UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI TRIESTE Corso di …...Figura 1.4 - Rappresentazione schematica del...

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI TRIESTE

Corso di Laurea Magistrale in Farmacia

Tesi di Laurea Sperimentale in

FARMACOLOGIA

Nuovi peptidi antimicrobici

membranolitici: studi di citotossicità e

interazione con membrane modello

Laureanda: Relatore:

Francesca Grazioli Prof.ssa Sabrina Pacor

Correlatori:

Dott.ssa Filomena Guida

Dott. Tomislav Rončević

Anno Accademico 2017 – 2018

1

INDICE

1. INTRODUZIONE ................................................................................. 3

1.1 PEPTIDI ANTIMICROBICI ................................................................................................ 5

1.2 MECCANISMO D’AZIONE ............................................................................................... 8

1.2.1 BARREL-STAVE MODEL (Figura 1.4)..................................................................... 10

1.2.2 CARPET MODEL (Figura 1.5) ................................................................................ 11

1.2.3 TOROIDAL-PORE MODEL (Figura 1.6) .................................................................. 12

1.3 RESISTENZA BATTERICA............................................................................................... 14

1.4 SINTESI AMPs .............................................................................................................. 16

1.5 PROSPETTIVE FUTURE ................................................................................................. 17

1.6 PEPTIDI DERIVANTI DA RANE ...................................................................................... 22

1.6.1 KIADINE ............................................................................................................... 24

1.6.2 PEPTIDI SERIE P .................................................................................................... 30

2. SCOPO DELLA TESI ........................................................................ 33

3. MATERIALI E METODI .................................................................. 35

3.1 LINEE CELLULARI .......................................................................................................... 36

3.1.1 MEC-1 .................................................................................................................. 36

3.1.2 HaCat ................................................................................................................... 36

3.1.3 MCF-7 .................................................................................................................. 37

3.2 TAMPONI E TERRENI ................................................................................................... 37

3.2.1 TERRENO COMPLETO PER CELLULE IN SOSPENSIONE ........................................ 37

3.2.2 TERRENO COMPLETO PER CELLULE IN ADESIONE .............................................. 38

3.2.3 PBS: PHOSPHATE BUFFERED SALINE ................................................................... 38

3.3 ISOLAMENTO DI MONOCITI ........................................................................................ 38

3.4 GENERAZIONE DI MDM ............................................................................................... 39

3.5 ISOLAMENTO DI LINFOCITI .......................................................................................... 40

3.6 CONTA CELLULARE ...................................................................................................... 41

3.7 TEST MTT ..................................................................................................................... 43

3.8 SPETTROFOTOMETRO ................................................................................................. 45

3.9 TEST DI APOPTOSI/NECROSI........................................................................................ 46

3.9.1 PROTOCOLLO DEL TEST ....................................................................................... 49

2

3.10 CITOFLUORIMETRO E ANALISI DEI DATI ...................................................................... 49

3.11 LIPOSOMI .................................................................................................................... 52

3.11.1 PREPARAZIONE DEI LIPOSOMI ............................................................................ 53

3.12 BIACORE ...................................................................................................................... 54

4. RISULTATI E DISCUSSIONE ......................................................... 57

4.1 STUDI DI CITOTOSSICITÀ – TEST MTT .......................................................................... 59

4.1.1 MEC-1 – SERIE P .................................................................................................. 59

4.1.2 MEC-1 – CLARKINE .............................................................................................. 61

4.1.3 MEC-1 – KIADINE ................................................................................................. 62

4.1.4 MCF-7_ADR – SERIE P .......................................................................................... 64

4.1.5 HaCat – P1 e P6 ................................................................................................... 65

4.1.6 MONOCITI – P1 e P6 ............................................................................................ 66

4.1.7 LINFOCITI – P1 e P6 ............................................................................................. 67

