Università degli Studi

di Napoli Federico II

“Una mela al giorno toglie … il medico di torno!”

Il concetto di salute oggi

… il mantenimento

dello stato di ben-essere e bell-essere

per piacere ed accettarsi”

“La salute è un completo stato di benessere

fisico,mentale e sociale e non soltanto

l’assenza di malattia…

Aspettativa di vita

Qualità della vita

Non solo ‘anni alla vita’ ma anche ‘vita agli anni’

‘Ciascun uomo desidera vivere a lungo, ma nessun uomo desidera invecchiare’ J. Swift

Come prevenire una malattia?

Farmaci

60% MEDICINA D’INIZIATIVA

40% MEDICINA D’ATTESA

Nutraceutica

I nutraceutici: Potenziale spazio terapeutico

Nutraceutico 1989 - Sthephen De Felice

Un alimento, o parte di esso, che dà effetti

benefici alla salute inclusa la prevenzione e/o il trattamento di una malattia

e che associa all’alta digeribilità e alla ipoallergenicità,

le proprietà curative di principi attivi naturali, di comprovata e riconosciuta efficacia:

“beyond diet, before drug”

Da alimenti funzionali a nutraceutici

I nutraceutici: Potenziali ambiti terapeutici

Malattie dell’apparato gastrointestinale

Malattie dismetaboliche e del sistema

cardiovascolare

Prevenzione obesità

Prevenzione cardiopatie

Prevenzione dislipidemie

Prevenzione diabete

Prevenzione stress ossidativo

Mela Annurca Campana IGP

Mela Annurca Campana IGP

ALIMENTO

ATTIVITA’ BIOLOGICO- FUNZIONALE

STUDIO DEI MECCANISMI D’AZIONE complesso e composti singoli

FRAZIONAMENTO BIOGUIDATO

IDENTIFICAZIONE DEI COMPOSTI RITENUTI

RESPONSABILI

STUDIO DEL PROFILO METABOLICO E IDENTIFICAZIONE DEI COMPOSTI

RESPONSABILI HPLC-MSn/NMR

FORME DI DOSAGGIO

MESSA A PUNTO DI NUOVI PRODOTTI:

integratori, alimenti destinati a fini medici speciali o

dispositivi medici

MICROBIOLOGIA- FARMACOLOGIA- BIOLOGIA

TECNOLOGIA FARMACEUTICA

Target epidemiologico

Trial Clinico

Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) con aggiunta di:

10% di siero bovino fetale

100 U/mL di penicillina

100 µg/mL di streptomicina a 37 °C in un’atmosfera umidificata al

5% di CO2.

1 µg estratto polifenolico

M. Pumila Miller

cv Red Delicious

M. Pumila Miller

cv Pink Lady

M. Pumila Miller

cv Fuji

M. Pumila Miller

cv Golden Delicious

* Raiola at al.(2012) modificata

I campioni di mela (20 g) mescolati con: - 6 mL di saliva artificiale e 290 mg di α-amilasi. pH soluzione → 6,8 con HCl 0,1 N. La miscela è introdotta in un sacchetto di

plastica con 40 ml di acqua , omogeneizzata in Stomacher 80 Microbiomaster per 3 min.

Digestione Salivare Digestione Gastrica Digestione Intestinale

Determinazione del profilo polifenolico: digeriti analizzati mediante HPLC-DAD-MS

Allestimento beuta con aggiunta di : 0,5 g di pepsina (14.800 U) in HCl 0,1 N

pH regolato a 2,0 con HCl 6 N miscela incubata a 37 ° C in

agitatore orbitale Polymax 1040 (250 rpm) per 2 h.

pH aumentato a 6,5 con NaHCO3 0,5 N

aggiunti 5 ml miscela : pancreatina (8,0 mg / ml) sali biliari (50,0 mg / mL) (1:1 v / v) disciolti in 20 mL H₂O incubato a 37 ° C in un agitatore

orbitale (250 rpm) per 2 h

Buccia Polpa

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Salivare Gastrica Intestinale Transepiteliale Salivare Gastrica Intestinale Transepiteliale

mg/

10

0 g

fw

Procianidine

Rutina

Florizina

Studio in vitro Interazione con proteine plasmatiche

Soluzioni base: 20 mM HEPES (pH 7,5), 0,9% NaCl, 0,5 M NaHCO3

Soluzione di proteine plasmatiche costituita da: HAS, 42 mg/ml;

HDL, 1450 mg/ml; LDL, 780 mg/ml, VLDL, 120 mg/ml.

Polifenoli incubati con proteine plasmatiche per 30 min a 37 °C.

Campioni centrifugati a 25 °C per 30 min a 14000 x g.

