Farmacologia preclinica
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7/27/2019 Farmacologia preclinica
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Farmacologia preclinica
Riferimenti: Dr. Sabata Pierno
Prof. Diana Conte
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Test preclinici
Valutazione del principio attivo prima del test sulluomo (clinici)
Colture cellulari
Test di farmaci su cellulenormali o cellule in cui
viene indotta una
mutazione
Organismi interi
Test in vivo su modellianimali di patologie e
animali sani
Valutazione tossicitValutazione tossicit
Acuta
Subcronica
Cronica
Riproduttiva
Cancerogenesi
Studi in vitroStudi in vitro Studi in vivoStudi in vivo
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Studi in vitro
propriet farmacologiche
screening iniziale di tossicit
metabolismo
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Test di tossicit
Valutazione del rischio potenziale nelluomoderivante dallesposizione ad un farmaco
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es. di test in vivo:inibizione
Misura della durata del sonno da esobarbitale(farmaco rapidamente disattivato dalle monoossigenasiepatiche)
Gli inibitori di questo sistema prolungheranno dunque laloro azione
es. somministrazione cloramfenicolo a topi 1 ora primadella somministrazione con pentobarbitale prolunga il
sonno in maniera dose-dipendente
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Test di neurotossicit
Su nuovi farmaci e agenti chimici
Uso di modelli animali: in genere roditori
Vengono valutati parametri neurocomportamentalicome perdita di memoria, deficit somatosensoriali,disfunzioni motorie e anche laspetto fisico,reattivit, forza muscolare
Supporto dei test in vitro
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Meccanismi di tossicit acuta
I canali ionici che facilitano la trasmissione dellimpulso nervoso
sono sensibili a perturbazioni causate da varie sostanze tossiche e farmaci.
(Gli inibitori del trasporto ionico sono indicati in parentesi)
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Test in vivo: tossicit acuta
Stabilire effetti tossici da singola dose:Si costruisce una curva dose risposta con almeno 5 animali per sessoEffetto quantale (tutto o nulla)
Fine: Standardizzare dosidefinire meccanismiattribuire eventuale tossicit dorganoletalit
determinazione requisiti sicurezza imballi
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Fattori responsabili della variazione della DL50Fattori responsabili della variazione della DL50
Specie
Razza etGenerePesoStato di saluteStato nutrizionaleContenuto intestinaleVia di somministrazioneStabulazioneTemperatura
OrarioStagioneErrore umano
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Saggio di irritazione oculareSaggio di irritazione oculare
Per valutare lirritazione dovuta a composti applicatitopicamente nellocchio
Variazione del test di DraizeAnimale da esperimento pi adatto: coniglio
Il test consiste nellapplicare il materiale da valutare nel sacco
congiuntivale nellocchio. Laltro occhio funge da controllo.Dopo 1, 2, 3 giorni va esaminato laspetto della cornea (opacit), iride
(aspetto e reazione alla luce), congiuntiva (arrossamento ed effetto suivasi), palpebre (eventuale gonfiore).
La colorazione alla fluoresceina pu migliorare lesame visuale perch ilcolorante pu essere pi facilmente assorbito dai tessuti danneggiati,
che diventano fluorescenti quando locchio viene illuminato
Nuove direttive: numero di animali minimo richiesto ridotto da 6 a 3.Il pH va controllato con attenzione
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Test per irritazione cutaneaTest per irritazione cutaneaapplicazione topica di sostanze chimiche
Irritazione primariaIl composto da studiare viene applicato su unarea rasata di 5 cm2 sul dorso di
conigli albini. Dopo 24 ore larea viene osservata valutando arrossamenti,lesioni, edemi ecc.
