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Citometria a flusso per l’analisi della ploidia e delle dimensioni del genoma nelle piante e in altri organismi

Introduzione:Fin dagli inizi, la citometria a flusso è stata sviluppata per la misurazione delle variazioni nella quantità di materiale genetico contenuto nelle cellule displastiche. Questa tecnologia si conferma come metodo di riferimento nella biologia vegetale per valutare le dimensioni del genoma e il livello di ploidia.

Principio del metodo:I nuclei cellulari vengono rimossi meccanicamente da un frammento di tessuto di dimensioni pari a circa 1 cm2 (o 20 mg) in presenza di un tampone di estrazione. A filtrazione avvenuta, i nuclei cellulari vengono colorati con soluzioni CyStain® di Sysmex Partec, contenenti ioduro di propidio (PI) o 4’,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (figura 1). Questa preparazione viene quindi analizzata mediante un citome-tro a flusso CyFlow®, equipaggiato con una o più sorgenti di eccitazione nel verde (PI), nel blu (PI), nell’ultravioletto (DAPI), ecc.

SYSMEX | OTTOBRE 2014

WHITE PAPER CITOMETRIA

Figura 1: Preparazione del campione vegetale per l’analisi della ploidia.

Filtro Celltrics®

Tampone di lisi + colorante (reagenti CyStain®) + campione vegetale

Filtrazione dei residui

Analisi della ploidia mediante citometria

a flusso

Rilascio dei nuclei mediante frantumazione

o macinazione

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Sospensione dei nuclei:La fase di filtrazione rimuove i residui di tessuto permettendo il rilascio dei nuclei. Tuttavia, i frammenti di piccole dimensioni non eliminati durante la fase di filtrazione quali cloroplasti, mitocondri e composti fenolici solubili, oltre a DNasi e RNasi, ecc., possono compromettere la qualità delle analisi.

L’aggiunta di agenti antiossidanti (bisolfiti, 2-mercaptoe-tanolo), leganti del tannino (PVP), lisanti di cloroplasti (Triton) e di RNA (RNasi), come anche la preparazione in ghiaccio, possono correggere le interferenze dovute ai contaminanti.

Utilizzo di un riferimento interno:Si raccomanda in taluni casi di utilizzare un materiale di riferimento composto da nuclei di una specie il cui genoma sia di dimensioni simili a quello del campione sottoposto ad analisi. Questo materiale di riferimento viene preparato contemporaneamente al campione, in modo tale che le variabili sperimentali producano gli stessi effetti sulle due specie. La posizione relativa dei picchi tra il materiale di riferimento e il campione permette di misurare con precisione quest’ultimo in determinate condizioni, essendo note le caratteristiche del DNA del campione di riferimento interno in picogrammi (pg) o in coppie di basi (bp) e sapendo che:

Contenuto di DNA (coppie di basi) = 0,978 109 x contenuto di DNA (pg)

Il ciclo cellulare:In condizioni fisiologiche, le cellule presentano un profilo di DNA corrispondente ad un ciclo cellulare con diverse fasi (figure 2 e 3):

Figura 2: Ciclo cellulare. Legenda: Fase G0 = riposo, fase G1 = primo intervallo, fase S = sintesi, fase G2 = secondo intervallo e fase M = mitosi.

Con

tenu

to d

i DN

A

Figura 3: Analisi in citometria a flusso del ciclo cellulare.

File: 2053 CHO26.01.93 15:20:27Conta totale: 20 000

1 200 Conta

1 000

800

600

400

200

00 50 100 150 200 250 300 350 400 450 FL 1500 partec

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Valutazione del grado di endoreduplicazione: L’esempio dell’analisi di pomodoro (Lycopersicum esculentum) riportato sopra (figura 4) dimostra il fenomeno dell’endore-duplicazione corrispondente ad una replicazione del DNA, come la mitosi, ma senza divisione del nucleo o della cellula stessa. I picchi di endoreduplicazione si sovrappongono ai picchi del ciclo cellulare classico:

2C 4C 8C 16C

È anche possibile visualizzare un picco artefatto «2C + 4C» dovuto all’analisi simultanea dei nuclei maggiormente rappresentati (figure 5 e 6).

Analisi mediante citometria a flusso:La citometria permette di confrontare in un singolo grafico a doppia entrata (dot plot) i parametri di granularità cellulare «SSC» e di contenuto di fluorescenza «DAPI o PI».

Su questo grafico è quindi possibile individuare un’area (gate «Nuclei») contenente la popolazione di interesse, escludendo i residui cellulari (debris) eventualmente non eliminati durante la fase di filtrazione (figure 4A e 4B).

Figura 4: Analisi della ploidia di un campione di pomodoro (Lycopersicum esculentum); 4A citogramma che indica la granularità (SSC) rispetto alla fluorescenza emessa da PI. Il gate «Nuclei» è identificato nella figura 4A e viene applicato all’istogramma della fluorescenza emessa da PI (4B) in cui sono visibili i picchi della ploidia.