Determinazione frazione polifenolica libera:

surnatanti estratti con miscela acetonitrile-acqua (84:16; v/v)

ed analizzati mediante HPLC

HSA HDL LDL VLDL

Procianidine 18.1 ± 0.9 58.7 ± 1.6 16.2 ± 1.1 0.4 ± 0.3

Rutina 56.5 ± 1.5 17.1 ± 1.0 19.6 ± 0.3 0.5 ± 0.1

Florizina 55.9 ± 2.0 16.8 ± 1.2 18.9 ± 0.8 0.4 ± 0.5

Interazione in vitro polifenoli proteine plasmatiche

Binding > 92%

HDL principale lipoproteina plasmatica che lega procianidine Brunet, et al. Human Apo A-I and rat transferrin are the principal plasma proteins that bind wine catechins.

Journal ofAgricultural and Food Chemistry, 50, 2708–2712. (2002).

↑ trasporto colesterolo periferico al fegato Jonas F.

Regulation of lecithin cholesterol acyl transferase activity.

Progressin Lipid Research, 37, 209–234 (1998).

Procianidine evitano l’ossidazione delle HDL

Annurca RD GS F GD

Dimers 28.3 ± 1.1 7.24 ± 0.7 11.13 ± 0.8 10.06 ± 0.7 8.70 ± 0.7

Trimers 9.06 ± 0.8 8.02 ± 0.9 12.57 ± 1.1 11.14 ± 1.0 8.64 ± 0.9

Tetramers 3.83 ± 0.5 5.68 ± 0.4 8.75 ± 0.7 7.88 ± 0.6 6.12 ± 0.5

Pentamers 5.20 ± 0.2 3.84 ± 0.2 5.87 ± 0.5 5.34 ± 0.4 4.62 ± 0.2

Procyanidin polymers 17.5 ± 1.8 16.8 ± 0.9 24.3 ± 1.3 23.4 ± 1.4 20.2 ± 1.2

Total procyanidins 62.91 ± 2.1 41.61 ± 1.8 62.40 ± 1.9 57.80 ± 1.0 51.70 ± 0.9

* Values are expressed as % ± SD; n = 5; results were significantly different at a level of P = 0.001.

RD: Red Delicious; GS: Granny smith; F: Fuji; GD: Golden Delicious.

Composizione della frazione procianidinica

di differenti cultivar di mele

Trial clinico: "Studio doppio-cieco verso placebo, cross-over, randomizzato, a gruppi paralleli,

monocentrico, sull’effetto di 5 varietà di MELE sull’ assetto lipidico"

250 soggetti sani - età 18-69 - colesterolo totale 200-260 mg/dL

suddivisi

5 gruppi/(28 uomini – 22 donne)

Red Delicious (RD)

Granny smith (GS)

Fuji (F)

Golden Delicious

(GD)

Annurca

1 mela/200g die (due annurche/100gx2 die) x 30/60 giorni

Treatment Pre-treatment Post-treatment Variation (%)

Annurca 239.1 ± 11.9 219.2 ± 12.8 -8.4

Red Deliciuos 235.9 ± 13.7 228.5 ± 14.2 -2.9

Granny Smith 237.6 ± 14.3 227.2 ± 13.5 -4.5

Fuji 235.5 ± 13.3 230.8 ± 14.1 -2.3

Golden Delicious 238.4 ± 15.3 235.3 ± 11.9 -1.1

Subjects consumed either one apple/day (two Annurca apples/day), for 2 months.

Value are means ± SD (n = 5).

Results were significantly different at a level of P = 0.001.

.

Effetto delle mele sul colesterolo totale

Effetto delle mele sui livelli di LDL

Treatment Pre-treatment Post-treatment Variation (%)

Annurca 208.2 ± 11.7 183.01 ± 10.9 -14.5

Red Delicious 206.5 ± 12.3 202.6 ± 11.3 -5.8

Granny Smith 209.3 ± 11.6 203.4 ± 10.8 -8.3

Fuji 204.8 ± 11.1 202.3 ± 11.7 -4.7

Golden Delicious 207.4 ± 11.6 205.7 ± 12.0 -2.6

Subjects consumed either one apple/day (two Annurca apples/day) for 2 months.

Value are means ± SD (n = 5).

Results were significantly different at a level of P = 0.001.

Effetto delle mele sui livelli di HDL

Treatment Pre-treatment Post-treatment Variation (%)

Annurca 38.5 ± 7.2 44.3 ± 7.9 +15.2

Red Delicious 37.9 ± 8.1 39.5 ± 7.5 +4.2

Granny Smith 35.4 ± 6.7 37.6 ± 8.0 +4.5

Fuji 36.7 ± 7.5 37.7 ± 6.8 +4.1

Golden Delicious 34.2 ± 6.9 34.7 ± 6.4 +2.6

Subjects consumed either one apple/day (two Annurca apples/day) for 2 months.

