Tipi di ricombinazione

Omologa – tra sequenze molto simili

(durante la meiosi)

Sito-Specifica – tra sequenze con limitata similarità.

Coinvolge siti specifici

Transposizione – movimento di elementi di DNA

da un sito ad un altro (trasposoni)

Ruolo biologico della

ricombinazione

1. Generare nuove combinazioni geniche o alleliche (crossing over durante la meiosi)

2. Generare nuovi geni (riarrangiamento nell produzione di immunoglobuline)

3. Integrazione di elementi di DNA

4. Riparo del DNA

Utilità pratiche Mappatura dei geni sul cromosoma Generazione di organismi transgenici

Ricombinazione negli eucarioti

Crossing-over

http://www.federica.unina.it/mini/img.php?src=../files/_docenti/de-simone-vincenzo/img/desimone-39-07-28.jpg

Modello di scambio dei filamenti secondo Holliday

1° sito

2° sito

Ricombinazione indotta da tagli a doppia elica

Ricombinazione indotta da tagli a doppia elica

RecA: forma attiva filamento nucleoproteico (100 subunità di ReaA e 300 nucleotidi )

(Aumento della lunghezza del DNA legato a RecA)

Ricerca della complementarità

Appaiamento delle basi complementari (+/- 15coppie di basi)

RuvB ATPasi esamerica

La ricombinazione del DNA

Ricombinazione omologa

I modelli di Holliday e di Meselson-Redding.

Il complesso RecBCD genera il filamento di DNA

“invasore”.

La proteina RecA promuove lo scambio dei filamenti di

DNA.

Il complesso RuvABC promuove la migrazione del

chiasma e la risoluzione degli intermedi di Holliday.

Trasposoni

I trasposoni sono elementi mobili che si trovano nel genoma di tutti gli organismi. Sono in grado, con meccanismi diversi, di saltare da un punto all’altro del genoma. Questi salti possono determinare drastici cambiamenti nella struttura e nelle modalità di espressione dei geni. Appartengono a diverse classi, accomunate dalla caratteristica di avere la sequenza trasposta fiancheggiata da corte sequenze ripetute generate dalla duplicazione di una sequenza nel sito bersaglio (Ripetizione intersperse o IR) Sotto certi aspetti possono essere considerati come elementi parassitari, e in effetti alcuni di essi sono imparentati con particolari famiglie di virus (retrovirus). Tuttavia rappresentano un formidabile fattore positivo per i processi evolutivi. La trasposizione è un fenomeno diverso dalla ricombinazione omologa ed è chiamata ricombinazione non-omologa. I trasposoni possono causare mutazioni geniche e mutazioni cromosomiche Hanno un ruolo importante nell’evoluzione dei genomi

I TRASPOSONI

Elementi trasponibili Sequenze che hanno la capacità di muoversi da un sito all’altro del cromosoma

Diversamente dagli altri processi coinvolti nella ricombinazione genomica, per la trasposizione non c’è nessuna omologia tra le sequenze del sito donatore e accettore

sito donatore sito accettore

Ripetizioni intersperse

Trasposoni a DNA si originano attraverso un intermedio a DNA, secondo meccanismo di trasposizione conservativa o replicativa

Retrotrasposoni si originano per eventi di retrotrasposizione, attraverso un intermedio ad RNA • elementi LTR • LINEs: long interspersed nuclear elements • SINEs: short interspersed nuclear elements

Trasposoni a DNA

L’enzima trasposasi ha due diversi domini funzionali: • un dominio catalitico che catalizza le reazioni necessarie per la

trasposizione del DNA, l’idrolisi dei legami fosfodiestere e una reazione di inserzione del trasposone nel nuovo sito

• un dominio che lega il DNA

Codificano e utilizzano l’enzima trasposasi (capace di tagliare e riunire il DNA in corrsispondenza di ripetizioni terminali invertite o sequenze di insersione)

I trasposoni a DNA

trasposasi

http://www.federica.unina.it/mini/img.php?src=../files/_docenti/de-simone-vincenzo/img/desimone-39-08-14.jpg

I Trasposoni a DNA possono essere distinti in due categorie: •Trasposoni a DNA che si spostano replicandosi: una copia rimane nel sito originale, mentre la nuova copia si inserisce altrove nel genoma •Trasposoni a DNA che si spostano in maniera conservativa, da un sito all’altro del genoma senza aumentare il numero di copie.

