BARI, 7 dicembre 2010

UNIVERSITA’

degli STUDI di BARIDPARTIMENTO FARMACO-BIOLOGICO

SEZIONE DI FARMACOLOGIA

Facoltà

di

FARMACIA

Prof.ssa Diana Conte Dr.ssa Roberta Capogrosso

CORSO DI DIDATTICA LIBERA IN:

FARMACOLOGIA PRECLINICA:TECNICHE ED ANALISI PER LA SPERIMENTAZIONE DEI FARMACI

ESPERIMENTI SU ORGANI ISOLATI

Tecniche che sfruttano l’impiego di tessuti prelevati (organi isolati) rivestono una notevole importanza:- Dati soddisfacenti in tempi relativamente brevi

- Valutazioni di parametri funzionali

QUALITA’ DEI DATI:• STATO DI FUNZIONALITA’

• CONSERVAZIONE DEL TESSUTO ISOLATO

PARTICOLARE ATTENZIONE A :

•MODALITA’ DI PRELIEVO DEL TESSUTO

•COMPOSIZIONE DELLE SOLUZIONI FISIOLOGICHE IN CUI I PREPARATI VENGONO MANTENUTI PER L’INTERA DURATA DELL’ ESPERIMENTO

•MANTENERE INTEGRA LA LORO FUNZIONALITA’ DEVONO ESSERE OSSIGENATI (ossigeno puro, o miscela di 95% O2 e 5% CO2 o in altri casi semplicemente aria) E MANTENUTI AD UNA TEMPERATURA FISIOLOGICA

IL TESSUTO, UNA VOLTA ISOLATO:

TRASFERITO IN BAGNI PER ORGANI ISOLATI della CAPACITA’: 2.5 – 50 mL

UN’ESTREMITA’ DEL TESSUTO VIENE POI FISSATA ALL’INTERNO DEL BAGNO E L’ALTRA ESTREMITA’ AD UN TRASDUTTORE CHE CONSENTE DI REGISTRARE LE VARIAZIONI DI TENSIONE

PREPARATI ISOLATI

MUSCOLO SCHELETRICO

APPLIC

AZIO

NI FA

RM

AC

OLO

GIC

HE

MUSCOLO

Unità contrattile

MUSCOLO SCHELETRICO

Il muscolo può sviluppare forza:

TIPI DI CONTRAZIONE

AUMENTANDO LA PROPRIA LUNGHEZZA

Contrazione eccentrica

IN CONDIZIONE STATICA

Contrazione isometrica

Contrazione eccentrica: il muscolo si contrae allungandosi.Contrazione eccentrica: il muscolo si contrae allungandosi.

RIDUCENDO LA PROPRIA LUNGHEZZA Contrazione isotonica

ESPERIMENTI DI CONTRAZIONE ISOMETRICA SU ORGANO ISOLATO

MUSCOLI ESAMINATI

SOLEO muscolo a fibre lente

EDL muscolo a fibre veloci

DIAFRAMMA muscolo a fibre lenti/veloci

ALLESTIMENTO CAMPIONI

• Prelievo muscolo/organo

• Vengono ricreate le condizioni fisiologiche:

-Miscela 95% O2 e 5% CO2 (pH: 7.20-7.40)

- Soluzione di Ringer normale (RN) con composizione: NaCl 148mM; KCl 4,5mM; CaCl2 2,0mM; MgCl2 1,0mM; NaHCO3 12,0mM; NaH2PO4 0,44mM e Glucosio 5,5 mM

• Il campione viene fissato opportunamente mediante filo di sutura e poi inserito nella camera di registrazione

• Il muscolo viene poi tirato da un trasduttore alla lunghezza per cui il muscolo sviluppa la massima forza di contrazione

SOLUZIONE DI RINGER NORMALE (RN)

I SALI ESSENZIALI O MEGLIO I LORO IONI, DEVONO ESSERE SEMPRE PRESENTI

Le grosse variazioni degli ioni essenziali fanno sentire la loro influenza sulla reattività dell’organo

Na+: quando il tasso di Na+ è molto basso nelle cellule non entra più Na+ a sufficienza durante il potenziale d’azione ed il preparato diventa meno eccitabile

K+: l’ alta concentrazione di K+ rende i preparati miocellulari più eccitabili

Ca2+: un aumento del Ca2+ aumenta la contrazione dei preparati muscolari

Mg 2+: riduce l’eccitabilità del sistema nervoso vegetativo, perciò si abbassa il tasso di Mg 2+ quando si vogliono aumentare i movimenti autonomi generati dai neuroni periferici

Cl-: una sua diminuzione depolarizza la membrana cellulare e facilita l’insorgenza di stimoli autogeni

NaHPO4 e NaHCO3 :fungono da correttivi intervengono sulla regolazione del pH

Importanza del pH:

Ionizzazione dei Sali nel RN Ionizzazione del farmaco

Reattività dell’organo

Temperatura: è utile al fine di mantenere sopravvivente un organo isolato

ORGANO ISOLATO

STIMOLATORE

CAMERA DI REGISTRAZIONE

REGISTRAZIONE DI CONTRAZIONE ISOMETRICA

Contrazione singola Contrazione singola ……il muscolo il muscolo èè stimolato a 40V con impulsi di 0,2ms.stimolato a 40V con impulsi di 0,2ms.

