UNIVERSITA’ degli STUDI di BARI - farmacia.uniba.it · Tecniche che sfruttano l’impiego di...
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BARI, 7 dicembre 2010
UNIVERSITA’
degli STUDI di BARIDPARTIMENTO FARMACO-BIOLOGICO
SEZIONE DI FARMACOLOGIA
Facoltà
di
FARMACIA
Prof.ssa Diana Conte Dr.ssa Roberta Capogrosso
CORSO DI DIDATTICA LIBERA IN:
FARMACOLOGIA PRECLINICA:TECNICHE ED ANALISI PER LA SPERIMENTAZIONE DEI FARMACI
ESPERIMENTI SU ORGANI ISOLATI
Tecniche che sfruttano l’impiego di tessuti prelevati (organi isolati) rivestono una notevole importanza:- Dati soddisfacenti in tempi relativamente brevi
- Valutazioni di parametri funzionali
QUALITA’ DEI DATI:• STATO DI FUNZIONALITA’
• CONSERVAZIONE DEL TESSUTO ISOLATO
PARTICOLARE ATTENZIONE A :
•MODALITA’ DI PRELIEVO DEL TESSUTO
•COMPOSIZIONE DELLE SOLUZIONI FISIOLOGICHE IN CUI I PREPARATI VENGONO MANTENUTI PER L’INTERA DURATA DELL’ ESPERIMENTO
•MANTENERE INTEGRA LA LORO FUNZIONALITA’ DEVONO ESSERE OSSIGENATI (ossigeno puro, o miscela di 95% O2 e 5% CO2 o in altri casi semplicemente aria) E MANTENUTI AD UNA TEMPERATURA FISIOLOGICA
IL TESSUTO, UNA VOLTA ISOLATO:
TRASFERITO IN BAGNI PER ORGANI ISOLATI della CAPACITA’: 2.5 – 50 mL
UN’ESTREMITA’ DEL TESSUTO VIENE POI FISSATA ALL’INTERNO DEL BAGNO E L’ALTRA ESTREMITA’ AD UN TRASDUTTORE CHE CONSENTE DI REGISTRARE LE VARIAZIONI DI TENSIONE
Il muscolo può sviluppare forza:
TIPI DI CONTRAZIONE
AUMENTANDO LA PROPRIA LUNGHEZZA
Contrazione eccentrica
IN CONDIZIONE STATICA
Contrazione isometrica
Contrazione eccentrica: il muscolo si contrae allungandosi.Contrazione eccentrica: il muscolo si contrae allungandosi.
RIDUCENDO LA PROPRIA LUNGHEZZA Contrazione isotonica
MUSCOLI ESAMINATI
SOLEO muscolo a fibre lente
EDL muscolo a fibre veloci
DIAFRAMMA muscolo a fibre lenti/veloci
ALLESTIMENTO CAMPIONI
• Prelievo muscolo/organo
• Vengono ricreate le condizioni fisiologiche:
-Miscela 95% O2 e 5% CO2 (pH: 7.20-7.40)
- Soluzione di Ringer normale (RN) con composizione: NaCl 148mM; KCl 4,5mM; CaCl2 2,0mM; MgCl2 1,0mM; NaHCO3 12,0mM; NaH2PO4 0,44mM e Glucosio 5,5 mM
• Il campione viene fissato opportunamente mediante filo di sutura e poi inserito nella camera di registrazione
• Il muscolo viene poi tirato da un trasduttore alla lunghezza per cui il muscolo sviluppa la massima forza di contrazione
SOLUZIONE DI RINGER NORMALE (RN)
I SALI ESSENZIALI O MEGLIO I LORO IONI, DEVONO ESSERE SEMPRE PRESENTI
Le grosse variazioni degli ioni essenziali fanno sentire la loro influenza sulla reattività dell’organo
Na+: quando il tasso di Na+ è molto basso nelle cellule non entra più Na+ a sufficienza durante il potenziale d’azione ed il preparato diventa meno eccitabile
K+: l’ alta concentrazione di K+ rende i preparati miocellulari più eccitabili
Ca2+: un aumento del Ca2+ aumenta la contrazione dei preparati muscolari
Mg 2+: riduce l’eccitabilità del sistema nervoso vegetativo, perciò si abbassa il tasso di Mg 2+ quando si vogliono aumentare i movimenti autonomi generati dai neuroni periferici
Cl-: una sua diminuzione depolarizza la membrana cellulare e facilita l’insorgenza di stimoli autogeni
NaHPO4 e NaHCO3 :fungono da correttivi intervengono sulla regolazione del pH
Importanza del pH:
Ionizzazione dei Sali nel RN Ionizzazione del farmaco
Reattività dell’organo
Temperatura: è utile al fine di mantenere sopravvivente un organo isolato
REGISTRAZIONE DI CONTRAZIONE ISOMETRICA
Contrazione singola Contrazione singola ……il muscolo il muscolo èè stimolato a 40V con impulsi di 0,2ms.stimolato a 40V con impulsi di 0,2ms.
