GiuseppeCalabreseOspedaleSpiritoSanto,PescaraUniversitàdiChie7

Citogene1caebiologiamolecolaredelleMDS

Definizione

Le sindromi mielodisplastiche sono ungruppo di malattie clonali delle cellulestaminali emopoietiche caratterizzate da

• ematopoiesi inefficace• dismorfismi delle varie filiere maturative• citopenie nel sangue periferico• Variabile tendenza alla evoluzione in

leucemia acuta mieloide

MPD MDS AMLRA

RARS

RA mult.

Dyspl

RAEB

sind. 5q-

t MDS

AML con

displ. Multilin

(con o senzaMDS preced)

AML ther.rel.

(Alchil, epipod.

altro)

con alt. citogen

t(8;21)

t(15;17)

inv(16)

alt. 11q23

Non ult

categoriz.

M0-M7 bifen,bas

MPDMDSJMML

aCML

CMML

CML Ph+

CNL

CEL

MI

PV

TE

Citogenetica nella MDS

• Delezioni o monosomie– Forme de novo 40-60%– Forme secondarie 70-80%

• Traslocazioni cromosomiche 2-5%

anomalie citogeneticheAlter. non bilanciate Alter. StrutturaliPerdite Acquisizioni

t(3;3)-5/5q- +8 inv(3)-7/7q- +11 t(3;5), t(3;21)11q- +21 t(5;12), t(5;17)-17/17p- i(17)-Y t(10;12)

complesse (>2 cromosomio >3 breakpoits)

• Alterazioni citogenetiche presenti nel 30-70% dei pazientiaffetti da MDS (t-MDS 95%)

• Nelle MDS primitive prevalgono le alterazioni singolecui possono aggiungersi altre alterazioni; ogni cromosomapuò essere interessato

• Nelle t-MDS le anomalie singole sono limitate per lo piùai cromosomi 5, 7 e 12. Spesso cariotipi complessi concospicue alterazioni qualitative, variazioni da metafase ametafase e cromosomi ad anello o dicentrici.

• Alterazioni condivise con le LAM (tranne pocheeccezioni)

anomalie citogenetiche

Valutazione prognostica

Low risk

low risk

int-1/low

high risk

int-2/high High risk

IPSS

Blasti midollari <10%

Blasti midollari >10%

Sistema prognostico internazionale per le SMD basato su numero diblasti, citogenetica e grado di citopenia

Citogenetica nella MDS

Rischio da anomaliacitogenetica (frequenzain MDS)

Anomalie citogenetiche Rischio di progressionein LMA (anni)*

Sopravvivenza mediana(anni)

Basso (51%) Cariotipo normaledel(5q) isolatadel(20q) isolata-Y isolata

5,6 3,8

Intermedio (32%) +81 o 2 anomaliemiscellanee noncomuni

1,6 2,4

Alto (17%) -7 o del(7q)Cariotipo complesso(<2 anomalie)

0,9 0,8

Significato prognostico delle anomalie cromosomiche nell’IPSS

* Intervallo di tempo necessario perché il 25% dei pazienti progredisca in LMA (Olney & LeBeau 2007)

Citogenetica nella MDSAnomalie crom. in FAB Anomalie crom. in WHO Anomalie crom. in IPSS

% % %

RARS 43 RARS 33 Basso 26

RA 53 RA 44 Intermedio 1 56

RAEB 71 MDS del(5q) 100 Intermedio 2 75

RAEB-t 81 RCMDS 75 Alto 94

RCMD 47

RAEB-1 66

RAEB-2 67

MDS-U 57

Citogenetica nella MDS

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

45,0

normale

1 anomalia

2 anomalie

car. complex

anomalia Singola%

Associata%

+1q 1,2

anom. 3q 2,6

del(5q) 8,7 20

-7 2,7 10

del(7q)(q31q35) 4,1

+8 4,5 10

del(11)(q14q23) 1,0

del(12p) 3,4

del(17p) 1,2 7

del(20q) 3,0 5

-Y 1,0 10

Miscellanee 5,5

Citogenetica nella MDS• Riarrangiamenti cromosomici ricorrenti rari

anomalia geni coinvolti correlazione clinica

La sindrome del 5q-: un sottotipo distinto• Descritta per la prima volta da Van den Berghe (1974) e

successivamente da Sokal (1975)• Clinicamente:

– anemia macrocitica– piastrine normali o aumentate– Prevalente sesso femminile– Eritropoiesi ipoplasica, aumentato numero di megacariociti, molti

con nuclei ipolobati (micromegacariociti)– blasti midollari <5%

• delezione isolata in 5q• lunga sopravvivenza e prognosi simile ai pazienti con RA (criteri

WHO)• Necessari ulteriori studi citogenetici e molecolari per individuare il (i)

gene (i) responsabili.• Terapia con Lenalidomide

Difetti cromosomici che non individuanoentità biologico-cliniche specifiche

Anomalia Diagnosi Filiere cellulari coinvolte

20q- MDS/PV Mieloide e linfoide B

-7 MDS/MPS Mieloide e linfoide B

7q- MDS/AML ----------

+8 MDS/AML/MPS Mieloide

+1q MDS/ALL/MPS -----------

5q− (n=59) − 7 /7q− (n=38) trisomy8(n=44)

Addi%onalanomaly % Addi%onalanomaly % Addi%onalanomaly %

+8 17 +21 10 5q− 23+21 13 5q− 10 +21 11

−2 0/20q− 8 +8 10 der(3q21/q26) 7

−7 7 inv(3q) 5 +11 7

der/del(12p) 7 del(12p) 5 −7 5

der/del(3p) 5 t(11q23) 5 del(12p) 5

der/t(21q) 5 iso(17)(q10) 5 +13 5

t(11q23) 3 Others 50 +14 5Others 35 +8* 5

del(1p) 5Others 22

Frequencies (in percent of all cases with the respective primaryabnormality) of accompanying abnormalities (Haase et al 2007;2008)

Citogenetica nella MDS• Sono stati condotti finora pochi studi con l’utilizzo

dell’M-FISH/SKY nelle MDS;• Nel nostro laboratorio abbiamo analizzato 31 pazienti

(13M/11F) con MDS;• Provenienza: ospedale di Pescara, Napoli e Reggio

Calabria;• Età media: 65 aa (range 16-81);• Sottogruppi FAB: RA: 1; RAEB: 5; RAEBt: 7; MDS

con pancitopenia: 1; MDS con gammopatia: 1;MDS non classificati 14; MDS secondaria a LLC: 1;MDS secondaria a LMMC: 1.

