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ASSICURAZIONE QUALITÀ DEI DATI IN MICROBIOLOGIA

IX MEETING DEI RESPONSABILI E TECNICI DILABORATORIO DEL SETTORE LATTIERO-CASEARIO

MontegrottoTerme, 4-5 Dicembre 2008

Giuseppina Pedota

Laboratorio APA Potenza

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METODI QUANTITATIVI

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Per i metodi quantitativi si seguono le prescrizioni della ISO 7218:2007, ossia si considera una piastra per ogni diluizione e due diluizioni successive.

Per il calcolo dello scarto tipo di riproducibilità (SR) si è deciso di seguire la prima opzione del par. 4.2 della ISO/TS19036:2006, secondo cui è possibile calcolare lo scarto tipo intralaboratorio.

Si è provveduto, quindi:

Ad eseguire una serie di prove su un materiale opportunamente contaminato;

Ad esaminare i dati di laboratorio dell’ultimo anno per le differenti matrici.

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Dopo aver sottoposto i dati alla elaborazione così come descritto al par. 5.3 della ISO/TS 19036, ovvero :

∑=

−=

n

iiBiA

Ryy

ns

1

2

2)(1

Con

yij = dati trasformati in log10 (cfu/g o cfu/ml)

i = indice del campione, i = 1, …, n per n ≥ 10

j = indice della condizione di riprobucibilità, j = A o B.

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Come esprimere, allora, i risultati d’analisi?

Al par. 8 della ISO/TS 19036 vengono presentate diverse possibilità di espressione dei risultati:

y ± 2sR (log)

y log [y - 2sR , y + 2sR]

x cfu/g o x cfu/ml [10 y - 2sR, 10 y + 2sR]10 y - 2sR 10 y + 2sR

x cfu/g o x cfu/ml [10y - %, 10y + %]10y 10y

Si è deciso di esprimere il risultato secondo la terza opzione

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METODI QUALITATIVI

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Presso il nostro laboratorio si eseguono determinazioni qualitative per la rivelazione della Presenza/Assenza di:

Salmonella spp (ISO 6579)

Listeria monocytogenes (ISO 11290-1, Amd 1)

Sostanze inibenti nel latte (M.I.)

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Un metodo per calcolare le incertezze di misura nelle prove qualitative fa riferimento alla Regola (o Teorema) di Bayes, ossia si va a determinare la probabilità a priori che si verifichi un esito positivo secondo la formula seguente:

)|()()|()()|()()|(

nonHDpnonHpHDpHpHDpHpDHp

+=

Con:

p(H|D) = valore predittivo positivo

p(H) = frequenza di positivi (tasso di base)

p(D|nonH) = frequenza di falsi positivi = 1 - specificità

p(D|H) = frequenza di veri positivi = sensibilità

D = diagnosticati; H = positivi

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La formula precedente potrebbe, in linea di principio essere semplificata nel seguente modo:

ba

a

nnnivoesitopositpositivop+

=)|(

Con:

na = positivi

nb = negativi

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Naturalmente, tutto questo potrebbe risultare ostico quando a leggere un rapporto di prova non è un tecnico ma un utente comune, non addentro, cioè, alla “delicata” materia statistica.

A tal proposito si è ritenuto più opportuno considerare i valori di sensibilità e specificità associati, rispettivamente, ai campioni positivi ed ai campioni negativi, secondo le seguenti formule:

dcdàspecificit+

=baaàsensibilit+

=

Con:

a = veri positivi; b = falsi negativi;

c = falsi positivi; d = veri negativi.

(UNI EN ISO 13843:2003)

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La sensibilità rappresenta, quindi, la percentuale di campioni, analizzati correttamente, riscontrati come positivi.

La specificità rappresenta, quindi, la percentuale di campioni, analizzati correttamente, riscontrati come negativi.

(ISO 11290-1:1996/ Amd. 1:2004)

Questi due dati sembrano dare, in modo abbastanza immediato, idea della validità del dato analitico.

I dati ottenuti in laboratorio, per citarne uno, ad esempio per la determinazione della Presenza/Assenza della Listeria monocytogenes, sono confrontabili con quelli riportati dalla Norma; il confronto è stato effettuato utilizzando il test F di Fisher.

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Oltre alla logica e sempre auspicabile partecipazione ai Circuiti Interlaboratorio per le prove microbiologiche e qualitative e quantitative, un ulteriore controllo qualità del dato analitico viene eseguito effettuando prove di ripetibilità e valutando con cadenza biennale e per ciascun analista abilitato il limite di rivelabilità ed il limite di quantificazione.

Spesso si è trovato che il limite di rivelabilità coincide con il limite di quantificazione.

Inoltre, ancor più spesso si trova che il limite di rivelabilità è alla stessa diluizione per i due analisti qualificati.

