!pronta).!!

Work!concentration!100!μg/ml!

!

!!! &


! 21!

Protocollo&per&la&preparazione&delle&colture&batteriche:&Tempi(richiesti:((20min.)per)la)preparazione)delle)colture))20)min.)per)sterilizzare))e)20)min.)per)raffreddare,))10)min.)per)lo)striscio)di)batteri)24)ore)di)incubazione))20)min)per)preparazione)coltura)liquida)24)ore)di)incubazione)))• Preparare!50ml!di!coltura!liquida!(LB!Broth)!e!50!ml!di!coltura!solida!(LB!Agar):!

Per&&50&ml&di&LB&Broth:&Ttriptone!0,5!g!!

Yeast!extraxt!o,25!g!!

Cloruro!di!Sodio!0,5!g!!

Per&50&ml&di&LB&agar&&Lb!Agar!(della!confezione)!1,75!g!

!

Il!terreno!liquido!senza!antibiotico!si!conserva!a!temperatura!ambiente!anche!per!un!mese!e!più!in!una!beuta!chiusa!

con!carta!stagnola!(senza!antibiotico!è!meglio!perché!se!si!contamina!si!formano!colonie!riconoscibili)!.!

Quello! solido! trattato! con!ampicillina! si! può! conservare!per!qualche! settimana! (max!1!mese)! in! frigo,! avvolto!nella!

carta!stagnola,!perché!l’ampicillina!è!fotosensibile.!

!• Sterilizzare! le!due!beute!chiuse!con! la! carta! stagnola,! contenenti! le! colture,!gli! stuzzicadenti!posti! in!un!becker!chiuso!con!carta!stagnola!e!il!tubo!per!la!coltivazione!liquida.!

• Aggiungere!50!μl! !di!ampicillina! (100mg/ml)!ai!nostri!50!ml!di!coltura!solida!quando!arriva!ad!una!temperatura!

intorno!ai!40/50!°C!(quando!si!riesce!a!tenere!la!beuta!in!mano!senza!scottarsi).!!

• Passare!con!la!fiamma!del!becco!Bunsen!sulle!Petri,!versare!la!coltura!nelle!due!Petri!(ca!20!ml!per!Petri)!

• attendere!che!la!coltura!solida!sia!solidificata!(ca!28°C),!!

• utilizzare!un’ansa!per!raccogliere!i!batteri,!manutenuti!sempre!congelati!nella!cooler!

box:!

passare!l’ansa!sulla!fiamma!e!poi!sulla!coltura!solida!per!raffreddarla,!ruotare!quindi!

l’ansa! nella! provetta! contenente! i! batteri! congelati! e! strofinarla! leggermente!

sull’agarosio!distribuendo!i!batteri!su!gran!parte!della!superficie,!come!rappresentato!

nell’immagine.!

• inserire!la!piastra!nell’incubatore!a!37°C!,!capovolta,!per!24!ore,!senza!basculamento!

• Il!giorno!dopo!preparare!3!ml!di!coltura!liquida!in!un!tubo!sterile!(dopo!averlo!autoclavato,!passarlo!velocemente!

sulla! fiamma).!Quando) si) versa) il) liquido) di) coltura) si) passa) il) collo) della) beuta) sulla) fiamma,) sia) quando) viene))aperta)e)sia)quando)viene)chiusa.!

• Aggiungere!50!μl!!di!ampicillina!ai!50!ml!di!coltura!liquida!oppure!3!μl!!a!ogni!tubo!(contenente!3ml!di!LB!Broth).!!

E’! importante! mantenere! la! stessa! pressione! di! ampicillina! altrimenti! si! perdono! i! batteri! che! contengono! il!

plasmide!contenente!il!gene!per!la!resistenza!all’ampicillina.!

• con!lo!stuzzicadenti!raccogliere!una!colonia!di!batteri!dalla!piastra!e!deporre!lo!stuzzicadenti!nel!liquido!di!coltura!(lasciando!anche!lo!stuzzicadenti).!

• Non!chiudere!il!tappo!del!tubo,!ma!appoggiarlo!e!fissarlo!con!del!nastro.!

• incubare!a!37°!C!con!basculamento!(velocità!150),!da!mattina!a!sera!(meglio!24!ore),!fino!a!quando!la!coltura!è!

sufficientemente!torbida.!

! !


!

! 22!

!Passare)con)la)fiamma)del)becco)Bunsen)sulle)Petri!

!La)piastra)nell’incubatore)a)37°C),)capovolta,)dopo)24)ore.)Si)possono)osservare)chiaramente)le)colonie)batteriche. )


! 23!

Protocollo&per&estrazione&di&plasmidi&Velocità!della!centrifuga!12.000!rpm,!eccetto!dove!specificato!

