Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

36
Biologia Molecolare Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato

Transcript of Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

Page 1: Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

Biologia MolecolareBiologia Molecolare

Caratterizzazione di un gene clonato

Page 2: Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

Il sequenziamentoIl sequenziamento

Sequenziare significa determinare la successione dei monomeri che costituiscono un polimero biologico

•PROTEINE (sequenza di Aminoacidi)

•DNA (sequenza di nucleotidi)

•DNA Genomico

•cDNA

Page 3: Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

Principi del sequenziamento del DNAPrincipi del sequenziamento del DNA

Molte tecniche di biologia molecolare si basano sulla possibilità di replicare molecole di DNA in vitro:-Molecola stampo-Nucleotidi trifosfato-DNA polimerasi-Primers-Appropriato buffer di reazione

Page 4: Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

La replicazione del DNALa replicazione del DNA

I Nucleotidi utilizzati durante questa sintesi non sono nucleotidi normali (cioè nucleosidi-fosfato) ma sono nucleosidi trifosfato.Questi legami fosfato sono legami ad alta energia, la loro rottura e la liberazione del pirofosfato fornisce energia più che sufficiente per la generazione del nuovo legame covalente tra un nucleotide e un altro

Page 5: Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

Metodo di SangerMetodo di Sanger

Page 6: Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

Metodo di SangerMetodo di Sanger

Page 7: Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

Sequenziamento automaticoSequenziamento automatico

• Stesso principio del metodo di Sanger• Il primer o i ddNTP sono marcati con un

marcatore fuorescente• Lettura tramite laser della molecola appena

questa esce dal gel• Utilizzo di una sola corsia

– Se si marca il primer?– Se si marcano i ddNTP

• Gel di poliacrillamide o capillare• Dato di sequenza acquisito automaticamente

e trasferito al computer

Page 8: Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

Interpretazione automatica del datoInterpretazione automatica del dato

elettroferogramma

Page 9: Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

Allungare la sequenzaAllungare la sequenza

• Con i metodi automatici è possibile ottenere sequenze oltre il migliaio di basi

• Con l’allungamento della sequenza diminuisce la risoluzione e l’intensità del segnale

• Aumento probabilità che una struttura secondaria termini la sintesi

• L’affidabilità diminuisce allontanandosi dal primer

Page 10: Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

WalkingWalking

Page 11: Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

Sequenziamento shotgunSequenziamento shotgun

• Per sequenziare un frammento lungo la migliore stratgia è quella di dividerlo in framenti più piccoli.

• Il DNA può essere frammentato e clonato in una librerie M13 o in plasmidi.

• La libreria deve contenere frammenti parzialmente sovrapposti

• Dalla libreria si prelevano cloni a caso e si sequenziano

Page 12: Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

Sequenziamento shotgunSequenziamento shotgun

Page 13: Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

Diminuzione della produttivitàDiminuzione della produttività

• Una accurata determinazione del 90% della sequenza può essere ottenuta molto rapidamente

• Per ottenere un ulteriore 9% sarà necessario un tempo paragonabile a quello utilizzato per ottenere il 90%

• Una quantità simile di lavoro sarà necessaria per ottenere un ulteriore 0,9%

Page 14: Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

Effettuata da alcuni virus a RNA chiamati retrovirus

Il flusso dell’informazione genicaIl flusso dell’informazione genica

Il dogma centrale della biologia•L’informazione genica è contenuta nel DNA

•Questa informazione è perpetuata nelle generazioni future tramite il processo semiconservativo chiamato duplicazione del DNA

•L’espressione della informazione genica è invece un processo che passa attraverso un intermediario transitorio: l’RNA messaggero. Questa molecola è sintetizzata sulla base di uno STAMPO sul DNA e l’informazione in esso contenuta serve per dirigere la sintesi di proteine.

•L’informazione passa (quasi) sempre dal DNA all’RNA e da questo alle proteine.

DNA RNA ProteinaTrascrizione Traduzione

Mantenimento dell’informazione Trasferimento dell’informazione Ruolo funzionale

Informazione contenuta nella sequenza

Informazione contenuta nella sequenza e nella quantità

Informazione contenuta nella struttura e nella quantità

Retrotrascrizione

Page 15: Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

IL DNA: natura ed informazioneIL DNA: natura ed informazione

Contenuto informativo del DNALa struttura del DNA è costante. Il DNA è sempre una doppia elica INDIPENDENTEMENTE dalla sequenza di nucleotidi che lo compone.

L’ossatura di zucchero e fosfato è costante.

La parte variabile, e quindi più informativa, è rappresentata dalla sequenza di BASI AZOTATE.

Per questo motivo, in bioinformatica, l’informazione contenuta nel DNA è rappresentata da una stringa composta da un alternanza 4 caratteri che rappresentano le basi azotate del DNA.

