CITOGENETICACONVENZIONALE

EMOLECOLARE

CITOGENETICA CONVENZIONALE

La citogenetica convenzionale è una tecnica che permette lo studio del numero e dellastruttura dei cromosomi (studio del cariotipo)

I cromosomi vengono esaminati “bloccati” inmetafase.

Step: •prelievo del campione (SP, BM o tessuto linf.)•allestimento delle colture cellulari•allestimento dei preparati•bandeggio dei cromosomi

Allestimento delle colture e dei preparati

Tecniche di coltura

•Diretta: terreno di coltura+colchicina 4-6 ore•Medio termine: terreno + colchicina 24-48 ore•Sincronizzata: blocco in fase S (MTX) rimozione del blocco colchicina

Allestimentopreparati

•post-incubazione: centrifugazione•soluzione ipotonica per distensione dei cromosomi•centrifugazione → fissativo (alcol metilico o

acido acetico)

Tecniche di bandeggio dei cromosomi

Tecniche generali(intero cromosoma)

Bandeggio QBandeggio GBandeggio R

BANDEGGIOSTATICO

Tecniche speciali(porzioni cromosoma)

Bandeggio CBandeggio Cd (fuso)

Bandeggio NOR geni RNA ribosomi

BANDEGGIODINAMICO

Informazioni sul tipo di replica di ogni cromosoma durante la fase S(uso raro in onco-ematologia)

Bandeggio Q

•mostarda di chinacrina (intercala tra copppie dibasi)

•contrasto tra bande: scarso

• non colora telomeri

•colora eterocromatina

Bandeggio R

•soluzione salina + Giemsa

•complementari a bande Q e G(soluzione salina)

•contrasto < a bandeggio G

•colora telomeri eucromatina

•colora poco eterocromatina

Cromosomi normali

Cromosomametacentrico

Cromosomasubmetacentrico

Cromosomaacrocentrico

Cariotipo normale

46 cromosomi(n. diploide)

22 coppie (omologhi)autosomi (1-22)

2 cromosomi sessualiXY (M) e XX (F)

Anomalie cromosomiche

Anomalie del numero

•quasi aploidi (n +/-)•ipodiploidi (2n-)•iperdiploidi (2n+)•pseudodiploidi•monosomie •trisomie

Anomalie strutturali

•traslocazioni (reciproche e non)•delezioni (intersiziali o terminali)•duplicazioni•inversioni

Traslocazioni

T (2;15) (p11.2;q11.2)

bilanciata sbilanciata

T (13;14) (p11.2;p11.2)

Delezioni cromosomiche

Del (7)(q11.23 q21.2)

delezione interstiziale

braccio lungo (q)cromosoma 7

CITOGENETICA MOLECOLARE (FISH)

La Fluorescent In Situ Hybridization(FISH) è una tecnologia che utilizzasonde nucleotidiche marcate (DNAprobes) per identificare specifiche regioni di un cromosoma ovverodeterminate sequenze del DNA.

Step:•denaturazione del DNA•incubazione sonda + DNA denaturato (“annealing”)•rilevazione del segnale della sonda con microscopio a fluorescenza

Tipi di sonde (DNA probe)

Sonde

Nucleotidi + biotina o digossigenina(fluorocromo + streptavidina)(fluorocromo + Ac anti-digossigenina)

nucleotidi coniugati a fluorocromi

Sonde

•Alfoidi: per sequenze ripetitive dei satelliti (anomalie numeriche)•Painting: specifiche per un cromosoma (cromosomi molto riarrangiati)•Locus singolo: sequenze specifiche DNA (es. geni di fusione)

FISH: tappe della metodica

Campioni DNA:

cromosomi inmetafase

onuclei in interfase

FISH in interfase

FISH inmetafase

probe per parteterminale del cr.

4q

FISH: vantaggi e limiti

Vantaggi

•Esamina elevato n. di cellule in tempi brevi•Metodica semplice•Elevata efficienza di ibridizzazione•Elevata sensibilità e specificità•Non necessità cellule in mitosi•Correla dato citogenetico con morfologico

Limiti

•Informazioni su singolo cromosoma/gene•Esame simultaneo di pochi DNA bersaglio•Soglia di positività da calcolare per ogni sonda•Possibili artefatti nell’analisi di inclusi in paraffina

Citogenetica nelle leucemie acute

Classificazione delle leucemie acute (entità cliniche all’interno di un citotipo FAB)

Definizione del rischio citogenetico (significato prognostico)

Monitoraggio della malattia minima residua: sensibilità citogenetica convenzionale < sensibilità FISH

TECNICHE DI

BIOLOGIA MOLECOLARE

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Tecnica che si basa sulla capacità di una DNA polimerasidi amplificare in modo esponenziale una regione di DNA asequenza sconosciuta (templato) posta tra due porzioni di DNA a sequenza nota.

