Valutazione dell’effetto antitumorale del qualità , pianta tipica del .... Occhionero_0.pdf ·...

Valutazione dell’effetto antitumorale del Prunus Spinosa qualitàTrigno, pianta tipica del territorio Molisano, attraverso lo studio delle

sue proprietà antiproliferative

Prodotti naturali e superamento della

farmacoresistenza

Terapie combinateantitumorali

ATTIVITA’ DI RICERCA DEL REPARTO “METODI

ULTRASTRUTTURALI PER TERAPIE INNOVATIVE ANTITUMORALI”

Nanotecnologie applicate

alle sostanze naturali

Prunus spinosa

Nella tradizione popolare, questa pianta era utilizzata come“medicamento domestico” per alleviare lievi disturbi della vitaquotidiana. I fumatori di pipa mescolavano le sue foglieessiccate con il tabacco.Il Prugnolo presenta, invece, proprietà medicamentose moltointeressanti.

Prunus spinosa

Etimologia: Il nome del genere dal greco "prúnon" = il frutto delprugno, l'epiteto specifico dal latino "spinosus" = provvisto di spine.

Descrizione: arbusto cespuglioso che occasionalmente assume dimensioni dialberello, è legnoso, perenne, caducifoglio con chioma assai rada e irregolare;molto spinoso i rami di colore brunastro con sfumature più o meno scure erugosi, le spine altro non sono che i rami laterali trasformati. Il prugnolo formamoltissimi germogli capaci di radicare che ne facilitano la moltiplicazionevegetativa.

Il prunus spinosa è diffuso in tutto il territorio italiano. In Molise, dove èparticolarmente presente, viene chiamato Trigno, da cui prende il nome il fiumelocale.

Nei fiori essiccati sono presenti: glicosidi dell'acido cianidrico (amigdalina) etracce di acido cianidrico nei fiori freschi; glicosidi della quercetina e delkempferolo (tra cui quercitrina, rutina, iperoside); flavonoidi ad azioneantiflogistica (kaempferol-3,7diramnoside); derivati flavonici ad azioneantiasmatica tra i quali il kaempferolo; canferolo, glucoside ad azione diuretica;composti cumarinici; nitrilglicosidi; lactoni; benzaldeide; prunasoside; sostanzetanniche; oli essenziali; resina; gomma e sali organici.

Epoca di raccolta: febbraio-aprile

Prunus spinosa

Componenti e principi attivi

Prunus spinosa


Nelle foglie sono presenti: Flavonoidi: kaempferol-3,7-diramnoside (azioneantiinfiammatoria), cumarine, nitriglicosidi, benzaldeide, prunasoside,amigdalina (meno dei fiori).

Epoca di raccolta: maggio - settembre

Prunus spinosa


Nei frutti o drupe sono presenti: composti fenolici, peonidol-3-glucoside,peonidol-3-rutinoside, glicosidi del quercetolo, acido caeil-3'-chinico; lapunicianina, un diglucoside che per idrolisi da glucosio e ramnosi;sostanza fluorescente affine all'esculina dell'Ippocastagno flobafene; acidiorganici, (acido malico circa 3%); zuccheri, fruttosio; aminoacidi, pectine epolisaccaiidi pectici; sostanza colorante, un pigmento rosso, tannini evitamina C.

Epoca di raccolta: settembre- ottobre

I V C O NG R E SS O I NT E R NAZIO NA LE D I M E D I CINA B I O I NTEG RATA

Sv i l uppo d e l l e a t t i t ud i n i v e r s o l a r e a l i zzaz i on e d i s é SIMeB

Società Italiana di Medicina Biointegrata

Phytotherapeutic Goals

Use phytotherapeuticagents that mimic coactivators and communicate with cell receptors.

