AgonistaSuperagonista

Agonista parzialeAntagonista competitivo

Antagonista non competitivoAntagonista irreversibile

PotenzaEfficaciaAffinita’

Risposta

0

50

100

0.1 1 10 100 1000 10000EC50

Potenza

Efficacia~ sigmoidale

?

D + R

DR Risposta

Binding

R

R R

R

Separazione Filtrazione, centrifugazione

ligandoradioattivo

tessuto,membrane

R

Quant

ifica

zione

R

R

R

RR

R

R

R

RR

R

R

Totale (come prima) Non-specifico (in presenza di un eccesso diFarmaco non radioattivo)

R

R R

R

Legame specifico = legame totale - legame non specifico

Protocollo di binding (tipo 1)([crescenti] di radioattivo

R

[R]

R

[3R]

R

R

[10R]

R

R

R

[30R]

R

R

R

R

R

+ tutti i non-specifici rispettivi

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

0 20 40 60 80 100 120 Siti saturabili(Specifico)

Siti infiniti e non saturabili(non specifico)

totale

musc

musc

musc

nic

nic

nic

R

R

R

R

Acetilcolina radioattiva

totale Non-specifico

musc

musc

musc

nic

nic

nic

R

R

Acetilcolina Radioattiva +

Eccesso di muscarina

Recettori muscarinici = totale legato da R - non-specifico in presenza di musc

Autoradiografia per scoprire la distribuzione di proteine di membrana o intracellulari

La PET come limite estremo di binding

D + R

DR

[DR][D] [R]

Ka =

1Ka

Kd =

Quando [DR] = [R] allora Kd = [D]

[D][R][DR]

Kd =

k1

k2

Affinita’

D + R

DR()(1 - )

R + DR e’ un numero costante. Quindi vi sara’ una concentrazione di Dcon la quale tutti i recettori saranno occupati. Questo proprieta’ viene definita saturazione

[D] - [D]

KA =

KAD - KAD =

KAD = + KAD

KAD = + KAD

Lo Scatchard plot

=KA[D]

1 +KA[D]

[DR][RT]

KA[D]1 +KA[D]

=

[DR] + KA[D][DR] = [RT]KA[D]

= [RT]KA - KA[DR][DR][D]

= -KA([DR] - [RT])[DR][D]

Proporzione dei recettorilegati

[DR][D]

[DR]

Pendenza = - KA

RT

= -KA([DR] - [RT])[DR][D]

Scatchard Plot

LEGATO

LEGATO/LIBERO Bmax

Ka (-pendenza)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500Bound (CPM)

A

C

B

Paziente A Paziente B Paziente CIntercetta X 3193 399 3335 CPM - Pendenza 0.0114 0.0115 0.0065 nM-1

Leg

ato/

Lib

ero

(dp

m/n

M)

Legato (dpm)

Avete appena scoperto un nuovo metodo per ottenere cellule dissociate da un organo ma dovete caratterizzare il sistema per confermare che queste cellule si comportano in maniera uguale al tessuto originale. Per fare questo, utilizzate N-metil-scopolamina (3H-NMS) ed una sospensione di cellule intatte (100,000 cellule per tubo). Affinita’ ed il numero di recettori per cellula.

[3H-NMS] pM legame specifico (fmol/tubo)20 0.2450 0.51100 0.80200 1.14500 1.541000 1.74

I due tipi di binding: tipo I e tipo II

Saturazione Competizione

[X*]

[3X*]

[X*]

Protocollo di binding (tipo 2)Radioattivo fisso e [crescenti] di spiazzante non radioattivo

R

[R]

R

R

R

R

R

[R] + F

R

R

R

R

[R] + 10F [R] +1000F

R R R R

Non specifico

Perche’ utilizzare questo protocollo???

Binding

R R

R

Separazione Filtrazione, centrifugazione

ligandoradioattivo

tessuto,membrane

R

Quant

ifica

zione

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

0 20 40 60 80 100 120

Tubo numero Ligando radioattivo Ligando non radioattivo spiegazione Farmaco radioattivo legato1 0.1 - Conte totali 34502 0.1 0.01 33503 0.1 0.03 31004 0.1 0.1 25005 0.1 0.3 17006 0.1 1 10007 0.1 3 7008 0.1 10 5509 0.1 30 510

10 0.1 100 Non-specifico 500

Esempio di binding (II)CONCENTRAZIONE DI RADIOATTIVO COSTANTE; INCREMENTO DI SPIAZZANTE

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

0.001 0.01 0.1 1 10 100

Tubo numero Ligando radioattivo Ligando non radioattivo spiegazione Farmaco radioattivo legato1 0.1 - Conte totali 34502 0.1 0.01 33503 0.1 0.03 31004 0.1 0.1 25005 0.1 0.3 17006 0.1 1 10007 0.1 3 7008 0.1 10 5509 0.1 30 510

10 0.1 100 Non-specifico 500

Curva diinibizione

A* + R AR B + R BR

KA =[AR]

[A][R]KB =

[BR][B][R]

[AR] = KA[A][R] [BR] = KB[B][R]

RT = [R] + [AR] + [BR]

= [R] + KA[A][R] + KB[B][R]

= [R](1+ KA[A] + KB[B])

[R] =(1+ KA[A] + KB[B])

RT

[AR] = KA[A]RT

(1+ KA[A] + KB[B])

[AR] RT

KA[A]RT

(1+ KA[A] + KB[B])=

[AR] RT

KA[A]RT

(1+ KA[A] + KB[B])=

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

0.001 0.01 0.1 1 10 100

0.5 IC50

Se KA e KB sono uguali:KA = 1 + KB[B]*IC50

KA = 1IC50 - D*

Esempio di binding (II)

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

0.001 0.01 0.1 1 10 100

Legame specifico: 3500 - 500 = 3000

N.S.

Legame a 0.1 nM di radioattivo

D* = 0. 1 nMIC50 = 0.2 nM

KA = 1IC50 - D*DR

RT[D*]KA

[*D]KA + 1=

Una delle prime formule che abbiamo visto

10 253430 2525

100 2378300 1734600 1111

1000 6873000 154

10000 101

Proviamo

L’NAADP e’ un possibile secondo messaggero. Per dimostrare che possiede recettori specifici intracellulari, e’ stato sintetizzato [32P]NAADP ad una attivita’ specifica di 800 Ci/mmol. Ilbinding e’ stato fatto con concentrazione fissa di [32P]NAADP (50 pM),100 µg di proteina e concentrazioni crescenti di NAADP.

[NAADP]pM

DPM