• Sopravvivenza media: 37 mesi (range 1-108 mesi).Pazienti viventi 10.

Citogenetica nella MDS

• Risultati 1.• L’analisi in SKY ha permesso di:• ridefinire il cariotipo in 17/18 casi con >3

breakpoint (91%);• confermare il cariotipo osservato in

citogenetica convenzionale nei 13 casi con <3cromosomi rimaneggiati.

Citogenetica nella MDS• Risultati 2.• Sono stati classificati mediante SKY:

• 17 cromosomi marker;

• 8 cromosomi citogeneticamente identificati soloparzialmente (add);

• 4 cromosomi dicentrici;• 10 traslocazioni parzialmente non definite.

• 3 traslocazioni criptiche;

Citogenetica nella MDS

• delezione diTEL/ETV6 in 7pazienti

• delezione di TP53in 6 pazienti

11

11

12

12

• Risultati 3.• Sono così stati individuati riarrangiati geni specifici:• Amplificazione di

MLL in 3 pazienti

Riarrangiamenti dei cromosomi 5, 7 e 11nelle MDS

• L’analisi in FISH con sonde locus- o gene-specifiche el’analisi SKY consentono di migliorare notevolmente ladefinizione del cariotipo nei disordini ematologici anchecon campioni critici (Veldman et al 1997; Kazuka et al1999; Calabrese et al 2000; Van Limbergen et al 2002).

• Tuttavia nei riarrangiamenti complessi intracromosomici lacaratterizzazione di cromosomi anomali rimane di difficileesecuzione (Rowley, 1999; Nietzel et al 2002; Heller et al2004).

Citogenetica nella MDSL’analisi con bandeggiatura multicolor (MCB) ha permesso di definireulteriormente i riarrangiamenti in 8/11 pazienti con >3 breakpoint giàriclassificati mediante SKY

Paz.10

Paz. 15

Citogenetica nella MDS• Conclusioni.• L’analisi citogenetica è necessaria per la caratterizzazione dei pazienti.

Il cariotipo da midollo osseo è importante alla diagnosi. Durante il followup esso può essere affiancato dalla FISH;

• L’analisi in SKY ha ridefinito il cariotipo nel 91% dei pazienti con MDSanalizzati alla diagnosi;

• Sono state identificate 13 traslocazioni criptiche o parzialmente criptiche.Una anomalia cromosomica non specifica ricorrente identificatadall’analisi in SKY [t(1;16)(q11;q11)] in 2 pazienti potrebbe rappresentareun nuovo marker della malattia;

• Le metodologie SKY e MCB hanno consentito di svelare ilriarrangiamento di geni coinvolti nella progressione della MDS fornendoinformazioni sulle basi biologiche della malattia.

-5/del(5q)

-5 -5

del(5q)

FISH

-7

del(7)(q33)

del(7)(q25)

del(7)(q33)

-7 / del(7q)

+8

Cariotipo o FISH?Major implications for monitoring myelodysplastic syndrome patients withdel(5q) treated by lenalidomide (Gohring et al 2011):1.the del(5q) clone is detected with significantly greater sensitivity by karyotyping than byFISH, thus making the diagnosis of non-remission and cytogenetic relapse possible only bykaryotyping in a significant number of patients.2.without prior knowledge of the additional chromosome aberrations, clonal evolution canonly be identified by karyotyping. At the time point of clonal evolution, even del(5q) isdetected only by karyotyping in a significant number of patients.3.detection of the del(5q) clone is sometimes only possible by FISH, making the diagnosis ofnon-remission and cytogenetic relapse in these patients only possible by FISH analysis.

Thus, all cytogenetic follow-up investigations must include karyotyping.FISH analysis should be performed if karyotyping gives no sufficient results,e.g. due to poor chromosome morphology or due to a low number of metaphases(< 25 metaphases).

Citogenetica delle MDS

• Ulteriori indagini:• verifica del coinvolgimento di sequenze

responsabili dell’insorgenza del breakpointin 5q (LCRs)

• arrayCGH

2011-Mutazioni geniche in SMD : >16 target%

Bejar & Ebert 2011

Loss of function

Gain of function

Loss/Gain of function

Targets of point mutations and deletions in MDS (Bejar et al 2011)

Galm et al 2006

Epigenetica nella MDS

MBP: proteina legante metilcitosina

HDAC: deacetilasi istonica

A: attivatore trascrizionale

R: repressore trascrizionale

CpG metilata

CpG demetilata

HAT: acetiltransferasi istonica

TF: fattore di trascriz.

Hanno collaborato:Genetica Medica Chieti/PescaraG. PalkaP. Guanciali Franchi D. Fantasia R. Di GianfilippoE. MorizioD. Romagno

Genetica Medica, Reggio Calabria Genetica Medica Napoli ASL01C. Laganà A. Zatterale

Ematologia PescaraR. Di LorenzoT. SpadanoG. Fioritoni