Sensibilizzazione cutanea
Valutazione reazioni allergiche. Ricerca di anticorpi. Animali usati: cavie
Fase di induzione: trattamento ogni 3 giorni per 2 settimane. Poi trattamentotopico di 24 ore simile al test di irritazione cutanea. Segue osservazione
severit lesioni su numero animali
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Sicurezza farmacologica
Test per lo sviluppo di nuovi farmaciIdentificare gli organi bersaglio(SNC, sistema cardio-vascolare, sistema polmonare)
Identificare gli effetti indesiderati
Possibili effetti tossicologici
Identificare il meccanismo che porta agli effettiindesiderati
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Studi di tossicit generale
Acuta: singola somministrazione;
A breve termine (dosi ripetute): 14-28 giorni;
Prolungata (10-25% della vita dellanimale, subcronica): 3-6 mesi(nel ratto)
Cronica (>50% della vita): 1-2 anni nel ratto (in genere studi di
cancerogenesi)
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gli studi acuti rappresentano lesposizione dovuta adincidenti o a sovradosaggi accidentali o volontari.
gli studi subcronici rappresentano lesposizione (a livellipi bassi di quelli dovuti ad incidenti) frequente a sostanzedi uso professionale (es. solventi) o domestico (es.
detergenti), ad additivi alimentari, farmacie inquinantiambientali;
gli studi cronici rappresentano lesposizione giornaliera,
per tutta la vita, ad additivi alimentari, residui di pesticidinel cibo e nellacqua ecc.
Rapporto con lesposizione delluomo
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Tipi di tossicit
Tossicit funzionale: alterazioni delle funzioni diun sistema (nervoso, cardiovascolare,endocrino) danno dorgano.
Citotossicit: alterazione irreversibile di proteine(enzimi, canali ionici ecc.) o membrane (lipidi);disregolazione del metabolismo necrosi,apoptosi tossicit tissutale e dorgano osistema (fegato, rene, SNC ecc.).
Genotossicit: alterazione del DNAmutazioni,
alterazioni cromosomiche cancerogenesi,malattie congenite.
Reazioni allergiche: allergeni, apteni,modificatori degli antigeni cellulari risposta
immunitaria.
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Predittivit degli studi animali di 221 effetti tossici di 150 farmacinelluomo.
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TossicitTossicit
subcronicasubcronica
Provocata da somministazione ripetuta (es. orale 28-90 gg)
Essenziale per stabilire i regimi di dose
Determinazione NOELNOEL (No-observed effect level)
3 livelli di dosedose; Via di somministrazione con la dieta
N animalianimali (roditori) = 10-20 (maschi e femmine) per ogni livello di dose
La specie scelta dovrebbe essere quella con maggiore similarit farmacocinetica e
metabolica con luomo (il pi comune roditore il ratto il pi comune non roditore il
cane)
Perridurre la variabilitridurre la variabilit si usano ceppi di roditori consanguinei
Gli animali devono essere posti in quarantenaquarantena prima di essere ammessi nellarea di
sperimentazione
Regolare ispezione da parte del veterinario
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Valutazione della reversibilitValutazione della reversibilit
Cibo normale per 21-28 giorni
Osservazione dei vari parametri
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Lista dei parametri da valutare
Dati in vita
Aspetto. Mortalit e morbilit. Pelle, pelo, eventuale presenza di massepalpabili, lesioni esterneOcchi. Esame della cornea e della retinaConsumo di cibo. settimanalmentePeso corporeo. SettimanalmenteAnomalie comportamentaliFrequenza respiratoriaECGEEG
Ematologia. Prima e dopo il test. Emoglobina, eritrociti, leucociti, piastrine,parametri di coagulazioneEmatochimica. Elettroliti, glucosio, lipidi, sieroproteine, transaminasi efosfatasi.Analisi delle urine. pH, densit, proteine, bilirubinaAnalisi delle feci. Sangue occulto, agenti tossici, metaboliti
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Test terminali
Se vengono riscontrate lesioni vieneesaminato anche il gruppo a dose pibassa
Istologia
I tessuti elencati, o evantuali masse, vengono inclusi sezionati ecolorati per la microscopia ottica. Inclusione in paraffina,
colorazione con ematossilina-eosina
Necropsia
I tessuti sono rimossi pesati edesaminati per evidenziare
grosse lesioni, masse, ecc.vengono poi fissati in formalinatamponata per il successivoesame istologico
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7/27/2019 Farmacologia preclinica
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Identificazione dei cancerogeni
Cancro: crescita incontrollata di cellule anormalicon possibile invasione dei tessuti lontani
Lanalisi epidemiologica ha rivelato lapresenza di un accumulo di mutazioni di
geni critici durante lo sviluppo del cancro
Alterazione processo direplicazione/riparazione DNA
danno ossidativo DNA
danni DNA causati da cancerogeni ambientali
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7/27/2019 Farmacologia preclinica
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Spesso un clone cellulare necessita di decenni peraccumulare molteplici mutazioni critiche da consentire losviluppo di un cancro evidenziabile clinicamente
Alcuni geni: proto-oncogeni sono presenti nelle cellulenormali e regolano la crescita cellulare.
