UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI PERUGIA

FACOLTA’ DI MEDICINA VETERINARIA

Corso di laurea in IGIENE E QUALITA’ DELLE PRODUZIONI ANIMALI

DIPARTIMENTO DI SCIENZE BIOPATOLOGICHE ED IGIENE DELLE PRODUZIONI

ANIMALI E ALIMENTARI

VET04

CARATTERIZZAZIONE SIEROLOGICA E GENOTIPICA DI SALMONELLA SPP.: APPLICAZIONI NELL’AMBITO DELLE

TOSSINFEZIONI ALIMENTARI

SIEROLOGIC AND GENOTIPIC CHARACTERIZATION OF SALMONELLA SPP.: APPLICATION IN THE FOODBORNE

DISEASE FIELD

Laureanda: Relatore: Roberta Ortenzi Dott.ssa Raffaella Branciari

Correlatore: Dott.ssa Stefania Scuota

Anno Accademico 2006/2007

Ringraziamenti

Desidero ringraziare il Dott. Guido Petracca, Direttore dell’Istituto

Zooprofilattico Sperimentale dell’Umbria e delle Marche; ringrazio

il personale dell’Istituto che mi ha assistito e supportato nello

svolgimento del presente lavoro.

In particolare, il Dott. Telemaco Cenci, Responsabile dell’Area

Sicurezza Alimentare, la Dott.ssa Stefania Scuota, la Sig. Alessia

Zicavo e tutti i colleghi del Laboratorio Contaminanti Biologici.

INDICE

Abstract…………………………………………………………………1

Riassunto ………………………………………………………………2

Introduzione…………………………………………………………….3

Classificazione………………………………………………………….7

Serbatoi animali………………………………………………………12

Salmonella negli alimenti…………………………………………….14

La rete ENTER-NET………………………………………………….17

Protocollo ricerca di Salmonella da alimenti……………………….19

Tipizzazione sierologia……………………………………………….20

Multiplex PCR…………………………………………………………26

Tipizzazione fagica…………………………………………………...28

Tipizzazione biomolecolare mediante PFGE

(Pulsed-Field Gel Electrophoresis)…………………………………30

Episodio di tossinfezione alimentare……………………………….35

Risultati e discussione……………………………………………….38

Conclusioni……………………………………………………………41

Bibliografia…………………………………………………………….43

1

ABSTRACT

This thesis describes the main Salmonella identification and

isolation techniques. Furthermore, through a case of foodborne

disease, the functioning of the ENTER-NET surveillance system is

described. It is made up of a network of microbiology laboratories

coordinated by Regional Reference Centres represented by

hospital laboratories, by Istituti Zooprofilattici Sperimentali (IZS)

and by ARPA.

2

RIASSUNTO

Nella presente tesi vengono descritte le principali tecniche

di isolamento ed identificazione di Salmonella. Inoltre viene

illustrato, attraverso la descrizione di un caso di tossinfezione

alimentare, il funzionamento della rete ENTER-NET. La rete

ENTER-NET è un sistema di sorveglianza costituito da una rete di

laboratori di Microbiologia coordinati da Centri di Riferimento

Regionali rappresentati da laboratori ospedalieri, da Istituti

Zooprofilattici Sperimentali (IZS) e da ARPA.

3

INTRODUZIONE

Già dagli anni settanta il concetto di qualità e sicurezza

sanitaria degli alimenti è stato associato al concetto di sicurezza

microbiologica dell’alimento (Bauman, 1974; WHO, 1995).

Nel 2000, con l’emanazione da parte della Comunità

Europea del “Libro Bianco sulla Sicurezza Alimentare”, sono state

identificate nuove linee strategiche basate sul principio del

controllo dell’intera filiera (from the farm to the fork); alla luce di

questi nuovi indirizzi comunitari, derivanti dal libro Bianco e in

seguito da una serie di Regolamenti comunitari entrati in vigore il

1° gennaio 2006, noti con la denominazione di “Pacchetto Igiene”,

si è accentrata l’attenzione sull’argomento da parte dei singoli

Stati Membri che hanno predisposto interventi finalizzati a

garantire la Sicurezza Alimentare (Libro Bianco, 1999).

Nonostante i progressi soddisfacenti realizzati nel campo

della prevenzione di alcune malattie infettive, le forme morbose

legate all’assunzione di alimenti rappresentano ancora un

problema di Sanità Pubblica, enfatizzato, tra l’altro,

dall’emergenza di “nuovi” patogeni e accentuato dall’uso di

4

tecniche di produzione, manipolazione e distribuzione su larga

scala di prodotti alimentari.

La prima relazione sintetica comunitaria dell’EFSA

(Europaen Food Safety Authority) sull’andamento e sulle fonti

delle zoonosi, è stata pubblicata nel dicembre 2005. Le zoonosi,

ossia le malattie degli animali trasmissibili all’uomo, hanno

interessato oltre 380.000 cittadini dell’UE nel 2004.

La forma umana della malattia viene spesso contratta

attraverso alimenti contaminati. Stando alla relazione, le due

malattie zoonotiche osservate con maggiore frequenza negli

esseri umani sono infezioni da Salmonella e Campylobacter, che

sono comunemente diffusi negli animali e, conseguentemente,

negli alimenti.

In Italia, le malattie a trasmissione alimentare vengono

segnalate nel sistema di notifica obbligatoria delle malattie infettive

coordinato a livello nazionale dal Ministero della Salute. Inoltre, la

sorveglianza di laboratorio di alcune infezioni a prevalente

trasmissione alimentare fa capo al sistema ENTER-NET, inserito

in un network cui partecipano numerosi paesi europei ed extra-

europei. Nel nostro paese tale sistema è costituito da una rete di

5

laboratori di Microbiologia coordinati da Centri di Riferimento

Regionali rappresentati da laboratori ospedalieri, da Istituti

Zooprofilattici Sperimentali (IZS) e da ARPA. Tutta l’attività è

coordinata dall’Istituto Superiore di Sanità.

Le infezioni da Salmonella rappresentano in Italia la

principale causa di epidemie. Infatti, si registrano circa 15.000

casi/anno, che rappresentano un importante problema di sanità

pubblica sia per l’elevata morbosità, sia per il peso economico che

comportano (www.simi.iss.it).