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Per toccare tutti i punti di controllo usati dal laboratorio perl’assicurazione dei dati in microbiologia, bisogna menzionare le prove di campionamento da superfici, per le quali non esistono circuiti interlaboratorio che permettano di misurare la “bontà” del passaggio pre-analitico effettuato da personale in forza al laboratorio stesso nell’ambito dei controlli HACCP.

Operativamente, si è proceduto al recupero da superfici di CBT, E. coli, Coliformi totali, Salmonella spp, Listeria monocytogenes.

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Prima di effettuare le prove riguardanti la CBT, gli Escherichia coli ed i Coliformi totali, si è proceduto alla sanificazione della superficie su cui effettuare il test, utilizzando composti a base di cloro (candeggina commerciale). Il prelievo viene effettuato utilizzando delimitatori d’area 10 cm x 10 cm.La CBT è stata determinata con un metodo interno; si è deciso di seminare le diluizioni 10-6, 10-7 e 10-8 della sospensione iniziale.Gli E. coli sono stati determinati con il metodo UNI 10980:2002; si èdeciso di seminare le diluizioni 10-5, 10-6,10-7 e 10-8 della sospensione iniziale.I Coliformi totali sono stati determinati con un metodo interno; si èstabilito di seminare le diluizioni 10-6, 10-7 e 10-8 .Per ciò che concerne le prove di recupero di Listeria monocytogenes e Salmonella typhimurium, invece, la superficie di 1 m x 1 m è stata rivestita con un film di alluminio. Sono state effettuate 8 prove per ogni diluizione e per ciascun analista qualificato. Le modalità operative sono riportate nei flow-chart delle slide successive.

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CBT, E. coli, Coliformi totali Listeria monocytogens

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Salmonella spp.

Per la determinazione della Salmonella spp. il metodo utilizzato èla ISO 6579:2002 e ISO 6579:2002/Cor.1:2004.

Per la determinazione della Listeria monocytogenes il metodo utilizzato èla ISO 11290:1996 e ISO 11290:1996/Amd.1:2004.

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Per la CBT e per i Coliformi totali il limite di rivelabilità è pari a ~ 10-7, per gli Escherichia coli, dai dati ottenuti, si evince che il limite di rilevabilità è pari a ~ 10-6. I dati ottenuti e in questa sede omessi per ovvie ragioni di tempo, sembrano trovare conforto con quanto riportato dalle norme ISO 17604 (Metodo di campionamento da carcasse) e ISO 18593 (Tecniche di campionamento da superfici)Per le prove di recupero per la Salmonella spp e la Listeria monocytogenes si sono ottenuti recuperi, partendo da concentrazioni di patogeni pari a ~ 150 · 106 ufc/ml, fino alla diluizione 10-7 che si ritengono soddisfacenti. Inoltre, è possibile affermare che il nostro limite di rivelabilità per Listeria e Salmonella è pari a 10-7.

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Per il calcolo statistico basato sulla distribuzione di Poisson:

Varianza = media (Cm), pertanto s = (Cm)1/2

Scarto tipo relativo = s/Cm =1/(Cm)1/2

Per conteggi inferiori a 15 ufc/pistra si fa riferimento a ai valori tabulati nella ISO 7218:1996 circa la distribuzione di Poisson.

Per conteggi superiori a 15 ufc/piastra nelle prove in doppio èpossibile fare una approssimazione della distribuzione di Poisson alla distribuzione normale, pertanto, il limite di Ripetibilità è dato da:

|C1-C2|/(C1+C2)1/2 = Kp

Con

Kp = 1,96 per p = 95%

1,96 ≤ Kp ≤ 2,576 per p compreso tra 95% e 99%

Kp > 2,576 per p > 99%

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Se il numero di prove replicate è maggiore di 2, ed almeno cinque, i dati devono essere sottoposti al test del χ2 sperimentale che viene confrontato con quello tabulato; inoltre, i dati vanno sottoposti al test di Huber o della mediana per verificare la presenza tra i dati restituiti dalle prove di dati anomali.

È auspicabile anche l’applicazione del test di proporzionalità della risposta analitica rispetto a due o più piastre seminate in parallelo per ogni livello di diluizioni.

Le formule da applicare ed esempi di applicazioni delle stesse sono facilmente rintracciabili sul sito dell’ARPA Emilia Romagna:

“La validazione dei metodi microbiologici: aspetti applicativi, controllo del processo analitico e valutazione dell’operatore” – Lido Ballati

(Atti della Giornata di Formazione Bologna 25 novembre 2004) http://www.arpa.emr.it/pubblicazioni/generale/notizie_105.asp

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A questo mondo non c’èniente di certo, a parte la morte e le tasse

(Benjamin Franklin)

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