ALLERGIE ALIMENTARI: STIMOLARE LA RICERCA PER TUTELARE IL CONSUMATORE

Torino, 9 Novembre 2012

Valutazione della tossicità delle proteine del glutine di Triticum monococcum nei pazienti celiaci

Maria Mazza, BSc

S.C. Neuroscienze - CEAS.S. Genetica e Immunobiochimica

Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta

LA CELIACHIA

La malattia celiaca è una malattia infiammatoria cronica immuno-mediata

Ingestione del glutine presente nelle farine di grano, orzo e segale

Può manifestarsi a qualsiasi età con ampio spettro di manifestazioni cliniche

Esistono diverse forme cliniche:

•forma tipica o classica;

•forma atipica;

•forma silente;

•forma latente

Forma tipica o classica

• Esordio della malattia nei primi mesi di vita (6°-15°mese)• Quadro clinico: diarrea cronica, inappetenza, rallentamento della crescita, perdita di

peso, ipotonia muscolare, irritabilità. Alterazioni della mucosa intestinale.

Forma atipica

• Sintomatologia extra-intestinale • Manifestazioni cliniche secondarie al malassorbimento: anemia, bassa statura, rachitismo, displasia dello smalto dentario, dolori addominali ricorrenti, ritardo puberale, aftosi

recidivante, stipsi, ipertransaminasemia idiopatica, sindromi emorragiche, alopecia.

Forma silente

• Presenza delle tipiche lesioni istologiche della mucosa intestinale• Forma apparentemente asintomatica

Forma latente

•Soggetti asintomatici con mucosa intestinale normale ma con marcatori anticorpali positivi.

ComplicanzeNel caso di diagnosi tardiva o per mancato trattamento possono presentarsi

diversi problemi piuttosto gravi a carico di diversi apparati, quali:

• gastroenterico (linfoma)

• osteoscheletrico (osteoporosi, osteomalacia)

• genitale femminile (infertilità, poliabortività)

DiagnosiMarkers sierologici:• ricerca di anticorpi anti-gliadina (AGA)

• ricerca di anticorpi anti-endomisio (IgA-EMA)

• ricerca di anticorpi anti-transglutaminasi tessutale (IgA-tTG)

Biopsia intestino tenue

Diagnosi definitiva

cripte

villi

cripte

Assenza villiSoggetto sano Soggetto celiaco

Esame istologico

Totale o parziale atrofia dei villi con perdita dell’orletto a spazzola;ipertrofia delle cripte; aumentato numero dei IEL;

infiltrazione nella lamina propria di cellule infiammatorie .

Epidemiologia della celiachia

La malattia celiaca coinvolge tra lo 0.5% e l’ 1% della popolazione mondiale.Patologia ancora sottodiagnosticata

Modello ad iceberg della celiachia

diagnosticato

non diagnosticato

La spiga di grano barrata compare sulla confezione degli alimenti e bevande privi di prolamine tossiche (≤ 20ppm).

GLUTEN FREE DIET

NOFrumento, Orzo, Segale, Avena, Farro, Kamut, Spelta, Triticale.pane, pasta, prodotti da forno, birra,alimenti “lavorati” (gelati, salumi)

SIAmaranto, grano saraceno,

riso,mais, miglio, sesamo, sorgo tapioca,castagna patata, legumi,

latte, uova, formaggi,prodotti da forno preparati con proteine alternative a quelle del

glutine

Basi genetiche della celiachiaAssociazione con alcune varianti del complesso HLA

(Human Leucocyte Antigen)La predisposizione alla celiachia si correla con la presenza degli alleli

DQA1*05 e DQB1*02

HLA-DQ2

catena αDQA1*05

catena βDQB1*02

HLA-DQ8

catena αDQA1*03

catena βDQB1*0302

~ 90% celiaci ~ 6% celiaci

DQA1*05 e DQB1*02 sono alleli comuni nella popolazione sana , quindi la presenza dellemolecole HLA-DQ2 o DQ8 rappresenta una condizione necessaria ma non sufficiente.

Probabile coinvolgimento di altri geni e/o altri fattori.