Step:•Estrazione di DNA (o RNA)•Cicli di amplificazione: denaturazione “annealing” estensione dei primers•Analisi degli amplificati

PCR: estrazione di DNA (o RNA)

DNA

RNA

Proteinasi + fenolo-cloroformio-alcool isoamilicotime: 2 giorni

Guanidio isotiocianato + mercaptoetanolocloroformio ( a 4 °C)time: 2 giorni

DNA/RNA KIT commerciali/ strumenti per automazione

ConcentrazioneQualità spettrofotometria

260 nm (DNA)

280 nm (proteine)

A 260

A 280

PCR: cicli di amplificazione

Miscela di amplificazione

•DNA templato•DNA polimerasi termostabile•Buffer di reazione (TrisHCl e KCl)•Ione magnesio•Desossinucleotidi trifosfato•Primers: brevi sequenze di DNA a singolo complementari a sequenze note poste a monte e a valle del templato

PCR: cicli di amplificazione

Denaturazione(~ 1 min 95°C)

Raffreddamento e“annealing” dei primers(~ 1 min 45-60°C)

Estensione dei primersda DNA polimerasi(~ 1 min 72°C)

PCR: cicli di amplificazione

Cicli ripetuti 25-45 volte

Amplificazione: crescita esponenziale ed efficienza di reazione

Xn = X0 x (1 + Ex)n

Efficienza della reazione

Qualità e concentrazione del DNA/RNA Qualità e concentrazione del cDNAConcentrazione dei vari reagentiCondizioni di temperatura della reazioneNumero di cicli plateau

PCR qualitativa: analisi dei risultati

Elettroforesi in gel di agarosio

Corsa: 1/2 ora a 150 V

Colorazione con etidio bromuro

UV transilluminazione

Fotografia

Fig. 4

Roccaro et al.

GAPDH

Ang2

ddH

2O

0 n

M

5 n

M

7.5

nM

0

50

100

150

neg ctrl 0 5 7.5Bortezomib [nM]

Inte

rio

r ar

ea (

pix

el)

Ang1

GAPDH

ddH

2O

0 n

M

5 n

M

7.5

nM

0

20

80100

neg ctrl 0 5 7.5Bortezomib [nM]

Inte

rio

r ar

ea (

pix

el)

60

40

IGF-1

GAPDH

ddH

2O

0 n

M

5 n

M

7.5

nM

0

60

120

180

neg ctrl 0 5 7.5Bortezomib [nM]

Inte

rio

r ar

ea (

pix

el)

IL-6

GAPDH

ddH

2O

0 n

M

5 n

M

7.5

nM

GAPDH

ddH

2O

0 n

M

5 n

M

7.5

nM

VEGF

0

50

100

150

neg ctrl 0 5 7.5Bortezomib [nM]

Inte

rio

r ar

ea (

pix

el)

0

30

120

150

neg ctrl 0 5 7.5Bortezomib [nM]

Inte

rio

r ar

ea (

pix

el)

90

60

PCR qualitativa: vantaggi e limiti

Vantaggi

•Elevata sensibilità•Elevata specificità•Identificazione di traslocazioni non dimostrate dalla citogenetica•Possibilità di analisi simultanea delle traslocazioni più frequenti•Possibilità dell’esecuzione dell’analisi da campioni bioptici

Limiti

•Possibilità di contaminazioni•Efficienza di amplificazione variabile e dipendente da vari fattori•Impossibilità di stabilire la q di sequenza bersaglio•Presente all’inizio nel campione

PCR quantitativa real-time

Thermal-cycler (amplificazione)

Sistema ottico per rilievo dellafluorescenza

Software per raccolta ed analisidei dati

Analisi dei prodotti non alla finedella reazione, ma durante la fase di crescita lineare dellemolecole di amplificato

Real-time PCR: metodo Taqman

Sonda specifica per targetQ = fluorocromo quencher (rosso, onda lunga)

R = fluorocromo reporter (verde, onda corta)

Sonda Taqman si lega aDNA target

I primer si legano a 3’ e 5’del DNA templato

Real-time PCR: metodo Taqman

Real-time PCR: metodo Taqman

Real-time PCR: metodo Taqman

PCR quantitativa: vantaggi e limiti

Vantaggi

Limiti

VelocitàSensibilità (10-4 – 10-6)Specificità Standards commutabilità confrontabilità accuratezza

Variabilità nella determinazione quantitativaComplessità sperimentaleMancanza di standardsValutazione critica dei risultati

TECNOLOGIA DEI

MICROARRAY E

LEUCEMIE ACUTE

DNA-microarray

Metodica che consente di analizzare il profilo di espressione genica delle cellule.

Procedura di base: •Sequenze di DNA sono schierate in ordine su supporto solido.•Dal campione viene estratto mRNA e retrotrascritto in cDNA. •cDNA, marcato con tracciante fluorescente, ibridizza con sequenze su array.•Il livello di espressione di un gene è direttamente proporzionale all’intensità di segnale derivato dalle immagini digitali acquisite.

Principali tipi di microarray: 1. membrane based cDNA microarray 2. glass slide-based cDNA microarrays 3. oligonucleotide microarray o DNA chip

DNA-microarray e leucemie acute: possibili sviluppi

Riclassificare le leucemie

Individuare profili di espressione genica in relazione alla prognosi

Individuare profili di espressione genica in relazione a vie di trasduzione del segnale per definire terapie molecolari target

Individuare profili di espressione genica in relazione alla sensibilità o resistenza ad un dato farmaco