Value are means ± SD (n = 5).

Results were significantly different at a level of P = 0.001.

.

2 capsule (400 mg)/die per un periodo di 30/60 giorni

Applemets Trial clinico:

"Studio doppio-cieco verso placebo, cross-over, randomizzato, a gruppi paralleli, monocentrico,

sull’effetto dell’estratto polifenolico della mela Annurca sull’assetto lipidico"

116 Uomini (età 31-81) (TC: 214.1 – 254.3; HDL-C: 31.5 – 45.8; LDL-C: 189.5 – 206.1)

134 Donne (età 30-83) (TC: 215.0 – 251.1; HDL-C: 31.3 – 43.7; LDL-C: 192.6 – 205.2)

UOMINI Colesterolo tot. HDL-C LDL-C

t 0 t 30 t 60 t 0 t 30 t 60 t 0 t 30 t 60

Media ponderata 234.2 180.3 179.4 38.6 56.5 56.9 197.8 128.4 127.8

Variazione % -25.1 -25.6 +50.5 +50.4 -38.2 -38.4

DONNE Colesterolo tot. HDL-C LDL-C

t 0 t 30 t 60 t 0 t 30 t 60 t 0 t 30 t 60

Media ponderata 233.0 181.1 180.7 37.5 54.9 55.2 198.9 130.3 129.7

Variazione % -24.6% -24.4 +49.1 +48.7 -37.8 -38.0

250 soggetti sani - età 30-83 - colesterolo totale 214-254 mg/dL, razza bianca

-65

-60

-55

-50

-45

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

10

15

20

Δ%

TC

pazienti (n = 250)

Variazione (%) TC dopo 30/60 giorni

Riduzione Colesterolo Totale

Valore medio = -25.0 %

-75

-70

-65

-60

-55

-50

-45

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

10

15

20

Δ%

LD

L-C

pazienti (n = 250)

Variazione (%) LDL-C dopo 30/60 giorni

Riduzione Colesterolo LDL

Valore medio = -38.1 %

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

Δ%

HD

L

pazienti (n = 250)

Variazione (%) HDL-C dopo 30/60 giorni

Incremento Colesterolo HDL

Valore medio = +49.7 %

Table 6 Colesterolo Totale Effects of Annurca supplement (AMS) on plasma cholesterol, glucose and triglyceride metabolism in men subgroup

according to TC.

Men 214-229 Δ (%) Men 230-245 Δ (%) Men 246-254 Δ (%)

TC

(mg/dL)

t 0 222.1 ± 10.2 233.1 ± 12.3 248.0 ± 12.5

t 30 169.2 ± 12.5 -23.2 176.3 ± 10.4 -25.3 181.2 ± 14.3 -27.1

t 60 169.7 ± 13.0 -23.0 176.6 ± 11.1 -25.2 181.6 ± 13.1 -27.0

HDL-C

(mg/dL)

t 0 41.1 ± 3.8 38.9 ± 5.3 35.6 ± 4.2

t 30 59.6 ± 4.2 +45.0 58.7 ± 6.1 +50.3 55.2 ± 4.4 +55.1

t 60 60.0 ± 3.7 +46.1 58.7 ± 4.8 +50.5 55.5 ± 6.1 +55.0

LDL-C

(mg/dL)

t 0 165.3 ± 12.7 180.6 ± 13.1 195.1 ± 12.7

t 30 104.4 ± 13.2 -36.9 110.6 ± 12.8 -38.9 116.3 ± 13.3 -40.5

t 60 104.8 ± 12.6 -36.3 112.3 ± 12.8 -37.5 117.6 ± 11.7 -39.3

Glucose

(mg/dL)

t 0 109.7 ± 11.1 113.4 ± 11.8 111.2 ± 14.1

t 30 108.9 ± 12.9 -0.9 112.2 ± 12.5 -1.2 110.5 ± 11.8 -0.8

t 60 109.8 ± 13.6 -0.1 113.7 ± 10.3 +0.3 111.6 ± 12.7 +0.3

Triglycerides

(mg/dL)

t 0 100.2 ± 11.9 90.9 ± 9.3 97.6 ± 11.1

t 30 101.0 ± 12.4 +0.8 92.6 ± 11.2 +1.7 98.7 ± 11.4 +0.8

t 60 101.5 ± 11.7 +1.3 91.3 ± 10.6 +0.4 98.2 ± 10.2 +0.6

Subjects were administered with 2 AMS capsules/day for 2 months.