4.1.8 MACROFAGI – P1 e P6 ......................................................................................... 68

4.1.9 ASSOCIAZIONE P1-P6 .......................................................................................... 70

4.2 MECCANISMO D’AZIONE ............................................................................................. 73

4.2.1 EFFETTO DEL TRATTAMENTO SULLA MORFOLOGIA CELLULARE ........................ 73

4.2.2 ANALISI DEL DANNO – APOPTOTICO O NECROTICO ........................................... 75

4.2.3 EFFETTO DEL PEPTIDE IN TERRENO COMPLETO ................................................. 77

4.3 STUDI DI INTERAZIONE CON MEMBRANE MODELLO– SURFACE PLASMON

RESONANCE ............................................................................................................................. 79

5. CONCLUSIONI .................................................................................. 93

GLOSSARIO ............................................................................................. 96

BIBLIOGRAFIA ....................................................................................... 98

RINGRAZIAMENTI .............................................................................. 104

3

1. INTRODUZIONE

4

Dalla scoperta della penicillina nel 1928 da parte di Fleming a oggi, molti sono gli

antibiotici ad essere stati identificati e impiegati, sia di origine naturale che sintetica.

Tuttavia, negli ultimi 20 anni, la scoperta di nuovi antibatterici ha subito un notevole

rallentamento, a discapito del costante e sempre maggiore bisogno di nuove molecole

capaci di combattere i microorganismi patogeni. Inoltre, la costante pressione selettiva e

la capacità del microbioma di evolvere, rende fondamentale lo sviluppo di nuovi

antibiotici e terapie. Infatti, gli organismi acquistano la capacità di resistere all’azione di

sostanze esogene che perdono la capacità di indurre danno o di causare la morte dei

microorganismi, portando così all’inefficacia degli ormai consolidati trattamenti.

Questo fenomeno ha un pesante impatto nella comunità mondiale ed è noto come

farmacoresistenza. [1]

Questo crescente bisogno ha spinto la ricerca verso nuove molecole, tra queste spiccano

i peptidi antimicrobici (AMPs – antimicrobial peptides o HDPs – host defense peptides)

grazie al loro potenziale terapeutico. Negli ultimi decenni sono stati identificati più di

2000 AMPs prodotti da diverse classi di organismi (animali, funghi, piante, batteri).

Nonostante questi peptidi siamo molto simili tra loro sia nella struttura che in altre

caratteristiche intrinseche alla molecola, differiscono invece per sequenza, meccanismo

molecolare d’azione e target. Oltre ad un effetto antimicrobico, è noto che queste

molecole abbiano attività immunomodulatoria, attività anti-biofilm e anticancerogena.

[2]

5

1.1 PEPTIDI ANTIMICROBICI

Gli AMPs sono molecole a basso peso molecolare, solitamente cariche positivamente.

Hanno sia un dominio idrofilico, che un dominio idrofobico, che facilità la solubilità

della struttura in mezzi acquosi e ne permette inoltre il passaggio attraverso membrane

lipidiche. [3] Gli AMPs in natura sono prodotti sia da traduzione dell’mRNA ad opera

del ribosoma, sia mediante sintesi non ribosomiale. I peptidi che vengono sintetizzati

attraverso questo meccanismo sono prodotti per la maggior parte nei batteri, mentre il

resto delle specie utilizza il meccanismo che coinvolge il ribosoma. Molti AMPs sono

prodotti come precursori inattivi e richiedono attivazione mediante proteolisi. [4]

Malgrado sia una classe piuttosto eterogenea di peptidi e la classificazione risulti

controversa, è tuttavia possibile identificare alcune caratteristiche comuni al fine di

creare una possibile suddivisione.