Negli ultimi anni il numero delle Salmonellosi notificate è

andato via via diminuendo; tale diminuzione può essere ascritta

alle migliorate condizioni igieniche di produzione degli alimenti e

alle relative misure di controllo implementate, conseguenti a

recepimenti di Normative Europee nell’ambito dell’Autocontrollo e,

più in generale, del controllo di filiera.

Dopo un’analisi dei dati del sistema ENTER-NET e di quelli

disponibili del Piano triennale alimenti della Regione Umbria, vista

la frequenza degli isolamenti di Salmonella dagli alimenti e dai

pazienti con sintomatologia gastro-enterica e l’incidenza di

Salmonella nelle tossinfezioni alimentari rispetto agli altri patogeni,

6

è stato individuata la possibilità di intervenire, nell’ambito del

Centro di Riferimento regionale per Enterobatteri patogeni, per

collegare le varie fasi dell’indagine epidemiologica procedendo a

rilievi molecolari sui ceppi isolati di origine ambientale, umana ed

alimentare, mediante l’utilizzo della tecnica dell’elettroforesi in

campo pulsato (PFGE).

Scopo del presente lavoro è stato quello di descrivere le

principali tecniche di isolamento ed identificazione di Salmonella e

il funzionamento della rete ENTER-NET, esponendo un caso di

tossinfezione alimentare verificatosi in Umbria.

7

CLASSIFICAZIONE

All’interno del genere Salmonella esiste un gran numero di

sierotipi, distinti sulla base della diversa combinazione degli

antigeni somatici e flagellari e talvolta anche in base ad alcuni

caratteri biochimici (Ewing,1986).

Dai primi isolamenti ad oggi la classificazione del genere

Salmonella è stata più volte rivista. Inizialmente i ceppi di

Salmonella, isolati da diverse forme cliniche o da altre fonti,

venivano considerati come specie distinte. In seguito lo studio

degli antigeni somatici (O) e flagellari (H) iniziato da White e

portato avanti da Kauffmann, portò alla descrizione di un enorme

numero di sierotipi che sostituirono le specie precedentemente

identificate (Editorial, 1992).

Esistono diverse classificazioni fenotipiche del genere

Salmonella; tra queste quelle più conosciute e utilizzate sono

quella di Le Minor per quanto riguarda la suddivisione in

sottospecie e quella di Kauffmann-White, per quanto riguarda la

tipizzazione sierologia.

8

Il genere Salmonella comprende due sole specie: S.

enterica e S. bongori. La specie enterica è a sua volta suddivisa in

sei sottospecie: enterica, salamae, arizonae, diarizonae,

houtenae, indica.

Oggi si conoscono più di 2400 sierotipi della specie

enterica, e il sierotipo non è più considerato come identificativo di

specie; pertanto la nomenclatura non lo riporta più in corsivo;

peraltro i nomi sono mantenuti solamente per i sierotipi

appartenenti a S. enterica subsp. enterica (es S. Typhimurium),

mentre quelli ascrivibili alle altre sottospecie vengono identificati

attraverso le relative formule antigeniche.

L’attuale classificazione che deriva, come già detto, da

quelle di Kauffmann-White e di Le Minor riflette la presente

tassonomia delle Salmonelle ed è soggetta ad aggiornamenti

annuali curati dal WHO Collaborating Centre for Reference and

Research on Salmonella, con cui collaborano vari laboratori di

riferimento internazionali.

9

CLASSIFICAZIONE SECONDO KAUFFMANN-WHITE

Kauffmann nel 1931 presentò lo schema di classificazione

delle Salmonelle, in uso fino ai nostri giorni e universalmente

accettato. In realtà egli riscrisse, ampliandolo, uno schema

precedente elaborato da Schultze, White e Scott. Lo schema si

basa sul fatto che:

– il genere è rappresentato da bastoncelli gram-negativi,

aerobi, non sporigeni, per lo più mobili, che crescono bene sui

comuni terreni colturali, fermentano il glucosio e riducono i nitrati e

non l’indolo, non idrolizzano l’urea, il VP, l’adonite, e non

fermentano il saccarosio; con alcune eccezioni, non fermentano il

lattosio;

– esistono 4 sotto-generi (denominati I, II, III, IV)

differenziabili in base a poche prove biochimiche (Tabella 1);

– i ceppi con la medesima formula antigenica, anche se con

differenze biochimiche (ad esempio, fermentare o meno un certo

zucchero oppure produrre e non produrre H2S) appartengono allo

stesso sierotipo (Kauffmann, 1967).

10

Tabella 1. Test biochimici per la suddivisione del genere Salmonella in quattro sotto-generi Test I II III IV Fermentazione dulcite + + - -Fermentazione lattosio - - + -Fermentazione salicina - - - +Fermentazione malonato - + + -Crescita in terreno KCN - - - +

CLASSIFICAZIONE SECONDO LE MINOR

Le sei sottospecie di S. enterica sono distinguibili in base a

prove biochimiche (Tabella 3) che consentono anche di

differenziare S. enterica da S. bongori. I sierotipi di S. enterica

subsp. enterica sono spesso indicati con un nome che usualmente

è correlato al luogo geografico nel quale il sierotipo è stato per la

prima volta isolato. Il nome viene scritto in lettere romane e la

prima lettera è maiuscola. I sierotipi appartenenti alle altre

sottospecie sono designati dalle loro formule antigeniche, seguite

dal nome della sottospecie (Tabella 2) (Le Minor, 1987).

11

Tabella 2. Classificazione delle Salmonelle Specie Sottospecie Numero sottospecie S. enterica enterica I

salamae II arizonae IIIa diarizonae IIIb houtenae IV indica VI S. bongori V

Tabella 3. Prove biochimiche S. enterica S. bongori Test

I II IIIa IIIb IV VI V Fermentazione dulcite + + - - - +/- + Fermentazione lattosio - - - + - +/- - Fermentazione salicina - - - - + - -Fermentazione sorbitolo + + + + + - -Fermentazione malonato - + + + - - -Fermentazione d(+)tartrato + - - - - - -Crescita in terreno KCN - - - - + - +ONPG - - - + - +/- +

12

SERBATOI ANIMALI

Gli animali fungono da principali serbatoi di mantenimento

della Salmonella. Ogni sierotipo predilige una o più specie animali;

alcuni sono considerati addirittura specifici per una specie animale

(ad es. S. Gallinarum nei polli), altri sono definiti ospite-adattati in

quanto prediligono un ospite, ma possono infettarne anche altri (S.

