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Identificare le proteine che sono in grado di interagirecon il prodotto del gene di interesse in modo specifico:

1) Co-immunoprecipitazione

2) Libreria con il “sistema doppio ibrido di lievito”-Interaction trap system (Fields and Sternglanz 1994): leproteine che si legano fisicamente l’una all’altra vengono Individuate mediante la loro capacita` di attivare la trascrizione di un gene indicatoreIl sistema a singolo ibrido. Obiettivo identificare le proteineche si legano ad un elemento di regolazione bersaglio, cheagisce in cis, solitamente una sequenza di DNASistema a triplo ibrido: terza molecola che puo`essere unRNA o una molecola proteica

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I sistemi “a doppio Ibrido”e a “singolo ibrido”in lievito

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Phage Display

1) Inserimento di frammenti di DNA estraneo nel gene diuna proteina fagica di rivestimento. Il gene modificatoe`espresso come proteina di fusione, che viene incorporatanel virione e risulta visibile sulla superficie del fago.

Tra le applicazioni: -ingegneria degli anticorpi-ingegneria dell proteine in generale (es. selezione di varianti desiderabili da una libreria di mutanti) -studio delle interazioni proteina-proteina

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Phage display

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Manipolazione genetica degli animali

-Studio della funzione genica-Modelli animali per le malattie

Oocita fecondatoCellule staminali embrionali (ES, post-zigotichenessuna separazione fra linea somatica e linea germinale)

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Preparazione di topi transgenici mediante microiniezione nei pronuclei

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Le cellule ES modificategeneticamente costituiscono un mezzoper trasferire DNA estraneo o mutazionispecifiche nella linea germinale del topo

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La mutagenesi mirata mediante ricombinazione omologa puòinattivare un predeterminato gene cromosomico all’internodi una cellula integra“Hit and run”

Vettori di inserzione

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La mutagenesi mirata con doppia sostituzione può essere usata per introdurre nel DNA piccole mutazioni

“Tag and exchange”Vettori di sostituzione

HPRT+ TK-

TK esternoalla regionedi omologia

HPRT-

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Il metodo knock-in consente di sostituire l’attività di un gene di undato cromosoma con quella di un altro gene appositamente introdotto

Il gene En-2 va a finire sotto il controllo del promotore di En-1

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Sistemi di ricombinazione sito-specifica

CRE-loxP del batteriofago P1

CRE Causa di recombinazionemedia la ricombinazione fra due sequenze loxPcon lo stesso orientamento, in seguito a tale evento la sequenza collocata fra I due siti viene escissa

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Struttura della sequenza di riconoscimento di loxP

loxP loxP

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Gene trapping

Principio: gene indicatore è espresso solo dopo il suo inserimentoin un gene (sia introne che in un esone) o in un promotore. Integrandosi puo’ acquisire gli elementi che mancano per essere

espresso

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Clonazione animale

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Anthony J. F. GRIFFITHS et al.

GENETICA

sesta edizione

Cap 11Isolamento e Manipolazione del gene