GCGGCGGCGGGCGGGTACTGGCTTCTGGGGCCAGGGGCCAGGGGCGGTGGGCGCCGGGACCGCGGAGCTGAGGAGCGGGGCCCGGCCAGGGCTGGAGACTTTGCGCCCGGGGGCACCGGGGCTGCGCGCGGTCGCACACATCCACCGGCGCGGCTTCCCTCGGCGGCCCGGGCTCCGCTCATCCTGCGGCGGGCGGCGCCGCTCAGGGGCGGGAAGAGGAGGCGGTAGACGCGACCACAGAAGATGTCGGGCCAAACGCTCACGGATCGGATCGCCGCCGCTCAGTACAGCGTTACAGGCTCTGCTGTAGCAAGAGCGGTCTGCAAAGCCACTACTCATGAAGTAATGGGCCCCAAGAAAAAGCACCTGGACTATTTGATCCAGGCTACCAACGAGACCAATGTTAATATTCCTCAGATGGCCGACACTCTCTTTGAGCGGGCAACAAACAGTAGCTGGGTGGTTGTGTTTAAGGCTTTAGTGACAACACATCATCTCATGGTGCATGGAAATGAGAGATTTATTCAATATTTGGCTTCTAGAAATACACTATTCAATCTCAGCAATTTTTTGGACAAAAGTGGATCCCATGGTTATGATATGTCTACCTTCATAA

Page 16: Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

I GeniI Geni

• Il gene è l'unità ereditaria e funzionale degli organismi viventi.

• La maggior parte dei geni codifica proteine, che sono le macromolecole maggiormente coinvolte nei processi biochimici e metabolici della cellula.

• Altri geni non codificano proteine, ma producono RNA non codificante, che può giocare un ruolo fondamentale nella sintesi delle proteine e nell'espressione genica (La trascrizione del DNA in RNA e la traduzione dell'RNA in proteina).

• Parte del contenuto dei geni non viene trascritto, ma può coordinare la stessa espressione genica.

• Tra queste regioni figurano i promotori, i terminatori e gli introni .

Page 17: Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

Struttura del geneStruttura del gene

Page 18: Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

Non tutti gli esoni codificanoNon tutti gli esoni codificano

• Gli esoni sono normalmente codificanti, ad eccezione di quelli alle estremità 5' e 3' del gene.

• Tali esoni prendono il nome di UTR (UnTranslated Region).

• In questo caso il 5' UTR è costituito da tutto il 1° esone e da parte del 2° esone (regione arancione).

• La regione codificante è indicata in blu, inizia nel 2° esone e termina nell'ultimo esone.

• Il 3' UTR è costituito da parte dell'ultimo esone (regione gialla).

Introni

Esoni

Page 19: Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

I GeniI GeniI GeniI Geni

• Il gene è l’unità ereditaria e funzionale degli organismi viventi; ad esso sono associate molteplici informazioni:

GeneGene

Sequenze omologhein altri genomi

AnalisiFilogenetica

Sequenza Localizzazionegenomica

Struttura

Proteina(Funzione)

Page 20: Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

Le sequenze biologicheLe sequenze biologicheLe sequenze biologicheLe sequenze biologiche

• Le sequenze nucleotidiche vengono rappresentate mediante stringhe su un alfabeto di 4 caratteri (A, C, G, T), nelle quali ciascun carattere rappresenta un singolo nucleotide.

• Analogamente le sequenze proteiche (o aminoacidiche) vengono rappresentate mediante stringhe su un alfabeto di 20 caratteri, ciascuno dei quali rappresenta un singolo aminoacido.

Page 21: Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

Lo Standard IUB/IUPACLo Standard IUB/IUPACLo Standard IUB/IUPACLo Standard IUB/IUPAC

Aminoacidi

A Alanina B Acido Aspartico o Asparagina C Cisteina

D Acido Aspartico E Acido Glutammico F Fenilalanina

G Glicina H Istidina I Isoleucina

K Lisina L Leucina M Metionina

N Asparagina P Prolina Q Glutammina

R Arginina S Serina T Treonina

U Selenocisteina V Valina W Triptofano

Y Tirosina Z Acido Glutammico o Glutammina X Qualsiasi (Any)

* Stop traduzione - Gap

Acidi Nucleici

A Adenina R G o A (Purine) B G T C

C Citosina Y T o C (Pirimidine) D G A T

G Guanina K G o T H A C T

T Timina M A o C V G C A

U Uracile W A o T N A C G T (Any)

- Gap

Page 22: Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

NCBINCBINCBINCBI

• NCBI (National Center for Biotechnology Information) è l’istituto americano che ospita GenBank, una delle tre banche dati primarie di sequenze nucleotidiche (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

• Oltre a GenBank in NCBI sono disponibili numerosi altri Database tra cui:– GenPept: Database di sequenze proteiche– Gene: Database di geni– Pubmed: Database di letteratura biomedica (Abstract,

articoli e citazioni)• NCBI offre anche svariati strumenti per l’analisi di

dati biologici tra cui BLAST, un tool che permette di effettuare ricerche per similarità nei database di sequenze.