Tali geni sono frequentemente mutati nel cancro
Durante la cancerogenesi i geni soppressori ditumore (oncosoppressori) possono subire
mutazioni e perdere attivit
Alcuni proto-oncogeni e oncosoppressori alterano la
capacit della cellula di andare incontro ad apoptosi
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Agenti terapeutici come potenziali cancerogeni
Agenti alchilantiCiclofosfamide
Ormoni
Fenacetina
Metronidazolo
Cimetidina
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Saggio di riferimento Gold standardCondotto x 2 anni sui roditori
Limiti:
Differenze tra specieUtilizzo di alte dosiBreve ciclo vitale roditoriNumerosit del campioneNecessit di estrapolazione alluomoCosti elevati
Test preliminaridi mutagenicit o tossicit genetica
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7/27/2019 Farmacologia preclinica
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Saggi di genotossicit / mutagenesi a breve terminesono stati sviluppati utilizzando batteri, lieviti,
Drosophila, cellule umane o murine
Valutazione della presenza di mutazioni puntiformi,mutazioni frame-shift, danni cromosomici e
trasformazioni cellulari
Mutagenicit era sinonimo di cancerogenicit neiroditori solo nel 60% dei casi (meccanismiepigenetici?)
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7/27/2019 Farmacologia preclinica
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Saggio di Tennant (Science, 1987)73 sostanze chimiche
gi testate come cancerogene nel saggio sui roditorisono state analizzate su 4 saggi a breve termine:
1.Saggio di mutagenesi sulla Salmonella (test di
Ames)2.Saggio del linfoma di topo3.Formazione di aberrazioni cromosomiche4.Scambio di cromatidi fratelli in cellule ovariche di
criceto
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Tossicologia
genetica
DNAemutazioni
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MutazioniVariazioni stabili del materiale
genetico trasmesse allaprogenie
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Mutazioni spontanee
provocate da fattori chimiciendogeni e da errori nei processi
che si attuano sul materiale
genetico
Mutazioniindotte
prodotte dall'azione diparticolari agenti fisici
o chimici
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Mutazionicromosomiche
Alterazione della strutturadel cromosoma
Es. sindrome del cri du chat(microencefalia, difficoltintellettive)
delezione braccio cortocromosoma 5
M t i i i h
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7/27/2019 Farmacologia preclinica
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Mutazioni genomiche
riguardano il numero di cromosomi
Aneuploidie = Aggiunta o perdita di cromosomi
le forme di aneuploidia pi frequenti sono la mancanza di un cromosomada una coppia (monosomia) o la presenza di un cromosoma in pi in unacoppia (trisomia) . Pi raro il caso di perdita di una coppia intera(nullisomia).
Es. trisomia del cromosoma 21 (ridotto sviluppo fisico e mentale,suscettibilit a malattie dellapparato respiratorio) frequenza 1/700nati
La sindrome di Turner invece un esempio di monosomia; gli individuinati con questa anomalia possiedono un solo cromosoma sessuale, quellofemminile X.
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7/27/2019 Farmacologia preclinica
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Mutazioni geniche
Sostituzioni o stopSostituzioni o stop
Es. anemia falciforme emoglobina S mutanteAT in TA
Valina al posto di ac. glutammico
Delezione o inserzione di 1 o pi basi
Scivolamento nella lettura(mutazioni frameshift)
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7/27/2019 Farmacologia preclinica
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Dominanti o recessive
a seconda se si esprimano o meno nelle cellule diploidi allo stato eterozigote
T t di A
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7/27/2019 Farmacologia preclinica
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Test di Ames
Stabilisce la capacit della sostanza in esame di indurremutazioni in un ceppo di Salmonella che porta una mutazioneper un enzima della via biosintetica dellistidina
Forte correlazione tra mutagenicit e cancerogenicit
Lagente chimico se mutageno potr determinare unamutazione (reversione) del gene compromesso permettendo
cos al batterio di risintetizzare laminoacido essenziale.