APC

Eziologia

Prolamine:ricche di prolina e glutamina

Gliadine: frazione alcool-solubile coinvolta nella patogenesi della celiachia

Glutenine: frazione idro-solubile poco coinvolta nella tossicità

Glutenine - elasticitàGliadine - estensibilità

Gliadine

Caratteristiche principali� monomeriche � solubili in alcool (etanolo)� distinte in tre famiglie (ω, γ e α/β)� p.m. compreso tra 28 e 70 kDa

A-PAGE

ω

γ

α/β

1 2 3 4

Costituiscono il 40% delle proteine di riserva della cariosside

Glutenine

Caratteristiche principali� polimeriche, HMW (80-130 kDa) e LMW

(10-70 kDa)� idro-solubili � distinte in 4 gruppi:A (HMW);

D, B e C (LMW)

A

D

B

C

SDS-PAGE

1 2 3 4 5

HM

WLM

W

Prolamine

Glutenine

GliadineProlamine (ricche di prolina e glutamina)

epitelio int. celiaco

Proteasi

2-5 kDa

Azione tossica

Zonulina

Patogenesi della malattia celiaca

Attività citotossica Sistema immunitario innato

Patogenesi della malattia celiaca Attività immunogenica Sistema immunitario adattativo

PNAS October 14, 2003 vol. 100 no. 21

Il numero di peptidi che interagiscono con i recettori HLA-DQ2 o HLA-DQ8 nella mucosa intestinale e l’intensità della risposta delle cellule T indotta da ciascun peptide prolaminico determinano unasoglia che deve essere superata affinchè in un individuo geneticamente predisposto alla celiachia si abbia una reazione immunitaria patologica verso le proteine del glutine.

The HLA-DQ2 gene dose effect in celiac disease is directly related to the magnitude and breadth of gluten-specific T cell responses

Willemijn Vader†, Dariusz Stepniak†, Yvonne Kooy†, Luisa Mearin‡, Allan Thompson†, Jon J. van Rood†, Liesbeth Spaenij†, and Frits Koning†§

Soglia patologica

Utilizzo di colture in vitro per studiare gli effetti dell’esposizione alle prolamine

e i meccanismi cellulari e molecolari della celiachia

Test in vitro

AgglutinazioneMinimal

AgglutinationConcentration

Cellule K562(S) (mieloma leucemico umano)

Cellule Caco2(adenocarcinoma umano)

Crescita epiteliale similealla mucosa in testinale

Riduzione

resistenza

elettrica

transepiteliale

Attivazione apoptosi

IMMUNITA’ INNATA

Test in vitro

IMMUNITA’ ADATTATIVA

Linfociti T prelevati dalla mucosa di pazienti celiaci

• Proliferazione cellulare• Secrezione INF-γ

Peptidi tossici

Esistono numerose sequenze peptidiche coinvolte nei processi di tossici

� Peptide 13-mer LGQQQPFPPQQPY (31-43 α-gliadina o A-gliadina), molto

attivo nell’indurre lesioni della mucosa intestinale e apoptosi dell’enterocita

(peptide citotossico). Questo peptide o la sua variante PGQQQPFPPQQPY è

presente in molte delle sequenze α-gliadine

� Peptide 33-mer LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF

presente nel grano tenero e contiene tre epitopi immunodominanti lunghi 11, 12 o

13 aa noti come DQ2-a-I (LQPFPQPQLPY), DQ2-a-II (PQPQLPYPQPQL) e

DQ2-a-III (QLPYPQPQLPYPQ) che reagiscono fortemente con i linfociti T

intestinali di tutti i pazienti celiaci (peptide immunogenico).

Peptide protettivo

Peptide 10-mer QQPQDAVQPF (~1,2 kDa), isolato tra i peptidi

prolaminici della varietà di grano duro Adamello, previene

l’agglutinazione delle cellule K562 (S) causata dalle prolamine di grano

tenero, grano spelta e di alcune accessioni di farro.

Azione protettiva legata: 1. alla presenza di acido aspartico (D) in pos. 5;

2. alla presenza dell’alanina (A) in posizione 6.

I residui di aspartato e alanina competono per il legame con le APC e

blocco della risposta immunitaria.

Triticum monococcum

E’ un frumento diploide a cariosside vestita con genoma AA (2n=14).

Rappresenta una varietà antica di frumento coltivata attualmente su poche centinaia di ettari in aree remote della regione mediterranea.

