LLC Bologna - 2009

DNA Fingerprinting

Prerequisiti

• Per affrontare questa attività bisogna conoscere:

• La struttura del DNA

• I plasmidi

• Gli enzimi di restrizione

Obiettivo

• Confrontare le dimensioni dei frammenti del DNA generati dalla digestione enzimatica, sfruttando le caratteristiche di unicità proprie del genoma degli organismi.

Introduzione

• Per stimolare l’interesse viene riprodotta un’indagine poliziesca, dove il materiale biologico rinvenuto sul luogo del delitto viene analizzato e comparato con quello appartenente ad alcuni individui sospetti, fra i quali lo studente dovrà individuare il profilo genetico corrispondente al colpevole. In questa esperienza, condotta a scopo didattico, si utilizza DNA plasmidico, quale fonte di materiale da analizzare in quantità tale da consentire una visualizzazione diretta, mentre nella realtà è necessaria una preventiva amplificazione del DNA per ottenere risultati osservabili e significativi (PCR)

• La prova è eseguita su piccola scala per motivi tecnici, ma i principi richiamati come pure i passaggi (digestione con enzimi di restrizione, elettroforesi e colorazione delle bande di DNA) sono gli stessi richiesti dalla conduzione dell’esperimento a livello professionale.

• La produzione dei frammenti di DNA avviene durante il trattamento con gli enzimi di restrizione, che sono in grado di tagliare l’acido nucleico in prossimità di sequenze nucleotidiche specifiche.

• La tecnica elettroforetica è poi fondamentale per separare i frammenti neoformati. Nelle celle elettroforetiche si genera un campo elettrico nel quale il DNA, carico negativamente, migra verso il polo positivo. La matrice (nel nostro caso agarosio), nella quale si muove il DNA, è quella che materialmente consente la separazione dei frammenti generati dalla digestione: infatti la concentrazione dell’agarosio(0,8%) conferisce al gel una porosità idonea ad ottenere la risoluzione desiderata (adeguata separazione delle bande). Il gel dopo l’elettroforesi viene colorato per osservare i frammenti evidenziati in forma di bande.

DNA utilizzato in questo esperimento

Tecnica del DNA fingerprinting

Digestione

Elettroforesi

Colorazione

Digestione

Digestione

Digestione

Digestione

Digestione

Preparazione Gel di agarosio

                                

Elettroforesi

LLC Bologna - 2009

Elettroforesi

Caricamento

Corsa elettroforetica

Colorazione

Colorazione

C 1 2 3

-

+

Colorazione

C 1 2 3

Chi è il colpevole

?

Chi è il colpevole

?

C 1 2 3 4

Chi è il colpevole?

C 1 2 3C 1 2 3 C 1 2 3C 1 2 3

MARCATORE Profilo

D8S1179 10-10

D21S11 29-30

D7S820 9-12

CSF1PO 12-13

D3S1358 16-17

TH01 6-9.3

D13S317 8-12

D16S539 9-12

vWA 17-17

TPOX 7-8

D18S51 14-14

D5S818 11-11

FGA 23.2-24

PentaE 7-13

PentaD 10-12

Sex F

Esempio di Profilo Genetico

Fonti di materiale biologico

SangueLiquido SeminaleSalivaUrinaCapelliDentiOssa TessutiSudore

Solo una piccola quantità di sangue è necessaria per ottenere un profilo genetico.

DNA: presente in ogni materiale cellulare che contiene un nucleo

Analisi forense del DNA

• Raccolta del campione (scena del crimine/campioni

di confronto)

• Valutazione del tipo di traccia diagnosi

generica

• Estrazione e purificazione del DNA

• Quantificazione del DNA

• Amplificazione e corsa su elettroforesi capillare

• Interpretazione del profilo genetico

Polimorfismi STR

Laser

+

Elettroforesi capillare

Laser

+

Elettroforesi capillare

Laser

+

Elettroforesi capillare

Laser

+

Elettroforesi capillare

Le bande, la cui dimensione dipende dal numero di ripetizioni, vengono trasformate in picchi.