Value are means ± SD (n = 5).

Results were significantly different at a level of P = 0.001.

Table 7 Età partecipanti allo studio Effects of Annurca supplement (AMS) on plasma cholesterol, glucose and triglyceride metabolism in men subgroup

according to age.

Men 30-45 Δ (%) Men 46-60 Δ (%) Men 61-83 Δ (%)

TC

(mg/dL)

t 0 228.6 ± 11.5 233.6 ± 12.8 240.1 ± 13.1

t 30 174.4 ± 12.5 -23.9 175.7 ± 13.8 -24.8 176.2 ± 14.1 -26.9

t 60 174.6 ± 13.0 -23.6 175.3 ± 12.3 -25.1 175.7 ± 12.5 -26.8

HDL-C

(mg/dL)

t 0 42.8 ± 3.7 39.1 ± 6.2 34.2 ± 5.3

t 30 61.4 ± 4.4 +43.2 58.6 ± 5.2 +49.1 54.1 ± 4.8 +58.1

t 60 62.1 ± 3.8 +45.3 59.0 ± 5.1 +50.7 53.3 ± 6.2 +56.2

LDL-C

(mg/dL)

t 0 168.9 ± 13.0 181.1 ± 14.5 192.4 ± 13.8

t 30 109.1 ± 12.7 -35.4 110.8 ± 12.0 -38.8 112.5 ± 14.4 -41.5

t 60 108.3 ± 12.9 -35.9 111.7 ± 13.8 -38.3 112.0 ± 12.9 -41.8

Glucose

(mg/dL)

t 0 107.2 ± 13.8 112.9 ± 13.6 113.4 ± 11.9

t 30 106.2 ± 12.5 -0.9 111.2 ± 12.4 -1.2 112.2 ± 13.1 -1.5

t 60 106.7 ± 14.6 -0.5 114.4 ± 10.9 +1.3 114.4 ± 10.3 +0.9

Triglycerides

(mg/dL)

t 0 98.2 ± 10.5 91.1 ± 10.3 99.4 ± 10.3

t 30 98.5 ± 11.2 +0.3 91.7 ± 12.8 +0.7 100.2 ± 13.0 +0.8

t 60 99.5 ± 11.8 +1.3 91.2 ± 11.6 +0.1 99.6 ± 11.5 +0.2

Subjects were administered with 2 AMS capsules/day for 2 months.

Value are means ± SD (n = 5).

Results were significantly different at a level of P = 0.001.

AST (GOT) (U/L) ALT (GPT) (U/L) γ-GTP (U/L) ALP (U/L)

t 0 t 30 t 60 t 0 t 30 t 60 t 0 t 30 t 60 t 0 t 30 t 60

Media ponderata 21.6 21.5 21.5 27.9 27.5 27.6 37.2 36.2 34.4 222.6 220.4 215.9

Variazione % -0.5 -0.5 -1.4 -1.1 -2.7 -7.5 -0.98 -3.0

Tossicità epatica/renale

LDH (U/L) Albumina (g/dL) Bilirubina Tot. (mg/dL) Creatinina (mg/dL)

t 0 t 30 t 60 t 0 t 30 t 60 t 0 t 30 t 60 t 0 t 30 t 60

Media ponderata 177.0 176.5 170.2 4.31 4.32 4.16 0.57 0.57 0.54 0.84 0.82 0.80

Variazione % -0.28 -3.84 +0.23 -3.48 - -5.26 -2.38 -4,76

Trial clinico:

"Studio doppio-cieco verso placebo, cross-over, randomizzato, a gruppi paralleli,

monocentrico, sull’effetto dell’estratto polifenolico della mela Annurca sull’assetto lipidico"

Estratto polifenolico di "Melannurca Campana IGP"

Profilo lipidico di pazienti trattati con Atorvastatina o con Nutraceutico

Mela Annurca

TC LDL-C

HDL-C

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

50

60

Δ (

mg/

dL)

Atorvastatina

NUT

Sviluppi Futuri

Effetti Concomitanti…..

Effetto di AppleMets Hair sulla crescita dei capelli

Effetto del trattamento per via sistemica

Dopo 30 gg con 2caps/die

Effetto del trattamento per via sistemica

dopo 60 gg con 2caps/die

Effetto di AppleMets Hair sulla crescita dei capelli

Inizio trattamento

2 cps/die Dopo 30 gg

2 cps/die Dopo 60 gg

2 cps/die

Effetto del trattamento

per via sistemica

Dopo 120 gg

2 cps/die

AppleMets hair

… il mantenimento

dello stato di ben-essere e bell-essere

per piacere ed accettarsi

Grazie per l’attenzione