Una prima classificazione può essere fatta in base alla struttura secondaria/terziaria dei

peptidi. In questo modo vengono distinti quattro gruppi di AMP [5] [6] Figura 1.1:

α-elica anfipatica

β-foglietto

extended

forcella-β o loop/ random coil

Figura 1.1 – Rappresentazione grafica della struttura di peptidi antimicrobici appartenenti ai quattro gruppi: A-

alfa elica (maganina-2); B- beta foglietto (defensina); C- extended (indolicidina); D- loop (microcina) [7]

6

Quelli ad alfa elica assumono questa particolare conformazione in presenza sia di

membrane modello che di membrane naturali a causa delle loro caratteristiche

anfipatiche . Al contrario, quando poste in ambiente acquoso, tendono ad essere meno

stabili e a destrutturarsi. Es: melittina e LL-37.

Quelli a beta foglietto sono caratterizzati dalla presenza di due o più regioni a beta

foglietto stabilizzate da ponti disolfuro. Es. alfa-beta-gamma defensine.

Gli extended sono ricchi in glicina, arginina, istidina e non presentano una struttura

secondaria. Esempi: indolicidina, istatina, drosocina.

Quelli a loop hanno invece una struttura a forcella interconnessa da un beta turn di tipo

II. (Figura 1.2) Questa classe di peptidi è particolarmente stabile perché presenta dei

ponti disolfuro tra i beta strand. Alcuni esempi: tachiplesina, bactenecina.

Figura 1.2 - Rappresentazione grafica di un beta turn di tipo I e un beta turn di tipo II [8]

I peptidi sono attivi nei confronti di diverse classi di microorganismi patogeni, quali

batteri, virus e funghi. Esibiscono al contempo diverse attività, per cui la suddivisione in

classi non è così netta come mostrata in Figura 1.3. La maggior parte ha una diretta

attività contro batteri (AMPs – antimicrobial peptides), specialmente di origine

planctonica. Mostrano inoltre attività nei confronti di complessi organizzati di batteri,

quali biofilm (ABPs – antibiofilm peptides) e nei confronti di virus (AVPs – antivirus

peptides). Sono capaci inoltre di reclutare indirettamente il sistema immunitario (HDPs

– host defence peptides). Inoltre i CPPs (cell-penetrating peptides) possiedono la

7

capacità di traslocare all’interno della membrana trasportando piccole molecole (ad

esempio anche altri peptidi). [9]

Figura 1.3 – Rappresentazione schematica delle diverse attività dei peptidi [9]

I parametri chiave per avere una selettività nei confronti dei batteri sembrano essere

l’idrofobicità della molecola e la carica netta positiva: quando queste due caratteristiche

sono bilanciate sembra manifestarsi l’attività antimicrobica. La selettività di queste

molecole non dipende esclusivamente da queste caratteristiche, ma sembra riguardare

anche altri parametri, quali la dimensione della molecola, la sua struttura e la sua

capacità di aggregazione in soluzione o a contatto con le membrane. [10]

Tra i vari AMPs, benché appartengano alla stessa famiglia o siano isolati dagli stessi

organismi, sembra che sia più conservato l’aspetto funzionale, piuttosto che una

specifica sequenza amminoacidica. Molti AMPs non contengono acido aspartico o

acido glutammico, ma piuttosto amminoacidi cationici come lisina o arginina. [11]

Inoltre la glicina si trova frequentemente in posizione C-terminale o N-terminale come

“capping-agent”, per stabilizzare l’alfa elica e proteggerla da amino o carbossipeptidasi.

[12]

Nonostante l’idrofobicità faciliti la permeabilizzazione della membrana, se troppo

elevata può determinare sia la perdita dell’attività antimicrobica del peptide sia una

maggiore citotossicità. Questo perché peptidi che hanno una grande porzione idrofobica

sono meno solubili in soluzione acquosa e tendono quindi a interagire anche con le