Dublin per bovini, S. Hadar nei volatili, S. Enteritidis nelle galline

ovaiole); infine alcuni sierotipi, come S. Typhimurium, sono

ubiquitari (Brackelsberg, 1997).

Il ruolo di serbatoio viene svolto da numerose specie

animali da reddito e da compagnia. I bovini sono spesso

colonizzati da S. Dublin e S. Typhimurium, con infezioni di durata

variabile e forme cliniche di vario tipo. S. Dublin può persistere

nell’ospite molto a lungo, in alcuni casi anche tutta la vita,

inducendo per lo più forme gravi di malattia (Allerberger, 2002).

Nelle specie aviarie sono presenti sierotipi specie-specifici,

come S. Gallinarum nel pollo, sierotipi ospite-adattati e ubiquitari.

In Italia i principali sierotipi ospite-adattati nel pollo sono S. Hadar

e S. Enteritidis, mentre nel tacchino si ritrova principalmente S.

13

Blockley. I suini rappresentano un importante serbatoio di S.

Typhimurium e S. Derby (Wilcock, 1992).

14

SALMONELLA NEGLI ALIMENTI

L’ubiquitarietà e la capacità di crescita delle Salmonelle a

temperature comprese fra 7°C e 46°C fa sì che qualsiasi alimento

manipolato o conservato in modo non corretto possa essere

contaminato e quindi rappresentare un’eventuale fonte di

infezione.

Molti episodi di malattia alimentare sono causati dal tempo

prolungato intercorso fra la preparazione o la cottura dell’alimento

e il consumo. Questo rende possibile la moltiplicazione dei batteri

presenti nell’alimento, con raggiungimento di elevate

concentazioni e quindi con maggiore probabilità di causare

malattia (De Felip, 2001).

Il ruolo degli operatori della catena alimentare può essere

rilevante, in quanto è stato dimostrato che una non corretta

manipolazione di materie prime contaminate (carni, uova) può

causare un’estesa contaminazione ambientale che può essere

causa di cross-contaminazione anche di alimenti pronti per essere

consumati (Synnott, 1998).

15

Per quanto riguarda la catena di macellazione, la presenza

di Salmonella sulle carcasse è generalmente dovuta a

contaminazione fecale, ed è direttamente proporzionale all’entità

dell’infezione nell’animale e alle carenze igieniche in fase di

macellazione. La contaminazione profonda a livello delle masse

muscolari è infrequente, ma i processi di produzione di carni

macinate o insaccati freschi fanno sì che la contaminazione

superficiale venga estesa a tutto il prodotto. Per questo motivo tali

prodotti, se cotti o stagionati in modo non sufficiente, possono

divenire fonti di infezione (Castellani, 1993).

Nelle carni avicole, la contaminazione da Salmonella

dipende principalmente dalle modalità di allevamento del pollame.

Ogni allevamento può contenere migliaia di capi in spazi limitati, e

questa concentrazione di potenziali ospiti fornisce alle Salmonelle

l’opportunità di diffondersi in modo estremamente rapido tra gli

animali. La stessa condizione si può verificare durante il trasporto

dall’allevamento al macello, se questo avviene in condizione di

sovraffollamento. Una contaminazione superficiale delle carcasse

si può riscontrare nel corso della macellazione per contaminazione

crociata che si verifica durante le diverse fasi.

16

Le uova e i prodotti derivati rappresentano un importante

veicolo di Salmonella, soprattutto di S. Enteritidis. La

contaminazione dell’uovo può avvenire nell’ovaio per trasmissione

verticale, o nella cloaca al momento della deposizione; inoltre non

infrequente è la contaminazione delle uova durante il trasporto su

nastro imbrattato da feci. La maggior parte dei casi di

tossinfezione alimentare da S. Enteritidis sono correlati non tanto

alle uova, quanto al consumo di prodotti a base di uova, quali

maionese e dolci preparati con uova crude, in cui la

moltiplicazione dei microrganismi presenti avviene in seguito al

mantenimento dei prodotti a temperatura ambiente anche per

tempi brevi.

17

PARTE SPERIMENTALE

La rete ENTER-NET In Europa, è attiva dal 1994 una rete di sorveglianza

internazionale chiamata ENTER-NET, che coinvolge centri di

referenza dei Paesi dell’Unione Europea nonché il Canada, il

Giappone, il Sud Africa, la Svizzera e la Norvegia. La rete ENTER-

NET raccoglie informazioni sui sierotipi di Salmonella e di E. coli

VTEC associate alle infezioni umane, sulla resistenza agli

antibiotici dei ceppi implicati e contribuisce all’identificazione e allo

studio di episodi epidemici a carattere internazionale.

L’Istituto Superiore di Sanità partecipa alla sorveglianza

Europea e coordina un sistema di sorveglianza nazionale,

ENTER-NET Italia, che coinvolge numerosi laboratori del Servizio

Sanitario Nazionale (SSN), dai quali riceve regolarmente le

segnalazioni degli isolamenti e provvede a diffondere i dati e le

informazioni di ritorno ai laboratori partecipanti.

Nel 2002 è stata attivata a livello nazionale una struttura

parallela al sistema ENTER-NET, che riguarda la raccolta di dati

sugli isolamenti di Salmonella spp. da campioni di origine

18

veterinaria, e che prende il nome di ENTER-VET. Le strutture che

vi partecipano sono gli Istituti Zooprofilattici Sperimentali coordinati

dal Centro Nazionale di Referenza per le Salmonellosi istituito

presso l’Istituto Zooprofilattico delle Venezie.

ENTER-NET raccoglie mediamente ogni anno informazioni

microbiologiche ed epidemiologiche su oltre 12.000 isolati di

Salmonella, di cui circa la metà di origine umana (Rapporti

ISTISAN 05/27).

In italia le infezioni umane da Salmonella e gli episodi

epidemici dovuti a tossinfezione alimentare sono soggetti a

notifica obbligatoria al SSN, ma spesso i casi di Salmonellosi sono

sottostimati, la trasmissione delle informazioni spesso è poco

tempestiva ed è difficile associare episodi epidemici al consumo di

un particolare alimento contaminato (www.ministerosalute.it).

Il Centro di Riferimento Regionale per gli Enterobatteri dell’Istituto

Zooprofolattico Sperimentale dell’Umbria e delle Marche partecipa

alla rete di sorveglianza raccogliendo dati e ceppi batterici che

vengono inviati dai laboratori periferici delle AASSLL territoriali, da

laboratori privati e dall’ARPA. I ceppi batterici di Salmonella

vengono sottoposti ad una serie di analisi: test biochimici,

19

tipizzazione sierologica, tipizzazione biomolecolare e valutazione

dell’antibiotico resistenza. Il saggio di sensibilità agli antimicrobici

viene effettuato con la tecnica della diffusione in agar (Kirby-

Bauer, 1966) secondo le linee guida NCCLS.

Protocollo Ricerca di Salmonella da alimenti La ricerca di Salmonelle negli alimenti è una procedura

prevista dalla normativa per la sicurezza degli alimenti e viene

effettuata seguendo procedure operative standard (POS) che si

basano su metodi validati dall’International Standard Organization

(ISO).

Il metodo ufficiale adottato dall’IZS è quello VIDAS

Salmonella, metodo alternativo validato in base alla norma ISO

16140 sul metodo UNI EN ISO 6579:2004. Tale test è di tipo

qualitativo e permette la rilevazione di Salmonella nei prodotti

alimentari con un test immunoenzimatico: ELFA (Enzyme Linked

Fluorescent Assay).

Il test utilizza un cocktail di anticorpi monoclonali di cattura

ad alta specificità, diretti contro degli antigeni O ed H e permette

20

l’individuazione dei ceppi mobili ed immobili di Salmonella con una

leggera reattività crociata con le altre Enterobatteriacee.

Qualora il risultato del test VIDAS Salmonella dia esito

positivo per la presenza del germe nell’alimento analizzato, questo

risultato deve essere confermato da un successivo isolamento

dalla stessa matrice mediante il metodo descritto nella ISO

6579:2004 (International Organization for Standardization:

Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method

for the detection of Salmonella spp.).

Tipizzazione Sierologica La tipizzazione sierologica viene effettuata mediante

agglutinazione, con metodica rapida su vetrino o lenta in provetta.

Entrambe le metodiche si applicano per l’identificazione degli

antigeni somatici O e degli antigeni flagellari H, nonché

dell’antigene di virulenza Vi. La scelta del metodo dipende dalle

esigenze del laboratorio: il metodo dell’agglutinazione rapida è

veloce e apparentemente più semplice, ma richiede una certa

abilità ed esperienza dell’operatore, mentre, il metodo

dell’agglutinazione lenta è più complesso e dispendioso ed è

21

consigliabile se il laboratorio tratta costantemente un numero

programmabile di tipizzazioni.

La tipizzazione prevede operativamente le seguenti fasi:

1. Agglutinazione volta ad evidenziare l’antigene somatico (O)

2. Agglutinazione volta ad evidenziare gli antigeni flagellari H.

Vista la numerosità di sierotipi presenti nello schema di

Kauffmann-White è importante fare alcune considerazioni: se ci

riferiamo ad isolati da campioni umani basterebbe utilizzare gli

antisieri specifici per i sierotipi più frequentemente implicati nella

patologia umana che, rispetto alla grande quantità esistente, sono

in numero limitato. In generale i principali sierotipi isolati sono

quelli appartenenti ai gruppi O4, O7, O8, O9, O3,10, O1,3,19 e

con fase ciliare b, d, i, E, G, k, y, L, r, z10, z29 e 1; inoltre se

abbiamo ad esempio isolati appartenenti al gruppo O4 e O9, si

può ipotizzare che i sierotipi siano S. Typhimurium e S. Enteritidis,

rispettivamente.

Accorgimenti per ottenere un miglior risultato sono l’utilizzo

di colture fresche per ottenere una migliore agglutinazione e il

passaggio su una piastra di agar nutriente semisolido in quanto le

colture vecchie possono perdere la mobilità; dopo incubazione a

22

+37°C, con la piastra posizionata in modo da avere il coperchio

rivolto verso l’alto, si preleva per il test la patina batterica dalla

parte periferica della piastra stessa.

La tecnica di agglutinazione rapida su vetrino prevede l’uso

di batteri trapiantati da terreni nutritivi come il Tryptycase Soy Agar

(TSA - OXOID). Operativamente si pone una goccia di antisiero su

un vetrino e poi con l’ansa, si procede a trasportare la patina

batterica direttamente sulla goccia di siero e si mescola con

movimento circolare, in modo da disperdere i batteri. La patina

microbica viene stemperata dalla periferia della goccia verso il

centro fino ad inglobare tutto il siero. La miscelazione viene

completata con movimenti di oscillazione del vetrino. Dopo

qualche secondo si osserva la reazione ad occhio nudo e, nel

caso di reazione positiva, si osserveranno piccoli granuli bianchi,

omogeneamente dispersi nell’intera goccia di siero, divenuta

trasparente attorno alle granulazioni. In caso di reazione negativa i

batteri rimangono in sospensione con un aspetto lattiginoso e

opaco (Zavanella, 2001).

Lo schema di identificazione più comunemente applicato

(WHO, 1980; Popoff, 1997) prevede l’uso iniziale di sieri

23

polivalenti che forniscono delle indicazioni generali e,

successivamente, di sieri monovalenti specifici nei confronti sia

degli antigeni somatici O sia degli antigeni flagellari H.

Operativamente le fasi sono:

1. saggio delle colonie con antisiero polivalente somatico O (A-S);

2. saggio delle colonie con antisiero monovalente somatico O;

3. saggio delle colonie con antisiero polivalente flagellare H (poli H

fasi 1 e 2);

4. saggio delle colonie con antisiero monovalente flagellare.

Una completa definizione del sierotipo prevede, se si tratta

di Salmonella bifasica, il riconoscimento di entrambe le fasi ciliari 1

e 2 che non possono essere evidenziate contemporaneamente

durante la prima agglutinazione, per cui si procederà ad effettuare

la cosiddetta “inversione di fase”. I metodi più conosciuti sono

quello di Swen Gard e il metodo di Craigie.

Il primo consiste nel seminare il ceppo al centro di una

piastra contenente un terreno nutritivo agarizzato semisolido

(Swen-Gard - Estratto di carne 5g/l, Estratto di lievito 1g/l,

Glucosio 2.5 g/l, Peptone di caseina 17g/l, Peptone di soia 3 g/l

Potassio fosfato bibasico 2.5 g/l, Sodio cloruro 5 g/l, Agar noble 5

24

g/l), addizionato con una piccola quantità di siero anti-Salmonella

corrispondente alla fase H espressa (e quindi da inibire). Dopo

incubazione a 37°C per 18-24 ore, la Salmonella, essendo mobile,

si svilupperà formando una patina batterica di forma circolare, alla

cui periferia saranno presenti cellule batteriche dotate della fase H

differente da quella iniziale, che è stata inibita dall’antisiero posto

nel terreno (inversione di fase).

Il metodo di Craigie segue lo stesso principio del

precedente, ma viene effettuato in provetta.

Dopo aver ottenuto l’inversione di fase si ripete

l’agglutinazione con gli antisieri H.

Nel metodo dell’agglutinazione lenta per la ricerca degli

antigeni H, ogni ceppo viene seminato in due provette, contenenti

rispettivamente 3 mL di Trypticase Soy Broth (TSB) per la ricerca

della fase “H”, e 4 mL del medesimo terreno per la ricerca della

fase “O”. La provetta contenente 3 mL viene incubata a 37°C per

18-24 ore, e successivamente addizionata con un ugual volume di

soluzione fisiologica formolata all’1%. La provetta contenente 4

mL viene incubata a 37°C per 3 ore, e successivamente

sottoposta ad in attivazione mediante bollitura. Si procede quindi

25

al test di agglutinazione lenta su piastra, utilizzando per ogni siero

la diluizione d’uso precedentemente stabilita testando ceppi di

riferimento con diluizioni scalari dei diversi sieri. Per tale prova

esistono dei pool di sieri introdotti da Spicer-Edwards che

consentono, mediante varie combinazioni, di risalire a 35 fattori

antigenici (Zavanella, 2001) (Tabella 4).

Tabella 4. Composizione dei pool di Spider-Edwards Antigeni H Pool 1 Pool 2 Pool 3 Pool 4 a + + + -b + + - +c + + - -d + - + +e,h + - + - G Complex + - - + j + - - -k - + + +r - + - +y - + - -z - - + +z4 Complex - - + - z10 - - - + z29 - + + - Antigene H Nome del pool Numero del pool e, n,x ; e, n, z15 EN complex 5 l, v ; l, w ; l, z13 ; l, z28 L complex 6 1,2 ; 1,5 ; 1,6 ; 1,7 ; z6 1 complex 7 Nota:G complex comprende gli antigeni f, g; f, g, s; f, g, t; g, m; g, m, q; g, m, s; g, m, t; g, p; g, p, s; g, p, u; g, q; g, s, t; g, t; m, p, t, u; m, t z4 complex comprende gli antigeni z4, z23; z4, z24; z4, z32

26

Multiplex PCR Alcuni ceppi possono risultare monofasici da un punto di

vista sierologico, mentre in realtà sono in possesso del gene

codificante la seconda fase ciliare, ma hanno ridotto o perso la

capacità di esprimerlo.

Per confermare la mancanza della seconda fase viene

utilizzata una tecnica di caratterizzazione molecolare dei geni

responsabili dell’espressione di specifici antigeni flagellari.

L’analisi si basa sull’amplificazione mediante PCR di

specifici frammenti del gene fljB codificante il complesso

antigenico H1, resa possibile dall’utilizzo di una serie di coppie di

primers scelta opportunamente sulle sequenze specifiche degli

alleli H1,2, H1,5, H1,6 e H1,7 che costituiscono il complesso

stesso. In particolare la metodica prevede l’utilizzo di un primer

“senso” comune a tutte le varianti alleliche e quattro primers

antisenso di cui uno comune a tre specifici, rispettivamente per gli

alleli H1,5, H1,6 e H1,7. In seguito a reazione multiplex si ottiene

l’amplificazione di tre ampliconi specifici di differente peso

molecolare relativi alle suddette varianti alleliche con l’assunzione

27

che l’amplificazione dell’intero frammento corrisponde a positività

per allele H1,2.

Per l’estrazione del DNA batterico 4-5 colonie da una

coltura in TSA vengono stemperate in 300µL di acqua distillata e

fatte bollire per 15 minuti; successivamente vengono centrifugate

a 14000 rpm per 5 minuti e il surnatante viene trasferito in una

provetta eppendorf.

Le condizioni della miscela di reazione (Tabella 5) e le

sequenze dei primers (Tabella 6) sono riportate di seguito

(Echeita, 1998).

Tabella 5. Mix di reazione

Reagenti Concentrazione iniziale

Concentrazione finale

Quantità in 50 µLdi volume di reazione per

campione Buffer Taq Gold 10X 1X 5 µLMgCl2 25mM 1,5mM 3 µLdNTPs 10mM 200 µM 1 µLPrimer Fly B sense F1 5 µM 0.26 µM 2.6 µL

antisense R6 5 µM 0.26 µM 2.6 µLantisense R5 5 µM 0.3 µM 3 µLantisense R7 5 µM 0.34 µM 3.4 µLantisense R1 5 µM 0.28 µM 2.8 µL

Taq 5U/ µL 2.5U 0.5 µLH2O 21.1 µL

28

Tabella 6. Sequenze dei primers Primer Fly B sense F1 5’ –CGCAAAGATACAGCAGTAACAACGA- 3’ Primer Fly B antisense R6 5’ –CTCCTGTACTTCTGTTTTGGTTGTA- 3’ Primer Fly B antisense R5 5’ –CCGGTTACAGCAGCCGTACCAG- 3’ Primer Fly B antisense R7 5’ –TAATCGCCATTTTTGTCGAG- 3’ Primer Fly B antisense R1 5’ –CATTTTGACCAATCTCGCGACAT- 3’

Tipizzazione Fagica

La tipizzazione fagica viene effettuata se si ha l’esigenza di

confrontare ceppi appartenenti allo stesso sierotipo e/o di

effettuare indagini epidemiologiche. La fagotipizzazione permette

infatti di differenziare i vari sierotipi in sottotipi (fagotipi) in base

alla diversa sensibilità nei confronti di un pannello di batteriofagi.

Questa tecnica sfrutta la caratteristica che hanno alcuni batteri di

possedere recettori specifici per determinati fagi sierotipo specifici

che, quindi, possono penetrare, replicarsi nella cellula e indurne la

lisi. La modalità di esecuzione e di interpretazione della tecnica

può basarsi su diversi schemi, ma quelli più comunemente

utilizzati sono quelli indicati dal Public Health Laboratory Service,

Colindale, Londra. È sicuramente una metodica molto utile, ma ha

come svantaggio quello di dipendere molto dalla capacità

interpretativa dell’operatore ed è quindi anche di difficile

29

standardizzazione. Inoltre, i reagenti non sono in commercio, e

solo presso i laboratori di riferimento nazionali è possibile

effettuare la fagotipizzazione.

Operativamente l’isolato viene seminato su piastre di

Triptycase Soy Agar (TSA) e incubato a 37°C per 18-24 ore.

Successivamente si trasferisce con un ansa la patina batterica in 4

mL di Nutrient Broth Double Strenght (DIFCO) e si incuba per 2

ore a 37°C. Contemporaneamente si trasferiscono i fagi

opportunamente diluiti in micropiastre. Le brodocolture vengono

seminate su piastre di Nutrient Agar (DIFCO), a cui vengono

aggiunti i fagi in modo da formare delle gocce ben delimitate. Le

piastre di Nutrient Agar inoculate vengono incubate a 37°C per 18-

24 ore. Alla fine dell’incubazione si effettua la lettura. La presenza

di lisi in corrispondenza del fago viene evidenziata mediante la

formazione di una placca circolare in cui manca la patina batterica,

o dalla presenza di placche di numero e dimensioni variabili in

caso di lisi incompleta (Anderson, 1977).

30

Tipizzazione Biomolecolare Mediante PFGE (Pulsed-

Field Gel Electrophoresis) L’utilizzo della PFGE consente, mediante il confronto

dell’impronta del DNA (DNA fingerprinting), di capire se isolati di

Salmonella possono derivare dallo stesso clone cellulare. Questa

tecnica fornisce informazioni importanti ai fini epidemiologici.

A tal proposito, il DNA viene frammentato in frazioni di

diversa lunghezza grazie ad endonucleasi di restrizione e

successivamente viene fatto correre su un gel d’agarosio per

separare i frammenti originati e misurarne così il numero e il peso

molecolare (espresso in paia di basi: bp). Quello che si ottiene è

un profilo di restrizione unico per ciascun clone, costituito da

bande evidenziate mediante fluorescenza dalla colorazione con

bromuro di etido. Tale profilo di restrizione permette

l’individuazione del ceppo esaminato e il confronto con profili

ottenuti da altri ceppi della stessa specie. Il più comune metodo di

separazione di molecole di DNA di grandezza compresa in un

range tra 0,1 Kb e 30 Kb è il gel-elettroforesi orizzontale. Quando

la misura del DNA è al di sopra delle 30 Kb, si utilizza

l’elettroforesi su gel in campo pulsato (Pulsed-Field Gel

31

Electrophoresis o PFGE). Tale tecnica ideata da Schwartz e

Cantor nel 1983 utilizza due campi elettrici con differenti

angolazioni, applicati alternativamente al gel di agarosio per

periodi di tempo definiti, dell’ordine di secondi. L’azione del primo

campo causa uno stiramento lungo il piano orizzontale delle

molecole di DNA e il loro movimento nel gel. L’interruzione di

questo campo e l’azione del secondo fa sì che le molecole si

muovano nella nuova direzione. Tenendo presente che per una

molecola a catena lunga lineare esiste una relazione tra il

cambiamento conformazionale indotto da un campo elettrico e la

lunghezza della molecola stessa, le molecole più piccole si

riallineranno più velocemente nel nuovo campo elettrico e quindi

continueranno a muoversi attraverso il gel. Molecole più grandi al

contrario impiegheranno più tempo per allinearsi. Variando

continuamente la direzione del campo elettrico sarà quindi

possibile separare le molecole quelle più piccole da quelle più

grandi. La PFGE permette di separare frammenti di DNA fino a 10

Mb.

La tecnica, secondo il protocollo PULS-NET previsto dal

circuito europeo ENTER-NET, prevede l’utilizzo di terreno in

32

piastra di TSA (Tryptone Soya Agar) su cui vengono fatti crescere

gli isolati; le cellule batteriche vengono raccolte direttamente dalle

piastre. Successivamente vengono risospese in CSB (Cell

Suspension Buffer: 100mM Tris, 100mM EDTA, pH 8) sino ad

ottenere una densità di 0,50-0,55 O.D. (unità di densità ottica) a

600 nm. Poiché il DNA cromosomico può danneggiarsi facilmente,

le cellule batteriche vengono inglobate in una matrice d’agarosio a

forma di blocchetti. Si prepara un gel d’agarosio al 2% in TE

(10mM Tris, 1mM EDTA, pH 8) e si lascia scendere la

temperatura del gel fino a 55°C. Contemporaneamente si

prelevano 500µL della sospensione cellulare ai quali si

aggiungono 20 µL di Proteinasi K (pari a 8 unità) e si unisce con

l’agarosio in modo da ottenere un rapporto 1:1; si cola in uno

stampo e si lascia solidificare per 10 minuti a 4°C. Ogni blocchetto

d’agarosio che contiene le cellule batteriche viene lasciato per 2

ore in una soluzione di lisi, ClysisB (50mM Tris, 50mM EDTA, 1%

Sarkosyl, 0,1 mg/mL Proteinasi K, pH8), in agitazione in un

bagnetto a 55°C. Il blocchetto d’agarosio con le cellule incluse

viene quindi lavato due volte utilizzando acqua distillata sterile alla

temperatura di 50°C; successivamente vengono effettuati tre

33

lavaggi in TE alla stessa temperatura. I blocchetti così ottenuti

possono essere conservati per molti mesi a 4°C per successive

analisi.

Al momento dell’analisi del DNA, uno dei tasselli conservati,

dello spessore di 3 mm, viene posto a contatto con 100 µL di una

soluzione contenente 84 µL di acqua nuclease-free, 10 µL di

Buffer di reazione, 1 µL di Bovin Serum Albumine (BSA) e 5 µL

dell’enzima XbaI. Si lascia ad incubare a 37°C over-night (in

alternativa è prevista anche un’incubazione di 4 ore a 37°C).

Si prepara un gel d’agarosio all’1% in 150 mL di TBE 0,5X,

si cola nel supporto e si lascia solidificare. Si caricano i campioni

nei pozzetti e si sigilla con l’agarosio con cui sono stati fatti i

blocchetti diluito in TE fino all’1%.

L’ apparato utilizzato per la corsa elettroforetica è del tipo

Contour-clamped Homogeneous Electric Field (CHEF) in cui gli

elettrodi sono disposti ad esagono nella vasca in modo da

generare un campo elettrico con angolo di 120° in tutte le parti del

gel. Con questa tecnica si ottengono bande molto nette e piste di

migrazione ben dritte poiché in tutte le direzioni del gel il DNA è

34

sottoposto alle stesse condizioni (6V/cm (200V), switch time 2-64

s, tempo di corsa 22 ore alla temperatura di 14°C).

Per visualizzare le bande il gel viene colorato con bromuro

d’etidio e osservato al transilluminatore UV. L’immagine del gel,

che sarà utilizzata per l’analisi e l’interpretazione dei profili, viene

fotografata, salvata in formato TIFF e analizzata con un software

(BIONUMERICS) in grado di confrontare le diverse bande ottenute

ed effettuare eventuali correlazioni tra i diversi ceppi, in modo da

capire se vi è una discendenza clonale.

35

Episodio di Tossinfezione Alimentare Durante l’ultimo decennio, la diffusione di ceppi di

Salmonella enterica serovar 1,4,[5],12:i:-, ha subito un costante

incremento, soprattutto negli isolati di origine umana.

In Italia, nonostante il basso numero di isolamenti, questo

sierotipo risulta essere il terzo più frequentemente isolato da

campioni umani. Anche in ambito veterinario, tale sierotipo, che

risulta per lo più correlato al suino e ai prodotti derivati, risulta in

costante crescita (Echeita, 1999).

Nel maggio del 2005, in provincia di Perugia, si è verificato

un episodio tossinfettivo causato da Salmonella enterica sierotipo

4, [5], 12; i; -, legato al consumo di una porchetta contaminata,

che è stata servita in occasione di un rinfresco aziendale.

L’episodio ha coinvolto un numero piuttosto alto di persone.

Il ceppo è stato isolato da un residuo del pasto, conferito al

Laboratorio di Microbiologia degli Alimenti dell’IZS (Istituto

Zooprofilattico Sperimentale dell’Umbria e delle Marche). Nei

giorni successivi, dai laboratori ospedalieri afferenti al Centro di

Riferimento Regionale Enteropatogeni dell’IZS di Perugia sono

stati inviati numerosi ceppi isolati da casi clinici, che sono risultati

36

appartenere allo stesso sierotipo. Nelle schede di notifica, solo in

due casi era citata l’associazione tra infezione e consumo di

porchetta.

L'identificazione del germe dalla matrice alimentare è stato

effettuato mediante metodo ELFA sopra descritto (VIDAS

Salmonella); successivamente si è proceduto all’isolamento

mediante il metodo descritto nella ISO 6579:2004 e alla

caratterizzazione biochimica del germe mediante sistema in

micrometodo (Rapid 20 E - Biomérieux).

Sugli stipiti di origine umana inviati all’IZS dalle varie

strutture Ospedaliere della Regione è stata eseguita la

sieroagglutinazione rapida su vetrino utilizzando sieri del

commercio (Statens Serum Institut - DK). Sul DNA estratto dagli

isolati umani si è proceduto all’identificazione biomolecolare

mediante PCR multiplex e PFGE.

Su colonie di Salmonella isolate dalla porchetta si è

proceduto ad isolare il DNA e alla sua analisi mediante PCR

multiplex e PFGE.

Per l’interpretazione dei dati sono state seguite le linee

guida proposte da Tenover riportate in tabella 7 (Tenover, 1995).

37

Tabella 7. Criteri per l’interpretazione dei profili secondo Tenover Categoria Numero di

frammenti differenti Interpretazione epidemiologica

Indistinguibili 0 Gli isolati appartengono allo stesso caso di tossinfezione alimentare

Strettamente correlati 2-3 Gli isolati probabilmente appartengono allo stesso caso di tossinfezione alimentare

Possibilmente correlati 4-6 Gli isolati possibilmente appartengono allo stesso caso di tossinfezione alimentare

Non correlati ≥ 7 Gli isolati non appartengono allo stesso caso di tossinfezione alimentare

38

Risultati e Discussione La ricerca di Salmonella effettuata sul campione di

porchetta mediante metodo ELFA sopra descritto (VIDAS

Salmonella) ha messo in evidenza la presenza di antigeni di

Salmonella spp., confermata successivamente mediante

isolamento e test biochimici.

I risultati della PCR multiplex su DNA estratto da

Salmonella isolata da campioni umani e porchetta sono mostrati in

Figura 1.

Figura 1. Risultati Multiplex PCR

1,21: 50 pb DNA ladder (Fermentas Life Sciences); 20: controllo negative di amplificazione; 2: S. Typhimurium (H2: 1,2 – 394pb); 3: S. Infantis (H2: 1,5 – 103pb); 4: S. Anatum (H2: 1,6 – 291pb); 5: S. Bredeney (H2: 1,7 – 195pb); 6-19: ceppi isolati da casi clinici correlati

39

La PCR multiplex ha messo in evidenza l’assenza in

entrambi i casi dei determinanti genetici che codificano per gli

antigeni flagellari 1.2 (394bp), 1.5 (103bp), 1.6 (291bp), 1.7 (195

bp). I 14 ceppi esaminati sono pertanto ascrivibili al sierotipo

4,[5],12:i:-.

Figura 2. Risultati della PFGE

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

2:ceppo isolato da porchetta; 3-6, 8-12, 14-17: ceppi isolati da casi clinici correlati; 19-20: ceppi isolati da casi clinici non correlati; 1, 7, 13, 20: controllo S. Braenderup; 18: controllo S. Senftenberg.

La PFGE del DNA isolato dal campione di porchetta ha

messo in evidenza un profilo strettamente correlato a quello del

40

DNA dei ceppi umani. Per confermare tale risultato il profilo del

DNA dei campioni esaminati è stato confrontato con il profilo di

altri ceppi appartenenti allo stesso sierotipo, isolati da casi clinici in

periodi precedenti. I risultati mostrano in questo caso un profilo

elettroforetico sostanzialmente diverso (Figura 2 ).