A) B)

1 10 100 1000

SSC

1000

100

10

1

FL P

I log

Con

ta

Gate: Nuclei

Nuclei

1500

1200

900

600

300

0 1 10 100 1000FL PI log

Figura 5: Analisi della ploidia di un campione di pomodoro (Lycopersicum esculentum) in cui si evidenziano i picchi di endoreduplicazione.

Istogramma nuclei di Pomodoro in gate «Nuclei»

Con

ta

ioduro di propidio log

Regione Gate % nel gate Conta Media-x CV-x %

2C Nuclei 54,49 18 367 10,80 4,17

4C Nuclei 26,64 9 648 21,23 3,76

8C Nuclei 4,32 1 460 41,58 3,72

16C Nuclei 0,74 260 78,68 3,87

2C + 4C Nuclei 1,95 649 30,40 5,55

Figura 6: Statistica delle diverse regioni corrispondenti ai picchi osservati.

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Dimensioni del genoma:La quantificazione del DNA mediante citometria a flusso con utilizzo di materiale di riferimento interno prevede l’impiego di una colorazione tramite un intercalante del DNA (senza affinità per basi specifiche), al fine di quantifi-care le dimensioni del genoma con la massima precisione possibile. Questi intercalanti sono generalmente lo ioduro di propidio o l’etidio bromuro (nell’esempio riportato di seguito: RNasi e ioduro di propidio, figura 7).

Misurazione del rapporto AT/GC:Il principio si basa sull’utilizzo di un intercalante del DNA (PI) rispetto ad un fluorocromo specifico per ripetizione di basi, ad es. 5 x AT per Hoechst 33342 e 3 x GC per la mitramicina.

Misurazione del rapporto AT/GC RIP = Intensità del test/intensità del riferimento Misurato con ioduro di propidio

oppure RHO = Intensità del test/intensità del riferimento Misurato con Hoechst 33342

oppure RCA = Intensità del test/intensità del riferimento Misurato con cromomicina A3

% AT test = % AT riferimento x (RHO/RIP)1/5 e % GC test = % GC riferimento x (RCA/RIP)1/3

In sede di verifica, % AT test + % GC test, il risultato deve essere 100 %.

Apomissia e aneuploidia:L’apomissia è la sostituzione della normale riproduzione sessuata con una forma di riproduzione asessuata che comporta la produzione di semi in assenza di fecondazione. Le piante apomittiche mantengono generalmente una perfetta identità nel passaggio generazionale.

I picchi generati dalla citometria a flusso grazie alle cellule dell’embrione e dell’endosperma dei semi specificano l’esistenza o meno di apomissia, nonché il tipo di apomissia (figura 8).

Le regioni PK1 e PK2 corrispondono rispettivamente ai picchi 2C e 4C dell’aglio (Allium sativum) utilizzato come riferimento (2C = 34,80 pg). La regione PK3 dell’equiseto (Equisetum sp.) permette di calcolare il contenuto di DNA come segue: indice di DNA = PK3/PK1 = 123,97/49,50 = 2,50; pertanto 2C di Equisetum sp. risulta essere 2,50 x 34,80 = 87,15 pg.

Regione Conta % nel gate GMn-x Media-x CV-x %

PK1 500 25,00 49,50 49,59 6,03

PK2 251 12,55 99,60 99,73 5,11

PK3 534 26,70 123,97 124,11 4,74

Figura 7: Analisi del contenuto di DNA in un campione di equiseto (Equisetum sp.) con utilizzo di frammenti di aglio (Allium sativum) come riferimento con un contenuto di DNA noto.

coun

ts

0 100 200 300 400 500I FL1 stain

100

80

60

40

20

0

Con

te

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In caso di aneuploidia, la posizione dei picchi viene alterata e si mostrerà come nell’esempio riportato di seguito: germogli di colza (Brassica napus) con numero di cromosomi n = 16 e n = 19 e conseguente creazione di doppi picchi.

Figura 8: Studio dei metodi di riproduzione in base alla posizione dei picchi negli istogrammi di fluorescenza mediante citometria a flusso (Matzk & al. 2000).

Profili sessuali Profili apomittici

2 x Embrione

Con

taC

onta

Con

taC

onta

Con

taC

onta

3 x Embrione

3 x Endosperma

4 x Endosperma

3 x Embrione

3 x Embrione

4 x Embrione

4 x Embrione

8 x Endosperma

10 x Endosperma

12 x Endosperma

12 x Endosperma

Figura 9: Analisi della ploidia di un campione di colza (Brassica napus) da cui si evidenzia un profilo di aneuploidia con sdoppiamento dei picchi 2C e 4C.

0 100 200 300 400 500Fluorescenza relativa al DNA

250

200

150

100

50

0

Con

ta

[1] Bennert W, Lubienski M, Körner S. & Steinberg M. (2005): Triploidy in Equisetum subgenus Hippochaete (Equisetaceae, Pteridophyta) Annals of Botany 95: 807 – 815.

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Bibliografia

WP ploidy rev.002 · October 2014

Ringraziamenti:Desideriamo ringraziare Mickaël Bourge (Piattaforma di Citometria CNRS – FRC3115 – IMAGIF 91 118 Gif-sur- Yvette) per la consulenza fornita.

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