Caratteristiche peculiari di questa varietà sono:

1. grande resistenza a stress ambientali e a vari patogeni;

2. elevato valore nutrizionale (maggiore contenuto in proteine, carotenoidi, vitamina E, lipidi, zinco e ferro);

3. migliore tollerabilità alimentare delle prolamine

Ricerca Corrente IZS PLV 14/10

Obiettivi� Valutare la presenza ed il numero di peptidi tossici in alcune varietà di grano monococco attraverso studi immunobiochimici e test di tossicità in vitro.

� Selezionare linee di monococco tollerate dai celiaci ma soprattutto di ridurre l’esposizione della popolazione umana alle proteine tossiche del glutine

Unità Operative coinvolte

1. S.S. Genetica e Immunobiochimica (IZSPLV); Dr.ssa M. Mazza;2. CRA-QCE; Dr. Norberto Pogna;3. Ospedale “G. Gaslini” di Genova; Dr. Giovanni Candiano.

Materiali e metodi

Varietà di grano monococco: Stendhal, Monlis e ID331 1.Estrazione e purificazione delle proteine del glutine dalle tre linee di grano monococco.2.Separazione elettroforetica bidimensionale (A-PAGE x SDS-PAGE) delle proteine estratte.3.Identificazione immunologica mediante Western Blot degli epitopiprolaminici immunodominanti.4.Identificazione mediante spettrometria di massa degli spot proteici immunodominanti. 5.Valutazione della tossicità dei pepetidi prolaminici in vitro su cellule K562(S) e linfociti T di mucosa intestinale umana.

Risultati immunobiochimici

�Assenza nelle tre linee di monococco del peptide 13-mer (P31-43) con attività citotossica.

� Presenza di diversi peptidi con sequenza simile al peptide 33-mer con attività immunogenica.

�Assenza del peptide protettivo 10-mer.

�Stendhal e ID331 non risultano tossici verso la mucosa celiaca, eccetto il Monlis che sembra comportarsi come il frumento tenero.

�Citotossicità del Monlis associata a peptidi diversi dal 13-mer.

�Presenza nel monococco di peptidi protettivi diversi dal peptide 10-mer.

Citotossicità

Triticum monococcum

Dal sequenziamento dei geni delle ω-gliadine di monococco, è stata individuata una sequenza codificante un peptide di 9 aa, con sequenza simile a quella ritrovata in grano duro varietà Adamello:

Sebbene siano leggermente diverse, queste sequenze sono accomunate dalla presenza di aa carichi in posizione centrale.

Se questo peptide viene somministrato in combinazione con le prolamine di grano tenero, viene ridotta la produzione di IL-15 (responsabile dell’effetto citotossico sulle cellule della mucosa intestinale).

Adamello

QQPQDAVQPF

Monococco

QQPQRPQPF

Perché alcune linee di monococco non scatenano l’immunità innata?

Dall’analisi elettroforetica A-PAGE delle tre linee si osserva che Monlis è priva di ω-gliadine, Stendhal presenta 4 bande che, in seconda dimensione, si risolvono in

c.ca 13 spot e ID331 presenta una sola banda che si risolve, in seconda dimensione, in un solo spot a basso peso molecolare.

1. Stendhal2. Monlis3. ID 331

Stendhal ID331

Triticum monococcum

I digesti PT-gliadinici delle tre accessioni di monococco sono stati testati sulle cellule K562 e su espianti bioptici del duodeno di pazienti celiaci in remissione:

� I digesti di Monlis hanno lo stesso comportamento dei digesti del grano tenero, sono quindi in grado di agglutinare le cellule K562 e stimolare l’immunitàinnata.

� I digesti di ID331 non agglutinano le cellule K562 e non sono in grado di stimolare l’immunità innata

La proprietà “protettiva” di ID331 è dovuta all’ω-gliadina, assente in Monlis?

Laboratorio Fisiopatologia dell’Uremia

Giovanni Candiano

Ringraziamenti

Unità di Ricerca per la Valorizzazione Qualitativa dei Cereali (QCE) di Roma

Norberto Pogna

SS Genetica e ImmunobiochimicaPier Luigi Acutis Simona Carrella

Grazie a tutti per l’attenzione