Test di Ames
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7/27/2019 Farmacologia preclinica
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es d esLa sensibilit dei ceppi pu essere aumentata da mutazioni ulteriori
Esistono ceppi ricombinanti per gli enzimi del metabolismo
2007 J.F. DESAPHY
Coltura di Salmonellaistidina-dipendenti (medium + istidina)
Miscela S9
Enz fegato ratto
Potenziale mutageno
coltura su
Agar privo di
istidina
incubazione
2 giorni 37Cmutageno
non-mutageno
Il mutageno pu casualmente revertire il fenotipo deficientedeterminando la comparsa di cloni in grado di sintetizzare istidina
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7/27/2019 Farmacologia preclinica
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Tossicit cronica
DurataDurata: generalmente 1 anno o pi
Animali utilizzatiAnimali utilizzati: ratti e caniStudi di cancerogenesi: ratti e topi
Fine dello studioFine dello studio: Definizione dei margini di sicurezza
I parametri da valutareparametri da valutare sono gli stessi usati per gli studisubcronici
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7/27/2019 Farmacologia preclinica
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I test di cancerogenesiI test di cancerogenesihanno requisiti in comune con i test subcronici e cronici
Lagente chimico da testare pu essere somministrato nel cibo,acqua da bere, applicazione dermica, sondino, inalazioneLa somministrazione va effettuata a cominciare dopo losvezzamento
La dose pi alta utilizzata la MTD (max dose tollerata)Principale parametro determinato: incidenza tumorale misurataattraverso esami istologici
Necessario un gran numero di animali a causa della possibilit dicomparsa spontanea di tumori (50 o pi ratti o topi per sesso e pergruppo di trattamento)
Necropsia ad uno stadio intermedio (es. 12 mesi) e alla fine del test
T d
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7/27/2019 Farmacologia preclinica
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Test di teratogenesi
tossicologia della riproduzione
Interferenza con la capacit riproduttiva
Possibilit di introdurre malformazioni congenite
Negli adulti (trattamento precedente laccoppiamento e
nelle femmine fino alla lattazione)
Negli animali in gravidanza durante il periodo diorganogenesi
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7/27/2019 Farmacologia preclinica
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Calcolo delle perdite pre- e post- impianto
(riassorbimento precoce e tardivo e morte fetale)
25 maschi vengono trattati per 70 gg che precedonolaccoppiamento e 25 femmine per 14 gg prima
dellaccoppiamento
3 livelli di DOSE3 livelli di DOSE (nel cibo, acqua da bere, con sondino)La dose alta viene scelta per causare una tossicit non
eccessiva nella madre (es. tale da indurre decremento di pesocorporeo del 10% o effetti su organi bersaglio)
Basse dosi nel range dei no-effect level
Il trattamentotrattamento viene continuato per tutta la gravidanza (21 gg)e fino allo svezzamento (ancora 21 gg)
La duratadurata scelta sulla base dei tempi critici di ovulazione e
spermatogenesi
Procedura sperimentale
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7/27/2019 Farmacologia preclinica
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Dopo la nascita i piccoli vengono contati, pesati ed esaminati perevidenziare eventuali anormalitLe nidiate sono raggruppate in numero costante (8-10) dopo 4
giorni
Allo svezzamento i cuccioli vengono sacrificati e su di essi eseguitaautopsia per valutare eventuali anormalit interne
Negli studi multigenerazionali vengono salvati 25 animali per sesso
e per gruppo per produrre le successive generazioni
Il trattamento continua per tutto il test, che pu essere condottoper due tre generazioni
Procedura sperimentale
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7/27/2019 Farmacologia preclinica
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Per valutare effetti da parte materna o paterna possibile trattare solo un genitore e incrociarlo con
un soggetto del sesso opposto non trattato
Analogamente possibile distinguere tra gli effetti
mediati dallutero o dovuti alla lattazione (scambiandoi neonati delle femmine trattate con quelli dellefemmine non trattate e viceversa)
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7/27/2019 Farmacologia preclinica
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Es.AntitumoraliAntiepilettici
CortisoniciAnticoagulanti orali
Effetti della Talidomide
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Effetti della Talidomide
Venduto negli anni 50-60 come sedativo, anti-nausea e ipnotico, rivolto in particolarmodo alle donne in gravidanza. Prodotto in forma di racemo, fu ritirato dal commercio
(1961) in seguito alla scoperta della teratogenicit dovuta ad uno dei suoi enantiomeri,
resa tristemente evidente dalla nascita di migliaia di bambini che presentavano amelia
(assenza degli arti) o vari gradi di focomelia (riduzione delle ossa lunghe degli arti),
generalmente a carico degli arti superiori che quelli inferiori, e quasi sempre bilaterale.