Page 23: Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

EntrezEntrezEntrezEntrez

• I vari database di NCBI sono accessibili mediante un unico motore di ricerca che prende il nome di Entrez:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/index.html

Page 24: Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

Esempio di ricerca: BAX (1)Esempio di ricerca: BAX (1)Esempio di ricerca: BAX (1)Esempio di ricerca: BAX (1)

• Ricerchiamo i dati relativi al gene BAX utilizzando Entrez:

• Otterremo i risultati suddivisi per categoria:

Page 25: Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

Esempio: BAX (2)Esempio: BAX (2)Esempio: BAX (2)Esempio: BAX (2)

• Nella pagina dei risultati relativi alle sequenze nucleotidiche clicchiamo sul link alla sequenza cercata:

• A questo punto otterremo la pagina coi risultati (formato GenBank), che andiamo a vedere nel dettaglio nella prossima slide.

Page 26: Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

Esempio: BAX (3)Esempio: BAX (3)Esempio: BAX (3)Esempio: BAX (3)

Lunghezza Lunghezza della della sequenzasequenza

Tipo di Tipo di sequenzasequenza

Accession Accession NumberNumberOrganismoOrganismo

Riferimenti Riferimenti bibliograficibibliografici

Page 27: Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

Esempio: BAX (4)Esempio: BAX (4)Esempio: BAX (4)Esempio: BAX (4)

Link alla Link alla regione regione codificantecodificante

Estremi Estremi della CDSdella CDS

Link alla Link alla proteina proteina corrispondecorrispondentente

Page 28: Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

Esempio: BAX (5)Esempio: BAX (5)Esempio: BAX (5)Esempio: BAX (5)

• Cliccando su “CDS” otteniamo la regione codificante della sequenza:

Page 29: Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

Il formato FASTAIl formato FASTAIl formato FASTAIl formato FASTA

• E’ possibile scegliere il formato di visualizzazione della sequenza; scegliamo il formato più utilizzato, il FASTA.

• E’ anche possibile inviare la sequenza nel formato prescelto direttamente su file (Send to -> File).

Page 30: Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

Esempio: BAX (6)Esempio: BAX (6)Esempio: BAX (6)Esempio: BAX (6)

• A questo punto andiamo a visualizzare la proteina codificata cliccando A questo punto andiamo a visualizzare la proteina codificata cliccando sul link relativo; si aprirà una pagina simile a quella vista per la sul link relativo; si aprirà una pagina simile a quella vista per la sequenza nucleotidica (formato GenPept):sequenza nucleotidica (formato GenPept):

Page 31: Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

Esempio: BAX (7)Esempio: BAX (7)Esempio: BAX (7)Esempio: BAX (7)

• Facciamo adesso un passo indietro tornando alla schermata di Entrez. Clicchiamo su Gene:

Page 32: Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

Esempio: BAX (8)Esempio: BAX (8)Esempio: BAX (8)Esempio: BAX (8)

• Verrà visualizzata una pagina con informazioni dettagliate sul gene:

Nome del Nome del gene e gene e specie di specie di appartenenappartenenzaza

InformazionInformazioni varie sul i varie sul gene, gene, tassonomia, tassonomia, tipo, breve tipo, breve descrizionedescrizione

Accession Number della entry di Gene

Page 33: Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

Esempio: BAX (9)Esempio: BAX (9)Esempio: BAX (9)Esempio: BAX (9)

• Scorrendo la pagina si trovano le informazioni strutturali:

Accession number Accession number della sequenza del della sequenza del

genegene

Struttura delle Struttura delle isoforme del gene isoforme del gene (in blu la regione (in blu la regione non tradotta, in non tradotta, in rosso la regione rosso la regione codificante)codificante)

Accession Accession numbers numbers dei dei rispettivi rispettivi geni geni (GenBank)(GenBank)

Accession Accession number delle number delle rispettive rispettive proteine proteine (GenPept)(GenPept)

Page 34: Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

Esempio: BAX (10)Esempio: BAX (10)

• Informazioni sulla localizzazione genomica

CromosomaCromosomaCoordinate posizionaliCoordinate posizionaliBAX e suo BAX e suo orientamentoorientamento

Geni limitrofi e relativo Geni limitrofi e relativo orientamentoorientamento

Page 35: Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

Esempio: BAX (11)Esempio: BAX (11)Esempio: BAX (11)Esempio: BAX (11)

• In fondo alla pagina troviamo ulteriori inf. :

Informazioni generali Informazioni generali sulla funzione e sui sulla funzione e sui processi biologici processi biologici interessati.interessati.

Omologhi del gene in Omologhi del gene in altre speciealtre specie

Fenotipo (modo in cui Fenotipo (modo in cui si manifesta la funzione si manifesta la funzione della proteina della proteina codificata)codificata)

Pathways: cascate di Pathways: cascate di reazioni all’interno reazioni all’interno delle quali è coinvolta delle quali è coinvolta la proteina codificatala proteina codificata

Varianti del geneVarianti del geneSequenze correlateSequenze correlate

Page 36: Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.

La Gene TableLa Gene Table

• E’ possibile scegliere dalla tendina in alto a sinistra, di visualizzare la Gene Table:

• La Gene Table mostra i confini di esoni ed introni del gene: