25 Novembre 2011

Associazione Veneta per la Lotta contro la Talassemia

TELETHON, AVIS e ThalLab per la Lotta alla Talassemia

Roberto Gambari

Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare Università di Ferrara

AVIS e TELETHON, 10 anni di partnership

Roberto Gambari Dipartimento di Biochimica

e Biologia Molecolare Università di Ferrara

Verso una Terapia personalizzata della beta-Talassemia

Associazione Veneta per la Lotta contro la Talassemia

AVIS e TELETHON, 10 anni di partnership

Patologia su base genetica dovuta alla diminuita o assente produzione di una delle globine costituenti l’emoglobina

L’ossigeno si lega all’eme sulla molecola di emoglobina

emoglobina

Globulo rosso

I globuli rossi contengono centinaia di migliaia di molecole di emoglobina che trasportano O2

Eme

Talassemia: fisiopatologia e terapia convenzionale

E’ quindi necessario fornire dall’esterno globuli rossi normali

Talassemia: fisiopatologia e terapia convenzionale

normale Talassemia major

cromosoma 16

cromosoma 11

Talassemia: le basi molecolari

Le emoglobine

Embrionali:

Adulte: Fetali:

● Screening K562 cell system Cellular biosensors carrying GFP and RFP under the control

of the gamma- and beta-globin gene promoters

Experimental model systems

● Validation Erythroid precursor cells from beta-thalassemia and SCD patients

(with different genotype background; with different starting levels of HbF)

● In vivo Humanized transgenic mice carrying the entire human beta-

like gene cluster TG mice carrying selected Thal mutations or mimicking SCD

● Chronic myelogenous leukemia cell line

● Expression of embryo-fetal globin genes

● Fast screening of potential HbF inducers

Experimental Systems: K562 cells

Experimental Systems: -GFP, -RFP

β-globin promoter

γ-globin promoter

13339 bp

The /-globin promoter double reporter construct

pCCL.Prom.HcRed1.Prom.EGFP

K562 cells selection of stably transfected clones

treatment with potential HbF

inducers fluorescence microscope FACScan

green fluorescence

induction of the γ globin promoter

Cloning by limiting

dilutions

β-globin promoter

γ-globin promoter

13339 bp

cell transfection with cationic

liposomes

induction of the globin promoter

red fluorescence

I II III

molecular characterization

IV

V

V VI

Cristina Zuccato

Colture di precursori eritroidi isolati dal sangue periferico di pazienti affetti da β-talassemia

Colture di precursori eritroidi isolati dal sangue periferico di pazienti affetti da β-talassemia

Colture di precursori eritroidi isolati dal sangue periferico di pazienti affetti da β-talassemia

Strategie terapeutiche “generaliste”

(applicabili ad ogni tipo di -talassemia)

Terapia Genica

Induzione di emoglobina fetale

Strategie terapeutiche personalizzate

0-39

+-IVSI-110

+-IVSI-6

Le strategie terapeutiche

Induzione di emoglobina fetale: perchè?

1. HPFH

2. Trattamento di pazienti con idrossiurea

Age: 12 Genotype: Stop codon 23 13.5 Kb deletion, “Sicilian type” Phenotype: °-Thalassemia (no HbA) HPFH Splenectomized (when 4 years old) No transfusion Hb levels: 9-9.5 g/dL (Feriotto et al., Acta Haematologica, 2007)

Why induction of HbF: HU

Why induction of HbF: HU

Produzione nell’uomo di globine -like e -like

-thal

Rapamicina

Esempio di analisi: Induzione di HbF

HbF HbA0

HbA2

4

HbF

controllo

trattato

Angelicina

Ilaria Lampronti

Estratto di Bergamotto

Resveratrolo

Effects of resveratrol on erythroid precursor cells from thalassemic patients Patient Genotype HbF (%) HbF (fold induction)

(-) 40 uM resveratrol

1 (Fe4) °39/+IVS1-110 14.21 20.27 1.44

2 (Fe9) °39/°39 8.08 18.02 2.24

3 (Fe 10) °39/+IVS1-6 13.07 19.31 1.47

4 (Fe 11) °39/+IVS1-110 10.25 39.27 3.83

5 (Fe 12) °39/+IVS1-6 21.15 27.01 1.27

6 (Th18) +IVS1-6/+IVS1-110 1.97 11.42 5.78

7 (MA) °39/+IVS1-110 3.35 5.85 1.75

3.5 9.07 2.59

3.1 6.51 2.11

Resveratrol

Different resveratrol-based formulations -> different HbF induction efficiency

Stefano Rivella, Cornell University, New York, NY, USA

Terapia genica

Esempio di analisi: aumento di HbA0

HbA

controllo

trattato

Strategie terapeutiche “generaliste”

(applicabili ad ogni tipo di -talassemia)

Terapia Genica

Induzione di emoglobina fetale

Strategie terapeutiche personalizzate

0-39

+-IVSI-110

+-IVSI-6

Le strategie terapeutiche

Distribuzione delle mutazioni talassemiche

CD39 CT

IVSI-6 TC

IVSI-110 GA

IVSI-1 GA

IVSI-110 GA

IVSI-5 GC

IVSI-6 TC

CD39 CT

CD8 2bp

IVSI-5 GC

600bp

CD8/9 +G

IVSI-1 GT

CD41-42 4bp

IVSI-5 GC

IVSI-1 GT

CD41-42 4bp

CD26 GAGAAG

IVSII-654 CT

CD41-42 4bp

CD17 AAGTAG

CD26 GAGAAG

-28 AG

IVSI-5 GC

-29 AG

PolyA TC

β° 39 CT

β+ IVSI-6 TC

β+ IVSI-110 GA

β° IVSI-1 GA A T G A A G T T G G T G G T G A G G C C C T G G G C A G G T

T G G T A T C A A G G T T A C A A GA C A G G T T T A A G G

A G A C C A A T A G A A A C T G G G C A T G T G G A G A C A

G A G A A G A C T C T T G G G T T T C T G A T A G G C A C T

G A C T C T C T C T G C C T A T T G G T C T A T T T T C C C

A C C C T T A G G C T G C T G G T G G T C T A C C C T T G G

A C C C A G A G G T T C T T T G A G T C C T T T G G G G A T

° IVSI-1 GA +IVSI-6 TC

+IVSI-110 GA

°39 CT

esone I esone II

IVSI IVSII

esone III

5’ 3’

Gene della β globina

incidenza > 15%

Mutazioni più frequentemente responsabili di β talassemia in Italia

Sistemi sperimentali: Topi Transgenici

pronuclei

uovo fecondato

microiniezione del DNA nel pronucleo maschile pipetta

trasferimento all’ovidotto di una femmina pseudogravida per l’impianto

topo transgenico Modificata da “The Science Creative Quarterly”,

http://www.scq.ubc.ca/, Fan Sozzi

Alessia Finotti

Giulia Breveglieri

Nicoletta Bianchi

Irene Mancini

0-39 +-IVS-110 +-IVSI-6 0-IVSI-1

Produzione di linee murine transgeniche contenenti mutazioni talassemiche

PRODUCTION AND EVALUATION OF MURINE ORGANISM MODELS FOR THALASSAEMIA

Microinjection into

male pronucleus

Hemizygous transgenic

mouse (F0)

Hemizygous transgenic

mouse (F1)

Putative homozygous

TG mouse

Production of the

lentiviral vector

HOMOZYGOUS TG LINE

β+ IVSI-6 β0 39

BACK-CROSS

CROSS

CROSS

β0 IVSI-1

1 hemizygous F0 ♀ 1 hemizygous F0 ♂

β+ IVSI-110 1

1383

2765

4147

5529

6911

8293

9675

11057

12439

Ampf1 ori

5' LTR

3' LTR

Gene beta globinico mutatoPromotore beta

LCR

PGK

GFP

WPRE

y

RRE

pBR322 oriSV40 ori

Sistemi sperimentali: sviluppo di cloni cellulari ingegnerizzati per esprimere il gene β globinico mutato

Francesca Salvatori

HbA

HbF HbA0

HbA2

controllo

trattato

Esempio di analisi: Correzione di mRNA in 039 e aumento di HbA

Dal Laboratorio alla Clinica

Ricerca di base Ricerca applicata/preclinica

Ricerca su modelli animali

Identificazione del clinico di riferimento

Protocollo

Richiesta approvazione Comitato Etico (Ferrara, Pisa)

Trial clinico pilota

Brevetti

Industrie

● Novel molecules Advantages: they can be carefully designed against specific

targets (including in silico virtual screening) Disadvantages: clinical validation (phase I/II/III) required

HbF inducers: from the lab to the clinic

● Molecules already used in therapy for other diseases Advantages: clinical data on toxicity, pharmacodistribution,

administration routes available

● Natural products

● Advantages

Freely available on the market (in many instances are nutriaceutical products, anti-oxidant molecules, …..)

Low cost Route of administration simple

● Disadvantages

Self-made-therapy without clinical control

HbF inducers: from the lab to the clinic

I brevetti Titolo: A novel use of rapamycin and structural analogues thereof Titolo: Use of heterocyclic and benzoheterocyclic polyamides structurally related to the natural antibiotic dystamicyn A for the treatment of beta-thalassaemia Titolo: A novel use of angelicin and structural analogues thereof Titolo: Synthetic oligonucleotides as inducers of erythroid differentiation Titolo: Drug for treating thalassemia, falciform anemia and all other forms of anemia treatable therewith Titolo: Everolimus quale induttore di mRNA per la globina gamma nel trattamento della beta talassemia Titolo: Drug for the treatment of thalassemia, sickle cell disease and related pathologies, method for drug activation, pharmaceutical composition with the drug as the active molecule and photochemotherapic approach using the drug Titolo: Impiego di una linea di topi transgenici che producono mRNA aberranti per il gene umano della beta-globina contenente la mutazione beta+IVSI-6

Creazione di Networks

Prof. Eitan Fibach, Eugenia Prous. Hadassah Hospital, Jerusalem, Israele Dr. Stefano Rivella, Laura Breda, Sara Gardenghi. Cornell University, New York, USA Prof. Marina Kleanthous. Cyprus Institute of Neurology and Genetics, CING, Cipro Prof.ssa Amal El Beshlawy. Cairo University, El Monira University Hospital, Pediatric Hematology Dept., Cairo, Egitto Prof. Giorgio Catelani. Dipartimento di Chimica Organica, Università di Pisa Prof. Francesco dall’Acqua. Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, Università di Padova Prof. Claudio Favre. Azienda Ospedaliera Universitaria Pisana, UO di Oncoematologia Pediatrica, Pisa Prof. Rocco Potenza e Dott. Francesco Chiavilli. S.I.T. ULSS 18, Rovigo, Servizio di Immunoematologia

e Trasfusione, Ospedale di Rovigo Prof. Rosangela Marchelli. Dipartimento di Chimica Organica ed Industriale, Università di Parma Prof. Giulio Cabrini. Laboratory of Molecular Pathology, Laboratory of Clinical Chemistry and Haematology, University-Hospital, Verona Thalassaemia International Federation (TIF)

Creazione di Networks

http://www.talassemiaricerca.it/

Il ThalLab

Dissemination

www.talassemiaricerca.it gam@unife.it

I ricercatori

The ThalLab Partners

Associazione Veneta per la Lotta contro la Talassemia

Fondazione Cassa di Risparmio di Padova e Rovigo (CARIPARO)