2.332362
2.628766
2.925170
3.221575
g
Ptw
TTP RT
Parametri cinetici di contrazione: TTP (tempo di raggiungimento del picco di contrazione) e RT (tempo di rilassamento del muscolo)
Forza di contrazione singola Ptw sPtw = Ptw /CSA CSA: m/D*Lo* (Lf/Lo )
seconds -1.036585
0.472561
1.981707
3.490854
g
Cha
nnel
2
Contrazione tetanica Contrazione tetanica ……Il muscolo Il muscolo èè stimolato con un treno di impulsi della durata stimolato con un treno di impulsi della durata di 350di 350--1200ms a diverse frequenze1200ms a diverse frequenze
REGISTRAZIONE DI CONTRAZIONE ISOMETRICA
Po
Forza di contrazione tetanica Po (g) sPo (KN/ m2) = Po /CSA CSA: m/D*Lo* (Lf/Lo )
-0.113269
5.000000
10.113269
15.226537
g
Cha
nnel
1
Fatica muscolare Fatica muscolare ……Il muscolo Il muscolo èè stimolato con un stimolato con un traintrain di tetani di tetani a ~100/120 Hz per 5mina ~100/120 Hz per 5min
REGISTRAZIONE DI CONTRAZIONE ISOMETRICA
ESEMPI DI POSSIBILI BERSAGLI
Canali al Na+
Canali al Ca2+ voltaggio dipendenti
SERCA
Canali al Cl-
Intervengono nel excitation-contraction
coupling
ESEMPI DI POSSIBILI FARMACI/ MODULATORI
Anestetici locali
Nifedipina
Tapsigargina
9-antracene acido carbossilico
APPLICAZIONI FARMACOLOGICHE…
Incubazione del 9-antracene acido carbossilico (9AC) per 30min….
inibisce specificatamente ClC-1
seconds -0.032494
6.645004
13.322502
20.000000
RT: 2 sec
seconds -1.036585
0.472561
1.981707
3.490854
g
Cha
nnel
2
RT: 80 msec
In patologie come DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE (DMD)
Parametri Contrattili Alterati Dalla Patologia
Migliorie Dovute Al Trattamento In Vivo Di Sostanze Testate Su Modelli Animali
Valutare Differenze Muscolari In Condizioni Patologiche E Controllo
MDX: modello animale della DMDMDX: modello animale della DMD
Multiple pathological events in exercised dystrophic mdx mice are targeted by pentoxifylline: outcome of a large array of in vivo and ex vivo testsRosa Burdi,1,* Jean-François Rolland,1,* Bodvael Fraysse,1 Karina Litvinova,1 Anna Cozzoli,1
Viviana Giannuzzi,1 Antonella Liantonio,1 Giulia Maria Camerino,1 Valeriana Sblendorio,1,2 Roberta Francesca Capogrosso,1 Beniamino Palmieri,2 Francesca Andreetta,3 Paolo Confalonieri,3
Leonarda De Benedictis,4 Monica Montagnani,4 and Annamaria De Luca1
J Appl Physiol 106: 1311-1324, 2009
Non si osserva alcuna variazione dei parametri cinetici di contrazione
Contrazione singola Contrazione singola ……il muscolo il muscolo èè stimolato a 40V con impulsi di 0,2ms.stimolato a 40V con impulsi di 0,2ms.
Contrazione tetanica Contrazione tetanica ……Il muscolo Il muscolo èè stimolato con impulsi della durata di stimolato con impulsi della durata di 350350--1200ms a diverse frequenze1200ms a diverse frequenze