dopo 3 anni di prove su
animali non gravidi
e su donne inallattamento
Effetti collaterali non
gravi
La specie umana risultata essere sensibile
alla dose di 1 mg/kg.
Inibitore
dellangiogenesi
T t i t i d
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7/27/2019 Farmacologia preclinica
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Teratogenesi: parametri da osservare
Indice della fertilit: n di gravidanze rispetto al n diaccoppiamenti
N dei nati vivi rispetto al n natiPerdite pre-impianto: n corpi lutei rispetto al n dei siti di
impiantoPerdite post-impianto: n dei siti di riassorbimento nellutero
rispetto al n dei siti di impiantoDurata della gestazione
Effetti sul sistema riproduttivoDimensioni e condizioni della nidiata, morfologia dei cuccioli
alla nascita, genereSopravvivenza dei cuccioli
Aumento in peso e in prestazioniTempi di comparsa dei punti di riferimento dello sviluppo:apertura occhi, eruzione dei denti, apertura vagina,separazione prepuzio nei maschi
Anormalit morfologiche
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7/27/2019 Farmacologia preclinica
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Affinch un agente venga etichettato
TeratogenoTeratogenoOccorre un significativo incremento
dellincidenza di anormalit strutturali efunzionali sfavorevoli nella prole in seguito allasua somministrazione alle femmine nel corso
della gravidanza o direttamente allorganismoche si sta sviluppando
Gli studi di teratologia vengono condotti su due specie
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7/27/2019 Farmacologia preclinica
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Gli studi di teratologia vengono condotti su due specie(roditori come il ratto e non roditori come il coniglio,
cane, primati)
Deve essere utilizzato un sufficiente numero di
femmine in modo che vi siano almeno 20 femminegravide per ogni gruppo di dose.
Tempo di somministrazione tale da esporre le madri nel
periodo di organogenesi (6-15 gg per ratti e topi, 6-18 gg per conigli)
La sostanza viene soministrata direttamente con unsondino endogastrico (come richiesto da EPA) x un
calcolo pi preciso della quantit3 livelli di dose (dose pi elevata non pi del 10%
mortalit nelle madri)
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Colture cellulari
Test possibili:
Vitalit e citotossicitCancerogenesi e mutagenesi
9COLTURE MICROBICHE9COLTURE DI CELLULE ANIMALI O VEGETALI
Isolamento di cellule dal
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tessuto, separazione eallestimento di colture cellulari
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Transfezioni transienti e stabili
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Transfezioni transienti e stabili
La trasformazione di cellule animali mediata dal DNAavviene in due fasi distinte temporalmente
1
trasfezione
Introduzione
del DNA
nella cellula
2
integrazione
incorporazione
eventuale nel
genoma
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7/27/2019 Farmacologia preclinica
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Espressione transitoria medianteEspressione transitoria mediante coco--precipitazioneprecipitazione con fosfato di calciocon fosfato di calcio
2X HEBS
pRC/CMV
CD-8 (pLEU)
CarrierCaCL2
Incubazione per 36-72h
a 37C
Dynal Beads
A B
A + B
Particelle sintetiche che
possiedeono in superficie
anticorpi per i recettori CD8
co-espressi con il gene da
studiare (gene reporter utile
per identificare le cellule in
cui avvenuta la trasfezione)
Utilizzare cellule che non esprimono
il gene da inserire
Plasmide contenente il gene
Si aggiunge il DNA alle cellule
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7/27/2019 Farmacologia preclinica
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Metodo del calcio-fosfato
Molto usato
Le cellule incorporano facilmente gli acidi nucleiciquando si presentano sotto forma di un precipitato
di complessi DNA-calcio fosfato.
