RICERCA DEI MICOBATTERI NEL SANGUE

L’infezione tubercolare

• I micobatteri vengono liberati nell’aria, all’interno di goccioline di saliva (droplet nuclei), dai soggetti affetti da tubercolosi polmonare

• I droplet <5μm rimangono a lungo in sospensione nell’aria e, se inalati, possono raggiungere gli alveoli polmonari

• Negli alveoli i micobatteri vengono fagocitati dai macrofagi non attivati ma riescono a moltiplicarsi al loro interno uccidendoli

• Il processo flogistico e l’attivazione dei macrofagi riescono, nella grande maggioranza dei casi, ad arginare l’infezione con formazione del processo primario

• Nel 5% dei casi si instaura la malattia tubercolare (primaria)• La tubercolosi (post-primaria) può manifestarsi, nel 5% degli infetti,

per riattivazione del processo primario in seguito all’abbassamento delle difese immunitarie

Il Mycobacterium tuberculosis nel sangue

• Una breve fase batteriemica può aversi durante l’infezione primaria allorché alcuni micobatteri possono passare nel torrente circolatorio, per via linfatica, e raggiungere i distretti più disparati

• Una fase batteriemica prolungata si ha nelle forme disseminate (tubercolosi miliare)

Le micobatteriosi

• Le infezioni da micobatteri non tubercolari si acquisiscono dall’ambiente

• La via di ingresso può essere respiratoria o alimentare• La malattia si instaura soltanto in presenza di fattori

predisponenti fra le quali il principale è l’abbassamento delle difese immunitarie

• Forme più comuni:– respiratoria (terza età)– linfoghiandolare (infanzia)– intestinale (AIDS)– disseminata (AIDS)

• Nella forma disseminata si ha micobatteriemia prolungata

Breve storia dell’emocoltura per micobatteri

• 1917    M. C. Clough. The cultivation of tubercle bacilli from circulating blood in miliary tuberculosis. Am.Rev.Tuberc.

• 1932 L. Shapiro. The frequency of bacillemia in tuberculosis. Am.Rev.Tuberc. • 1935 K. A. Jensen. Report on investigations regarding the Loewenstein

technique of culturing tubercle bacilli from blood. Acta Tuberc.Scand. • 1980 W. Landau, J. Feczko, and R. L. Kaplan. Radiometric detection of

mycobacteria in routine blood cultures. J.Clin.Microbiol. • 1983 J. L. Elliott, W. L. Hoppes, M. S. Platt, J. G. Thomas, I. P. Patel, and A.

Gansar. The acquired immunodeficiency syndrome and Mycobacterium avium-intracellulare bacteriemia in a patient with hemophilia. Ann.Intern.Med.

• 1984 L. Srtockman, G. D. Roberts, and D. M. Ilstrup. Effect of storage of the Du Pont lysis-centrifugation system on recovery of bacteria and fungi in a prospective clinical trial. J.Clin.Microbiol.

• 1988 M. B. Agy, C. K. Wallis, J. J. Plorde, L. C. Carlson, and M. B. Coyle. Evaluation of four mycobacterial blood culture media: BACTEC 13A, Isolator/BACTEC 12B, Isolator/Middlebrook agar, and a biphasic medium. Diagn.Microbiol.Infect.Dis.

Il prelievo

• Campione di sangue– direttamente nel flacone solo con i flaconi dedicati ai

micobatteri• problema dei flaconi radioattivi

– in assenza di flaconi dedicati• in provetta (almeno 5 ml) con eparina• in provetta con SPS

• Numero di prelievi– tre, preferibilmente in giorni diversi e prima dell’inizio

della terapia; ininfluente il momento del prelievo

• Conservazione del prelievo– a temperatura ambiente, anche per alcuni giorni

Diagnostica delle micobatteriemie

• Esame microscopico (inutile)• Esame colturale

– primi approcci rudimentali – semina dopo lisi-centrifugazione– semina diretta in terreno liquido

dedicato

• Amplificazione genica (problematica)

La lisi-centrifugazione

• Anticoagulante SPS, saponina• Centrifugazione per 30 min• Aspirazione e scarto del

supernatante• Semina del sedimento su:

– terreno solido (possibilità di conta)– terreno liquido o bifasico

I terreni liquidi per emocoltura

• Semina diretta– BACTEC 13A– BacT ALERT MB Blood– BACTEC MYCO/F Lytic

• permette anche l’isolamento dei miceti

• Semina previa lisi-centrifugazione– Middlebrook 7H9– BACTEC 12B– BacT ALERT MP Process– ESP Myco