4500 composti noti

Presenti in molti tessutiSpesso accumulati nei vacuoli

FLAVONOIDI

3 molecole di malonil-CoA vengonocondensate in sequenza con 1 molecoladi p-cumaril-CoA

CALCONE SINTASI

Meccanismo simile a quello che avvieneper la sintesi di acidi grassi

dai diidroflavonoli si formano antocianine e tannini

sono presenti solo nelle leguminose (enzima Isoflavanone Sintasi) FITOESTROGENI

BIOSINTESI

FLAVONOIDI: SEI CLASSI PRINCIPALI

Antocianidine (antocianine = glicosidi delle antocianidine)

Flavonoli

Isoflavoni

Flavani (catechine= 3 ossi flavani)

Flavoni

Flavanoni

Calconi AuroniProantocianidine (tannini condensati)

Interazione pianta-animaleSegnali visivi che attraggono gli insetti impollinatori

Si accumulano nei vacuoli

Responsabili dei colori rosso, rosa, viola e blu

Antocianidine

Tossine: legame con proteine intestinali

(n = 1- 30)

Flavonoidi complessi

Particolarmente abbondanti nei frutti non maturi (difesa)

n

Tannini idrolizzabili

(proantocianidine)

Deterrenti alimentari (sapore amaro)

Hanno la capacità di complessare carboidrati e proteine

epicatechina

quercetina

Le caratteristiche strutturali fondamentali per l’atività di radical scavenging sono:

Il gruppo OH in posizione 3 sull’anello insaturo centrale

Il doppio legame in posizione 2,3 con un grupppo OH in 3 e un gruppo C=O in 4

Una struttura o-diidrossi sull’anello B

1

A B

C

H

2

3

4

QUERCETINA

Riduzione dell’incidenza della malattia coronarica

Utilizzati nella cura dell’insufficienza venosa cronica

Utilizzati nella prevenzione della fragilità capillare

• Riduzione dei fenomeni infiammatori: inibizione di enzimi coinvolti nella sintesi di prostaglandine

• Protezione dai radicali liberi

• Prevenzione dell’aggregazione piastrinica

• Attivazione del sistema del complemento

• Alta affinità per le proteine ricche in prolina (riduzione della loro degradazione nell’endotelio)

uso farmacologico

La quercetina e’ un flavonoide ubiquitario nei vegetali

Causa arresto della proliferazione di cellule tumorali

Le cellule si arrestano in G1

L’arresto della crescita sembra essere dovuto ad apoptosi (si osserva rilascio di citocromo c

nel citoplasma)

H1299 e A549 sono due linee cellulari derivate da tumori del polmone




Cytotoxicity, apoptosis induction, and mitotic arrest by a novel podophyllotoxin glucoside, 4DPG, in tumor cells.Qi YL1, Liao F, Zhao CQ, Lin YD, Zuo MX.Author informationAbstractAIM: To define the in vitro cytotoxic activities of 4-demethyl-picropodophyllotoxin 7'-O-beta-D-glucopyranoside (4DPG), a new podophyllotoxin glucoside.METHODS: Antiproliferation activity was measured in several tumor cell lines by using the microculture tetrazolium MTT assays. Cell cycledistribution was analyzed using flow cytometry and mitosis index assays. Furthermore, transmission electron microscopy, TUNEL, DNA agarose electrophoresis, and activated caspase-3 were used to analyze the induction of apoptotic cell death. Moreover, intracellular changes in the cytoskeleton were detected using immunocytochemistry.RESULTS: 4DPG effectively inhibited the proliferation of cancer cells (HeLa, CNE, SH-SY5Y, and K562 cell lines). For the K562 cell line, the antiproliferation effect of 4DPG was much more potent than that of etoposide (IC50 value: 7.79 x 10(-9) mol/L for 4DPG vs 2.23 x 10(-5) mol/L for etoposide). Further, 4DPG blocked the cell cycle in the mitotic phase. The induction of apoptosis and elevated levels of activated caspase-3 were confirmed in cells treated with 4DPG. The microtubule skeleton of HeLa cells was disrupted immediately after treatment with 4DPG.CONCLUSION: The cytotoxicity of 4DPG is due to its inhibition of the microtubule assembly of cancer cells at a low concentration, thus inducing apoptosis. These properties qualify 4DPG to be a potential antitumor drug