Da ottimi risultati sia per transfezioni transienti
che permanenti
ESPRESSIONE ETEROLOGA DI PROTEINE
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7/27/2019 Farmacologia preclinica
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Permette di fare esprimere ad una linea cellulare la proteina che si vuole studiare
attraverso il trasferimento del gene codificante la proteina (trasfezione genica).
Cellule al 70% di confluenza
Plasmide contenente il cDNA
codificante la proteina
Incubazione
per qualche ora
Dopo 24 ore, le cellule
esprimono la proteina.
Dopo 3-4 giorni,lespressione cessa.
Trasfezione transitoriaIl gene penetra in cellu la
ma non si integra nel genoma
Incubazione con antibiotico
Solo le cellule esprimenti
il gene di resistenza sopravvivono
Gene di resistenza ad un antibiotico
Selezione clonale
Isolamento di un clone
Il clone deriva
da una cellula unica.
Sono tutte uguali
alla cellula madre,
Esprimono tutte la proteina
Trasfezione
permanenteIl gene si integrato
nel genoma della cellu la
esempio
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7/27/2019 Farmacologia preclinica
66/70
Effetti della mexiletina sulla corrente al Na+ misurata mediante la tecnica del patch-clamp da canali WT e mutati (paralisi periodica ipercaliemica A1156T, miotonia potassio-
aggravata G1306E, paramiotonia congenita R1448C)
I canali mutati sono stati espressi transientemente in cellule tsA201 e la corrente al Na+ stata misurata 36-72 ore dopo la trasfezione
Mex, antiaritmico, blocca la corrente al sodio, voltaggio-dipendente, usata anche nelle patologiedel muscolo scheletrico (miotonie da sodio e da cloro) caratterizzate da ipereccitabilit
Il farmaco ugualmente efficace su A1156T, meno efficace su G1306E e pi efficace su R1448C
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7/27/2019 Farmacologia preclinica
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Saggi per valutare lattivit deifarmaci
attivit analgesicaantiaggregante
antiinfiammatoriaantiepiletticaantiipertensiva
broncodilatatoriaantitussivaecc.
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7/27/2019 Farmacologia preclinica
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valutazione dellefficacia delle proprietproprietanalgesicheanalgesiche di determinate sostanze(Taber 1974)
Test piastra calda (hotTest piastra calda (hot plateplate oo tailtail flickflick))nei roditorinei roditori
test sensibili ai composti oppiaceitest sensibili ai composti oppiacei
Tail flickattraverso stimolazione termica si rilevano risposte di tipo riflessoHot platesi ritiene si tratti di risposte intenzionali ovvero mediate a livello centrale
Test dellTest dellhothot plateplate
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7/27/2019 Farmacologia preclinica
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Test dellTest dell hothot plateplate
fu descritto per la prima volta da Woolfe e MacDonald, 1944 persaggiare la sensibilit al dolore di topi e ratti
Consiste nel mettere un roditore su una superficie riscaldata emisurare lintervallo di tempo (latenza) che intercorre prima che siverifichi una determinata risposta (es. leccarsi la zampa)
Il tutto per un periodo di tempo generalmente non superiore a 60 sec
la temperatura della superficie meno di 50C, temperatura che non
arreca danni alla pelle del roditore
numerosi studi sul comportamento animale si prefiggono di ridurreulteriormente tale temperatura
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7/27/2019 Farmacologia preclinica
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Il test consiste nella valutazione dei tempi di
latenza misurati nei gruppi di animali
introdotti al test
Analisi dei risultati
Test statistici
Conclusione sugli effetti dei farmaci