Identificare le proteine che sono in grado di interagire con il prodotto del gene di interesse in...
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Identificare le proteine che sono in grado di interagirecon il prodotto del gene di interesse in modo specifico:
1) Co-immunoprecipitazione
2) Libreria con il “sistema doppio ibrido di lievito”-Interaction trap system (Fields and Sternglanz 1994): leproteine che si legano fisicamente l’una all’altra vengono Individuate mediante la loro capacita` di attivare la trascrizione di un gene indicatoreIl sistema a singolo ibrido. Obiettivo identificare le proteineche si legano ad un elemento di regolazione bersaglio, cheagisce in cis, solitamente una sequenza di DNASistema a triplo ibrido: terza molecola che puo`essere unRNA o una molecola proteica
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I sistemi “a doppio Ibrido”e a “singolo ibrido”in lievito
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Phage Display
1) Inserimento di frammenti di DNA estraneo nel gene diuna proteina fagica di rivestimento. Il gene modificatoe`espresso come proteina di fusione, che viene incorporatanel virione e risulta visibile sulla superficie del fago.
Tra le applicazioni: -ingegneria degli anticorpi-ingegneria dell proteine in generale (es. selezione di varianti desiderabili da una libreria di mutanti) -studio delle interazioni proteina-proteina
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Phage display
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Manipolazione genetica degli animali
-Studio della funzione genica-Modelli animali per le malattie
Oocita fecondatoCellule staminali embrionali (ES, post-zigotichenessuna separazione fra linea somatica e linea germinale)
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Preparazione di topi transgenici mediante microiniezione nei pronuclei
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Le cellule ES modificategeneticamente costituiscono un mezzoper trasferire DNA estraneo o mutazionispecifiche nella linea germinale del topo
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La mutagenesi mirata mediante ricombinazione omologa puòinattivare un predeterminato gene cromosomico all’internodi una cellula integra“Hit and run”
Vettori di inserzione
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La mutagenesi mirata con doppia sostituzione può essere usata per introdurre nel DNA piccole mutazioni
“Tag and exchange”Vettori di sostituzione
HPRT+ TK-
TK esternoalla regionedi omologia
HPRT-
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Il metodo knock-in consente di sostituire l’attività di un gene di undato cromosoma con quella di un altro gene appositamente introdotto
Il gene En-2 va a finire sotto il controllo del promotore di En-1
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Sistemi di ricombinazione sito-specifica
CRE-loxP del batteriofago P1
CRE Causa di recombinazionemedia la ricombinazione fra due sequenze loxPcon lo stesso orientamento, in seguito a tale evento la sequenza collocata fra I due siti viene escissa
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Struttura della sequenza di riconoscimento di loxP
loxP loxP
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Gene trapping
Principio: gene indicatore è espresso solo dopo il suo inserimentoin un gene (sia introne che in un esone) o in un promotore. Integrandosi puo’ acquisire gli elementi che mancano per essere
espresso
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Clonazione animale
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Anthony J. F. GRIFFITHS et al.
GENETICA
sesta edizione
Cap 11Isolamento e Manipolazione del gene
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Metodi con cuisi puo’ introdurrein una cellula DNA estraneo
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Due metodi con cui un ceppo ricevente di lievito puo’ essere trasformato
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Ingegneria genetica delle piante
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Il T-DNA insieme a qualsiasi segmento di DNA in esso contenuto-si e’ inserito in un cromosoma della pianta transgenica, quindiViene ereditato come un carattere mendeliano semplice
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Ingegneria genetica degli animali
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Gene targetingKnockout
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Produzione diun topo knockout
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Terapia genica
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