Tempo(richiesto:((20)min.)per)la)raccolta)delle)cellule)batteriche)e)formazione)del)pellet)60)min.))per)estrazione)dei)plasmidi)!

1. Raccolta&e&lisi&delle&cellule&batteriche.&• centrifugare!la!sospensione!batterica!(1!mL!alla!volta),!in!una!Eppendorf!sterilizzata,!per!1!minuto!a!14000!rpm!

• !decantare!il!supernatante!liquido!nella!beuta!contenente!il!disinfettante!(ipoclorito!di!sodio)!

• assicurarsi! che! tutto! il! liquido! sia! stato! rimosso! utilizzando! una! micropipetta! con! puntale! sterile! per! aspirare!

eventuali!residui!di!liquido!dalla!Eppendorf!

• Il!pellet!può!essere!congelato!

2. Risospensione!delle!cellule.&• !risospendere! il! pellett! batterico! in! 200! µL! di! buffer! per! risospensione! (Resuspension! Solution(S1)! a! cui! viene!aggiunto!la!RNAsi!la!prima!volta!e!quindi!conservato!a!4°C)!

• pipettare! ripetutamente! in! modo! da! eliminare! agglomerati! di! cellule,! finché! la! sospensione! non! appare!

completamente!omogenea!

3. Lisi&cellulare&e&denaturazione&del&DNA.&• aggiungere!200!µL!di!buffer!per!la!lisi!(Lysis!Solution!(S2))!

• !invertire!la!eppendorff!delicatamente!un!paio!di!volte!

• lasciare!incubare!a!temperatura!ambiente!per!circa!5!minuti!

• la!sospensione,!inizialmente!opaca,!dovrebbe!ora!essersi!schiarita!

4. Neutralizzazione&del&pH.&• aggiungere!350!µL!di!buffer!di!neutralizzazione!(Neutralization!Solution!(S3).)!

• !invertire!la!Eppendorf!delicatamente!dalle!4!alle!6!volte!per!mescolare!

5. Rimozione&del&debris&cellulare&e&del&DNA&genomico.&• Centrifugare!la!sospensione!per!10!minuti!a!14.000!rpm!(nel!frattempo!passare!al!punto!successivo)!

• Si!dovrebbe!ora!osservare!un!pellet!biancastro!sul!fondo!della!Eppendorf!

• il!supernatante!contiene!il!DNA!plasmidico!

• !recuperare!attentamente!750!µL!di!supernatante!con!una!pipetta!con!punta!sterile!

6. Preparazione&della&colonnina&per&la&purificazione&• Aggiungere!500!µL!della!soluzione!di!attivazione!della!Colonna!(Column!Preparation!Solution!(S4))!a!una!colonnina!

per!la!purificazione!inserita!ad!un!microtubo!da!centrifuga!

• Centrifugare!a!14.000!rpm!per!un!minuto.!Eliminare!il!liquido!raccolto!nel!microtubo!da!centrifuga!

7. Legame&del&DNA&plasmidico&alla&colonnina.&• trasferire!il!supernatante!nella!colonnina!per!la!purificazione!inserita!a!sua!volta!nel!microtubo!da!centrifuga!

• !lasciare!incubare!per!1!minuto!a!temperatura!ambiente!

• centrifugare!a!14000!rpm!per!1!minuto!

8. Lavaggio.&• aggiungere!750!µL!di!buffer!per!il!lavaggio(Wash!Solution!(S5)!la!prima!volta!va!diluita!a!etanolo!e!conservata)!

• !centrifugare!per!1!minuto!a!14000!rpm!


!

! 24!

• decantare!il!liquido!raccolto!nel!microtubo!da!centrifuga!e!reinserire!la!colonnina!

• centrifugare!per!1!minuto!a!14000!rpm!la!colonnina!!a!secco!

9. Eluzione&del&DNA&plasmidico.&• trasferisci!la!colonnina!in!una!nuova!Eppendorf!sterile!

• aggiungi!100!µL!di!soluzione!per!eluzione!(Elution!Solution!(S6))!al!centro!della!colonnina!

• lasciare!incubare!per!1!minuto!a!temperatura!ambiente!

• centrifugare!per!1!minuto!a!14000!rpm!

• ora!si!può!gettare!via!la!colonnina!

• il!DNA!plasmidico!si!trova!nel!liquido!raccolto!nella!Eppendorf!

• conservare!a!J30°C!

!

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Lars Bioec 2013 · COLTIVAZIONE&DI&BATTERI&ED&ESTRAZIONE&DEI&PLASMIDI& ... LB&Broth&...

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Transcript of Lars Bioec 2013 · COLTIVAZIONE&DI&BATTERI&ED&ESTRAZIONE&DEI&PLASMIDI& ... LB&Broth&...