I sistemi automatici

• BACTEC 460TB– radiometria: liberazione di CO2 radiomarcata

• MB/BacT Alert 3D – refrattometria: variazione dell’intensità luminosa di

un raggio in seguito alla riflessione su un sensore di CO2

• BACTEC, serie 9000/F– fluorimetria: emissione di fluorescenza da parte di un

sensore di O2

• ESP II– pressometria: rilevamento della diminuzione di

pressione conseguente al consumo di O2

Sintesi delle procedure di laboratorio 1

• Eventuale trasferimento nel flacone da emocoltura

• Incubazione per 60 gg. o fino al momento della positivizzazione

• In caso di positività strumentale– preparato microscopico, per mettere in evidenza

microorganismi alcol-acido resistenti• in caso di positività del vetrino, semina su terreno specifico

per micobatteri

– semina su terreno non specifico per micobatteri e non selettivo, per evidenziare eventuali contaminazioni

– ripresa dell’incubazione in caso di negatività del preparato e della coltura

• Test di ibridizzazione mediante DNA-probe sulle colonie micobatteriche cresciute nella subcoltura– M. tuberculosis complex

• identificazione biochimica a livello di specie• antibiogramma

– identificazione come micobatterio non tubercolare appartenente ad una delle 15 specie di più frequente isolamento

– identificazione come micobatterio non tubercolare non appartenente a nessuna delle 15 specie di più frequente isolamento

• identificazione a livello di specie mediante HPLC o test biochimico-colturali

Sintesi delle procedure di laboratorio 2

Emocolture “non negative”

• Fra campioni segnalati come positivi dall’apparecchio automatico sono incluse– le vere positività– le “contaminazioni”– le false positività transitorie

Interpretazione dei risultati

• Non essendo i micobatteri presenti sulla cute, in caso di positività dell’emocoltura per micobatteri, la contaminazione del campione non è ipotizzabile ed anche un solo isolamento è da ritenersi significativo

Emocolture per micobatteri eseguite negli ultimi 12 anni

0 200 400 600 800 1000 1200

1991

1992

1993

1994

1995

1996

1997

1998

2000

2001

2002

Percentuali di positività

1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002

0

2

4

6

8

10

12

percentuale di positività test eseguiti (centinaia)

Mycobacterium avium complex

0

10

20

30

40

50

1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 2000 2002

MAC-X M. intrecellulare M. avium

Mycobacterium tuberculosis

0

1

2

3

4

5

6

7

8

1992 1993 1995 1996 1997 1998 1999 2001 2002

Altri micobatteri

0

2

4

6

8

1992 1993 1994 1995 1996 1997 2001 2002

M. kansasii

M. celatum

M. xenopi

M. genavense

Tempi di positivizzazione, in settimane

I1%

II34%

III26%

IV6%

VI6%

VII5% VIII

6% >VIII4%

V12%

Cinetica di crescita di alcune specie micobatteriche

1020

3040

5060

0

200

400

600

800

1000

GI

giorni

M. genavense M. tuberculosis M. avium

Infezioni micobatteriche e livello dei linfociti CD4+

0100200300

400500

CD4/ml

tempo

M. tuberculosis

MAC

Considerazioni sulla nostra casistica

• Le prime micobatteriemie sono comparse con qualche anno di ritardo rispetto agli USA

• Nei primi anni si isolava quasi esclusivamente il M. tuberculosis

• Repentina impennata dei MAC negli anni centrali dell’ultimo decennio del secolo scorso

• Nessun ritardo, per l’isolamento di altre specie micobatteriche, rispetto ad altri paesi

• Con l’introduzione degli inibitori delle proteasi, gli isolamenti di MAC, peraltro già in flessione, sono quasi scomparsi

• Ancora tutta da valutare l’inattesa impennata di isolamenti dell’ultimo anno

Coltura del sangue mestruale

• Sistema di elezione per la diagnosi di annessiti tubercolari

• Raccolta sterile problematica• Alte percentuali di

contaminazioni

Conclusioni• Dopo gli incrementi vertiginosi degli anni ’90 la richiesta

sembrava essersi stabilizzata; nell’ultimo hanno ha presentato però un brusco incremento

• La percentuale di positivizzazione oscilla attorno al 1% • Probabilmente c’è spazio per una riduzione delle richieste, ma

l’utilità dell’emocoltura per micobatteri non è in discussione • Gli isolamenti di M. avium sono stati drasticamente

ridimensionati dai progressi nella terapia anti-retrovirale• Gli isolamenti di M. tuberculosis sono rimasti pressoché invariati• Gli isolamenti di altre specie sono diventati eccezionali• Non è possibile prescindere dall’impiego di terreni liquidi • La consuetudine di eseguire il test su tre campioni non sembra

giustificata• L’ incubazione dovrebbe essere prolungata fino ad otto

settimane