41

CONCLUSIONI Alla luce delle nuove normative sull’igiene degli alimenti,

l’analisi del rischio come fondamento su cui basare la politica di

sicurezza degli alimenti rende sempre più importante una sicura

identificazione dei rischi microbiologici legati al consumo degli

alimenti. Pertanto lo sviluppo di strumenti operativi sempre più

efficienti è alla base delle strategie di controllo sulla diffusione

delle malattie alimentari.

L’incidenza totale delle malattie trasmesse dagli alimenti è

difficile da stimare, innanzitutto perché si tratta di forme morbose

nella maggior parte dei casi autolimitanti, che quindi sfuggono ai

normali canali di notifica.

In molti episodi di tossinfezione alimentare, le indagini

epidemiologiche spesso non consentono di identificare l’agente

eziologico che li ha prodotti; questo perché sono tanti gli “attori”

preposti alla gestione dell’episodio tossinfettivo (Operatori del

Pronto Soccorso, Medici di base, Veterinari, Laboratoristi,

Epidemiologi,…) e spesso non si interfacciano tra loro. Di

conseguenza risulta spesso impossibile correlare una

tossinfezione all’alimento che l’ha causata.

42

Pertanto il sistema di sorveglianza per le Salmonelle

adottato dalla rete ENTER-NET sembra essere oggi un sistema

efficace di congiunzione tra i diversi operatori, oltre a risultare un

ottimo strumento di informazione e controllo epidemiologico.

Inoltre, lo studio genomico dei ceppi batterici isolati da casi

di tossinfezione mediante la tecnica della elettroforesi in campo

pulsato (PFGE), proposto dallo stesso circuito europeo, è

riconosciuto a livello internazionale come il metodo di eccellenza

per la subtipizzazione dei ceppi di Salmonella e di altri

enteropatogeni. L’analisi genetica mediante PFGE è

particolarmente discriminante, consentendo la suddivisione degli

isolati batterici in clusters definiti, riconducibili ad una determinata

situazione epidemica, laddove i metodi classici di tipizzazione

(sierologica e fagotipica) non lo consentono.

Tale metodica consente di rilevare i pulsotipi circolanti in

ambito umano, animale, alimentare e ambientale in un

determinato distretto e di valutare le eventuali correlazioni tra gli

stipiti circolanti, fornendo dati per impostare studi di carattere

epidemiologico.

43

BIBLIOGRAFIA Allerberger F., Liesegang A., Grif K. et. al. Occurrence of Salmonella

enterica serovar Dublin in Austria. Eurosurv 2002;7(4):65-70.

Anderson E.S., Ward L.R., De Saxe M.J., De Sa J.D.H. Bacteriophage

typing designations of S. Typhimurium. Journal of Hygiene 1977;78:297-

300.

Bauer AW, Kirby WM, Sherris JC, Turck M. Antibiotic susceptibility

testing by a standardized single disk method. American Journal of

Clinical Pathology. 1966, 45(4), 493–496.

Bauman H.E. The HACCP Concepì and Microbiological Cathegories.

Food Tecnology. 1974, 28 (9) 10-34.

Brackelsberg C.A., Nolan L.K., Brown J. Characterization of Salmonella

Dublin and Salmonella Typhimurium (Copenhagen) Isolates from cattle.

Vet Res Com 1997;21:409-20.

Castellani G. Salmonelle e Salmonellosi. Atti conferenza nazionale

Unipath, Bologna, 6 Maggio 1993.

44

De Felip G. Recenti sviluppi di igiene e microbiologia degli alimenti.

Prima Edizione. Tecniche Nuove, 2001, Milano.

Echeita M.A., Usera M.A. Rapid Identification of Salmonella spp. Phase

2 antigens of the H1 antigenic complex using “multiplex PCR”. Res.

Microbiol. 1998, 149, 757-761.

Echeita M.A., Aladuena A., Cruchaga S. et al. Emergence and Spread of

an Atypical Salmonella enterica subsp. enterica Serotype [4,5,12:I:-]

Strain in Spain. 1999. J. of Clin. Microbiol., 37 (10), 3425.

Editorial, Nomenclature of Salmonella, J. Med. Microbiol., 1992, 37, 361.

Ewing W.H. Identification of Enterobacteriaceae, 4th ed. Elsevier Publ.

Co., New York, USA, 1986.

http://www.ministerosalute.it

http://www.simi.iss.it

45

International Organization for Standardization. Microbiology of food and

animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection of Salmonella

spp. ISO 6579:2004.

Kauffmann F. Zur Klassification des genus Salmonella, Zbl. Bakt. Orig.,

1967, 205, 399.

Le Minor L. e Coll. Designation of Salmonella enterica sp. As the type

and only species of the genus Salmonella, Int. J. System. Bacteriol.,

1987, 37, 465.

Libro Bianco sulla sicurezza alimentare, Commisione della Comunità

Europea, Com 1999, 719.

Popoff M.Y. et al. Supplement 1996 (n. 40) to the Kauffmann-White

scheme. Res Microbiol, 1997;148:811-4.

Rapporti ISTISAN 05/27. Salmonella infections: diagnosis, epidemiology

and surveillance.

46

Synnott M.B., Brindley M., Gray J., Dawson J.K. An outbreak of

Salmonella Agona infection associated with precooked turkey meat.

Commun Dis Public Health 1998;1(3):176-9.

Tenover et al. J. of Clin. Micro. 1995;33:2233-2239.

WHO. Centre for Reference and Research on Salmonella. Antigenic

formulae of Salmonella. Paris: Intern. Salmonella Centre, Institute

Pasteur, 1980.

WHO. Report of a WHO. Consultation with the participation of FAO.

1995, WHO pp 29-31. World Organization, Genever, Switzerland.

Wilcock B.P., Schwartz K.. Salmonellosis. In: Leman AD, Straw BE

(Ed.). Diseases of Swine. Ames: 7th ed. Iowa State University Press;

1992. p. 570-583.

Zavanella M. Tipizzare le salmonelle. Brescia: Fondazione Iniziative

Zooprofilattiche e Zootecniche, 2001.

47