2.332362

2.628766

2.925170

3.221575

g

Ptw

TTP RT

Parametri cinetici di contrazione: TTP (tempo di raggiungimento del picco di contrazione) e RT (tempo di rilassamento del muscolo)

Forza di contrazione singola Ptw sPtw = Ptw /CSA CSA: m/D*Lo* (Lf/Lo )

seconds -1.036585

0.472561

1.981707

3.490854

g

Cha

nnel

2

Contrazione tetanica Contrazione tetanica ……Il muscolo Il muscolo èè stimolato con un treno di impulsi della durata stimolato con un treno di impulsi della durata di 350di 350--1200ms a diverse frequenze1200ms a diverse frequenze

REGISTRAZIONE DI CONTRAZIONE ISOMETRICA

Po

Forza di contrazione tetanica Po (g) sPo (KN/ m2) = Po /CSA CSA: m/D*Lo* (Lf/Lo )

-0.113269

5.000000

10.113269

15.226537

g

Cha

nnel

1

Fatica muscolare Fatica muscolare ……Il muscolo Il muscolo èè stimolato con un stimolato con un traintrain di tetani di tetani a ~100/120 Hz per 5mina ~100/120 Hz per 5min

REGISTRAZIONE DI CONTRAZIONE ISOMETRICA

ESEMPIO DI CURVA FORZA-FREQUENZA: differenze tra fibre veloci e lente

P/P

o

ESEMPI DI POSSIBILI BERSAGLI

Canali al Na+

Canali al Ca2+ voltaggio dipendenti

SERCA

Canali al Cl-

Intervengono nel excitation-contraction

coupling

ESEMPI DI POSSIBILI FARMACI/ MODULATORI

Anestetici locali

Nifedipina

Tapsigargina

9-antracene acido carbossilico

APPLICAZIONI FARMACOLOGICHE…

Incubazione del 9-antracene acido carbossilico (9AC) per 30min….

inibisce specificatamente ClC-1

seconds -0.032494

6.645004

13.322502

20.000000

RT: 2 sec

seconds -1.036585

0.472561

1.981707

3.490854

g

Cha

nnel

2

RT: 80 msec

In patologie come DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE (DMD)

Parametri Contrattili Alterati Dalla Patologia

Migliorie Dovute Al Trattamento In Vivo Di Sostanze Testate Su Modelli Animali

Valutare Differenze Muscolari In Condizioni Patologiche E Controllo

MDX: modello animale della DMDMDX: modello animale della DMD

Multiple pathological events in exercised dystrophic mdx mice are targeted by pentoxifylline: outcome of a large array of in vivo and ex vivo testsRosa Burdi,1,* Jean-François Rolland,1,* Bodvael Fraysse,1 Karina Litvinova,1 Anna Cozzoli,1

Viviana Giannuzzi,1 Antonella Liantonio,1 Giulia Maria Camerino,1 Valeriana Sblendorio,1,2 Roberta Francesca Capogrosso,1 Beniamino Palmieri,2 Francesca Andreetta,3 Paolo Confalonieri,3

Leonarda De Benedictis,4 Monica Montagnani,4 and Annamaria De Luca1

J Appl Physiol 106: 1311-1324, 2009

Non si osserva alcuna variazione dei parametri cinetici di contrazione

Contrazione singola Contrazione singola ……il muscolo il muscolo èè stimolato a 40V con impulsi di 0,2ms.stimolato a 40V con impulsi di 0,2ms.

Contrazione tetanica Contrazione tetanica ……Il muscolo Il muscolo èè stimolato con impulsi della durata di stimolato con impulsi della durata di 350350--1200ms a diverse frequenze1200ms a diverse frequenze

DIFFERENZE TRA CONDIZIONE PATOLOGICA E CONTROLLO

IN UN AMPIO SCREENING DI FARMACI E’ POSSIBILE VALUTARE L’EFFICACIA DI TRATTAMENTI IN VIVO E IN VITRO CHE POSSANO MODULARE E MIGLIORARE

PARAMETRI FUNZIONALI CONTRATTILI NEL MUSCOLO SCHELETRICO, IN CONDIZIONE

FISIOLOGICA E PATOLOGICA

ORGANO ISOLATO