Elettroforesi capillare

Regioni non codificanti del DNA sono poco presenti nel DNA dei procarioti.Tra gli eucarioti, con l’incremento della complessità dell’individuo aumenta anche la quantità di DNA non codificante.

Regioni polimorfiche del DNA non codificanti

Il confronto tra DNA diversi avviene studiando alcune zone ad alta variabilità e quindi caratteristiche, nel loro insieme, di un singolo individuo.

REGIONI POLIMORFICHE del DNA costituiscono l’impronta digitale molecolare di ogni persona (Fingerprint).

Le regioni polimorfiche del DNA

Tipi di Polimorfismo per fingerprinting

MinisatelliteVariable Number of Tandem Repeat

VNTR

MicrosatelliteShort Tandem Repeat

STR • Subtelomeriche• Ripetizione: 8-80 bp• Lunghezza totale 0.5-30Kb

• Disperse in tutto il genoma• Ripetizione: 2-7 bp

= AATG

AATG AATG AATGAATG

AATG AATG AATGAATG

4 ripetizioni

4 ripetizioni

Tipizzazione individui

Tipizzazione individui

Gli amplificati hanno le stesse dimensioni

4

AATG AATG AATGAATG

AATG AATG AATG

4 ripetizioni

3 ripetizioni

Tipizzazione individui

Tipizzazione individui

Gli amplificati hanno dimensioni diverse

3 4

Locus TPOXLocus TPOX Locus CSF1POLocus CSF1PO Locus TH01Locus TH01

(4 ; 5)(4 ; 5) (8 ; 3)(8 ; 3) (4 ; 4)(4 ; 4)

L’individuo in esame avrà il seguente profilo genotipico:L’individuo in esame avrà il seguente profilo genotipico: Locus TPOX (4 ; 5) Locus TPOX (4 ; 5) Locus CSF1POLocus CSF1PO (8 ; 3)(8 ; 3) Locus TH01 (4 ; 4)Locus TH01 (4 ; 4)

R.I.S.

Marcatori STR utilizzati in ambito forense

MARCATORE Profilo

D8S1179 10-10

D21S11 29-30

D7S820 9-12

CSF1PO 12-13

D3S1358 16-17

TH01 6-9.3

D13S317 8-12

D16S539 9-12

vWA 17-17

TPOX 7-8

D18S51 14-14

D5S818 11-11

FGA 23.2-24

PentaE 7-13

PentaD 10-12

Sex F

Esempio di Profilo Genetico

Casi criminali: indagato/vittima-traccia

Test di paternità: paternità controversa

Immigrazione: relazioni familiari

Mass disaster

Soggetti scomparsi Identificazione

Identificazioni storiche

Utilizzi DNA fingerprinting

Il DNA incastra due volte il romenoaccusato dello stupro di San ValentinoNuovi esami confermano: Gavrila fu l'autoredi un'analoga violenza al Pigneto nel luglio 2008Corriere della sera 6 aprile 2009

Casi criminali: indagato/vittima-traccia

Usa, salvo grazie al test del DnaRepubblica — 25 agosto 2001   pagina 17   sezione: POLITICA ESTERA WASHINGTON - La prova del Dna ha salvato dalla condanna a morte un americano in carcere da diciassette anni. Nel 1982 Charles Fain venne condannato alla sedia elettrica per aver stuprato e ucciso una bambina di nove anni. Al processo, il medico legale, sostenne che i peli ritrovati sul corpo della bambina erano di Fain. Oggi la prova del Dna ha dimostrato che si sbagliava. «Ringrazio Dio per il Dna» ha detto l' ex condannato appena liberato. «Sapevo», ha aggiunto, «che prima o poi tutta questa storia sarebbe finita bene».

                                        

           

Accertamenti di paternità

PRESUNTO PADRE

FIGLIO

MADRE

Esempio di test di paternità

Utilizzi Dna fingerprinting

Captured December 13, 2003

Questo uomo è realmente

Sadaam Hussein?

Uday and Qusay Hussein

Killed July 22, 2003

Butler, J.M. (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition, Box 23.1, p. 534

Il mistero di Anastasia Romanove di Anna Anderson

Identificazioni storiche