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Qi YL[Author]&cauthor=true&cauthor_uid=16038635http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Liao F[Author]&cauthor=true&cauthor_uid=16038635http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zhao CQ[Author]&cauthor=true&cauthor_uid=16038635http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lin YD[Author]&cauthor=true&cauthor_uid=16038635http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zuo MX[Author]&cauthor=true&cauthor_uid=16038635http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16038635




Anti-proliferative of physcion 8-O-β-glucopyranoside Houtt. on A549 cell lines via inducing apoptosis and cell cycle arrestQi-Chao Xie, Yu-Peng Yang

http://link.springer.com/search?facet-author="Qi-Chao+Xie"http://link.springer.com/search?facet-author="Yu-Peng+Yang"

PERCORSODAL TANTO GRANDE ALL’ INFINITESIMAMENTE PICCOLO

estratto vegetale ottenuto da drupe di Prunus sp. qualità Trigno

cellule

Prunus spinosa

Microscopia SEM

Microscopia TEM

Linee cellulari utilizzate

TUMORALI UMANE

HCT116: cellule del carcinoma del colon retto, positive per TGF (transforming growth factor) beta1 e 2

SW480: cellule di adenocarcinoma del colon, mutazione ed sovrespressione di p53, positive per c-myc ,myb, K-ras e fos

A549: cellule di adenocarcinoma broncoalveolare

HeLa: cellule della cervice uterina

NORMALI

IEC6: cellule epiteliali intestinali di ratto

FIBROBLASTI umani

A caratteristiche funzionali diverse corrispondono caratteristiche morfologiche diverse

SW480 HCT116

HeLa A549

10 μn

TEST DI CITOTOSSICITA’ UTILIZZATI PER I

MODELLI IN VITRO

MTT Test = valutazione dell’attività

dell’enzima mitocondriale succinato

deidrogenasi.

Test di citotossicità mediante la capacita’ replicativa cellulare a

formare colonie macroscopiche(maggiore di 50 cellule).

Tutte le linee cellulari analizzate, sono state seminate in opportunaconcentrazione, fatte aderire al substrato per 24h nel loro terreno;

Il terreno di crescita è stato sostituito con CAN ( complesso attivatorenutraceutico), miscela complessa di aminoacidi, vitamine e sali minerali inproporzione idonea;

Le cellule in fase logaritmica di crescita, sono state trattate con ilfitocomplesso Prunus spinosa qualità Trigno (PsT) a concentrazionidiverse, diluito nel CAN;

L’estratto consiste in una soluzione idroalcolica con concentrazione delfitocomplesso pari a 86 mg/ml (P86); il fitocomplesso è stato utilizzato talquale o diluito progressivamente con CAN.

CAN = Complesso attivatore nutraceutico

Valutazione dell’effetto sulla sopravvivenza

cellulare del Prunus sp. qual. trigno (PsT) + CAN su cellule di carcinoma del colon -retto, HCT116, mediante il saggio colorimetrico MTT, dopo 24 ore di trattamento.

Utilizzando il mezzo crescita diverso dal CAN , tampone fosfato e soluzione fisiologica, si ha un recupero della sopravvivenza cellulare dopo trattamento con P50 mg/ml e P10 mg/ml rispetto al trattamento PsT + CAN.

MTT TEST

-40%

-70%

Effetto sulla sopravvivenza cellulare del Prunus sp. qual. trigno + CAN sulle cellule di adenocarcinoma del colon SW480, mediante il saggio colorimetrico MTT, dopo 24 ore di trattamento.

Utilizzando il mezzo crescita: tampone fosfato e soluzione fisiologica, si ha un aumento della sopravvivenza cellulare dopo trattamento con P50 mg/ml e P10 mg/ml rispetto al trattamento del fitocomplesso + CAN.


-70%


cellulare del Prunus sp. qual. Trigno su cellule di adenocarcinoma broncoalveolare umano A549, mediante il saggio colorimetrico MTT dopo 24 ore.

Utilizzando come mezzo crescita, tampone fosfato e soluzione fisiologica, si ha un recupero della sopravvivenza cellulare dopo trattamento con P50 mg/ml e P10 mg/ml rispetto ai trattamenti combinati PsT + CAN.