Retrotrasposoni

Trasposoni che si muovono indirettamente (retrovirus endogeni)

Proteasi Integrasi RT RNAsi-H

mRNA

cDNA

Integrazione

Gli pseudogeni che si ritrovano nel genoma umano sono spesso derivati

da eventi di retrotrasposizione

IR LTR LTR IR

Gli elementi LINEs o trasposoni non-LTR hanno una lunghezza di circa 6-7kb, contengono una o due ORF e un segnale di poliadenilazione all’estremità 3’. Le LINEs si inseriscono preferibilmente nelle regioni eucromatiche ricche in A+T. Le copie attive inserendosi in punti critici del genoma possono inattivare dei geni con conseguente insorgenza di patologie.

LINEs:long interspersed nuclear elements

RNA binding anche endonucleasi promotore

Pol II ripetizioni

dirette

Trasposizione degli elementi LINE

Trascrizione inversa innescata dal sito bersaglio

citosol

SINEs: short interspersed nuclear elements

Gli elementi SINEs sono elementi non-autonomi, hanno una lunghezza compresa tra 0.1 e 0.4 kb. Hanno una regione ricca in A all’estremità 3’ ma non contengono un segnale di poliadenilazione. Gli elementi SINEs non contengono alcuna ORF codificante per una trascrittasi inversa, ma sono in grado di trasporre utilizzando la trascrittasi inversa sintetizzata da altri retroelementi (trasposizione LINEs-dipendente).

B A AAAA SINE

Gli elementi SINEs sono distribuiti ad alta densità nelle regioni ricche in CG del genoma Nel genoma dei primati sono presenti tre differenti famiglie di elementi SINEs: l’elemento Alu, ancora attivo, e gli elementi inattivi MIR e Ther2/MIR3. L’elemento Alu, il più comune nei primati, è lungo 0,3kb; è presente in circa 1.200.000 di copie nel genoma umano e rappresenta quindi oltre il 10% di tutto il genoma. Presenta una regione ricca in A/T all’estremità 3’, coinvolta nel meccanismo di retrotrasposizione. Le sequenze Alu sono localizzate a monte o a valle dei geni, negli introni, nelle regioni 5’ e 3’ non tradotte dell’mRNA. Non è noto il loro ruolo funzionale, nonostante siano molto diffuse nel genoma di tutti i primati.

SINEs: short interspersed nuclear elements

EFFETTO DEI TRASPOSONI

Che cosa possono fare i trasposoni saltando nel genoma?

A B C E F D

MUTAZIONE INSERZIONALE Inserzione nella sequenza codificante (o nelle sequenze di controllo) con

inattivazione totale o parziale del gene.

A B C E F

*

D

Trasposone

Per questa proprietà, i trasposoni sono molto utilizzati per mutagenizzare e

successivamante identificare i geni responsabili di particolari fenotipi. Un

organismo che si presta molto bene a questo è Drosophila Melanogaster.

Inattivazione del gene bersaglio

promotore DNA

mRNA

proteina assente o tronca

trasposone

gene 1 P gene 2 gene 3

mRNA

policistronico

P

Nel caso di trasposizione in un operone si osserva un effetto “polare”

Anche i geni 2 e 3 non vengono espressi in quanto la trascrizione

è bloccata dall’ elemento trasponibile

Attivazione trascrizionale del gene

A B C E F D

Retroposone LTR LTR

A B C E F D

LTR

Elementi trasponibili hanno spesso promotori direzionati verso l’esterno

promotore

forte

Che cosa possono fare i trasposoni saltando nel genoma?

Produzione di nuove varianti alternative di una proteina

A B C E F D

A B C E F D

Trasposone Promotore

Che cosa possono fare i trasposoni saltando nel genoma?

43

Genoma nucleare umano (Nature, 431: 931-945, 2005)

(da: Molecular Biololgy of the Cell, Fig. 4.17)

La porzione codificante rappresenta l’1-2% del genoma (geni codificanti per proteine, tRNA e rRNA. La porzione non-codificante è costituita da sequenze uniche e sequenze ripetute. Queste si suddividono in: 1) ripetizioni intersperse LINEs, SINEs, LTR, trasposoni a DNA); e 2) ripetizioni in tandem (blocchi ripetuti in tandem dei centromeri e dei telomeri, micro- e mini-microsatelliti, duplicazioni segmentali). La distribuzione degli elementi ripetuti varia trai i cromosomi, con alcuni cromosomi che contengono anche il 90% di DNA non codificante

Elementi trasponibili nell’uomo

Insersione di un elemento trasponibile nel gene che codifica per l’antocianina