-65%

Valutazione dell’effetto sulla

sopravvivenza cellulare del Prunus sp. qual. trigno su cellule tumorali della cervice uterina HeLa, mediante il saggio colorimetrico MTT dopo 24 ore.

Utilizzando il mezzo crescita, tampone fosfato e soluzione fisiologica, si ha un recupero della sopravvivenza cellulare dopo trattamento con P50 mg/ml e P10 mg/ml.


-60%


cellulare del Prunus sp. qual. Trigno + CAN su cellule epiteliali intestinali di ratto e su

fibroblasti umani. Dopo 24 ore di trattamento non è stata osservata una

significativa riduzione della sopravvivenza cellulare rispetto al solo CAN.


TEST PER LA VALUTAZIONE DELLA SOPRAVVIVENZA CELLULARE (danno alla membrana cellulare - Trypan Blue Test)

HCT116HCT116

SW480

Curve di sopravvivenza della linea cellulare tumorale HCT116 e SW480. Alla

concentrazione critica pari a P4 mg/ml di Prunus sp. qual. Trigno + CAN si

osserva un rapido cambiamento nella pendenza della curva che determina una diminuzione del numero di cellule vitali.


Sorprendentemente, le due linee cellulari di diverso fenotipo e con mutazioni

diverse, rispondono nello stesso modo al trattamento.

CLONING EFFICIENCY TEST

HCT116

P 2 mg/ml P 4,5 mg/ml P 10 mg/mlCTR

P 2 mg/ml P 4,5 mg/ml P 10 mg/mlCTR

24h di trattamento con Prunus sp. + CAN

SW480

P 4 mg/ml P 4,5 mg/ml P 5 mg/ml P 10 mg/ml

P 0,1 mg/ml P 0,5 mg/ml P 1 mg/ml P 2 mg/ml

CTR

Sts 1 µM (induttore di apoptosi)

cellule del carcinoma del colon – retto

24h di trattamento Prunus sp. + CAN

MICROSCOPIO OTTICO A CONTRASTO DI FASE

MICROSCOPIO OTTICO A CONTRASTO DI FASE

cellule di adenocarcinoma del colon

24h di trattamento Prunus sp. + CAN

CTR Sts 1 mM

P 4 mg/ml

P 0,1 mg/ml P 0,5 mg/ml P 1 mg/ml P 2 mg/ml

P 4,5 mg/ml P 5 mg/ml P 10 mg/ml

CONCLUSIONI Diversi test di citotossicità dimostrano che l’associazione dell’estratto delPrunus spinosa qualità Trigno (PsT) con il CAN, complesso attivatorenutraceutico a base di aminoacidi, vitamine e sali minerali, induce unasignificativa riduzione dose - dipendente della sopravvivenza cellulare indiversi istotipi tumorali.

Questo effetto è stato ulteriormente confermato dalle osservazionimicroscopiche che hanno mostrato modificazioni morfologiche evidenti inseguito ai trattamenti con PsT + CAN.

Prove tossicologiche condotte su linee cellulari normali hanno escluso latossicità del PsT, del CAN e delle loro miscele.

Nell’insieme, i dati funzionali e morfologici suggeriscono un promettenteimpiego dell’estratto del Prunus spinosa qualità Trigno in futuri protocolliterapeutici di medicina biointegrata.

La collaborazione attualmente in corso tra ISS e Biogroup Srl,avente come principale obiettivo l’individuazione di protocolli dimedicina bio-integrata che uniscano i chemioterapici confitoterapici o sostanze naturali, ha portato ad una convenzionescientifica e, come recente risultato, al deposito in data 01/04/2015del brevetto numero RM2015A000133 dal titolo:

“Trigno M” preparato naturale ad azione antitumorale

Valutazione dell’effetto antitumorale del qualità , pianta tipica del .... Occhionero_0.pdf ·...

Documents

Transcript of Valutazione dell’effetto antitumorale del qualità , pianta tipica del .... Occhionero_0.pdf ·...