8

membrane delle cellule eucariotiche. Un parametro correlato alla idrofobicità e

all’anfifilicità è l’angolo polare (Φ): misura la proporzione tra parte polare e parte non

polare di un peptide. In un ipotetico peptide ad alfa elica composto da residui idrofobici

su un lato e residui idrofilici dall’altro, l’angolo polare dovrebbe essere di 180°. Questo

parametro influenza inoltre la stabilità dell’interazione peptide-membrana. [11] Molti

peptidi naturali ad alfa elica hanno un angolo polare di 140°-180°. [12]

1.2 MECCANISMO D’AZIONE

Per quanto riguarda i peptidi antimicrobici, parlare di un solo meccanismo d’azione può

risultare alquanto riduttivo. Ad oggi, sono stati infatti scoperti diversi possibili

meccanismi d’azione che rendono ancora più interessante il loro possibile utilizzo come

nuova classe farmacologica.

Secondo Brogden et al. [13] l’uso del microscopio ha dato un contributo

nell’identificazione di alcuni dei diversi target cellulari, spingendoci ad affermare che

non hanno tutti lo stesso target o lo stesso meccanismo d’azione. In alcuni casi al danno

cellulare non segue immediatamente la morte dell’organismo, portando perciò a

ipotizzare che il danno alla membrana non sia direttamente correlato al killing, ma che

vi siano altri meccanismi intracellulari che vengano attivati. In altri casi invece, la morte

dell’organismo appare come diretta conseguenza del danno cellulare.

Gli studi di interazione con membrane modello hanno mostrato che esiste una

correlazione tra struttura primaria del peptide e attività, cosa che diventa estremamente

rilevante quando si tratta di disegnare e sintetizzare peptidi ab initio. Sapendo infatti che

a una certa composizione amminoacidica corrisponde probabilmente una certa attività, i

peptidi possono essere sintetizzati partendo dal loro probabile target molecolare, in

contrapposizione ai vecchi metodi dove si valutava prima l’effetto, per poi ricercare il

target molecolare. Questo permetterebbe dunque un’importante ottimizzazione del

processo di sviluppo e produzione di queste nuove molecole.

9

Un’altra tecnica molto usata riguarda il monitoraggio dei canali voltaggio dipendenti

presenti nelle membrane cellulari. La capacità dei peptidi di legarsi ed attraversare il

doppio strato fosfolipidico viene indagata misurando il voltaggio di una corrente che si

genera in seguito alla formazione di un poro.

Tra i vari AMPs sembrano esistere degli step comuni che portano alla morte della

cellula batterica, indipendentemente dallo specifico meccanismo d’azione del peptide e

dal tempo richiesto per questo.

Per prima cosa i peptidi vengono attratti dalla membrana batterica. L’attrazione sembra

di tipo elettrostatico: peptidici antimicrobici cationici vengono attratti dalla carica

negativa della membrana esterna dei batteri Gram negativi e dagli acidi teicoici presenti

sulla superficie dei Gram positivi.

Una volta che i peptidi vengono attratti, nei Gram negativi per prima cosa devono

attraversare l’LPS per poter interagire con la membrana esterna, mentre nei Gram

positivi devono attraversare lo spesso strato di peptidoglicano. Dopodiché, quando

interagiscono con il doppio strato fosfolipidico, lo fanno in due modi distinti: quando la

concentrazione dei peptidi è bassa, questi vengono legati parallelamente rispetto al

doppio strato fosfolipidico (S state). Quando invece è alta, i peptidi iniziano a orientarsi

perpendicolarmente (I state) e a inserirsi nella membrana formando dei pori.

La concentrazione del peptide alla quale si osserva lo stato I varia in base al tipo di

peptide e alla composizione del lipide.

Sono stati proposti modelli diversi per spiegare il meccanismo di permeabilizzazione

della membrana. Possono essere così riassunti:

10

1.2.1 BARREL-STAVE MODEL (Figura 1.4)

Figura 1.4 - Rappresentazione schematica del barrel-stave model [13]

La polimerizzazione sulla membrana di più alfa eliche porta alla formazione di un

complesso proteico che crea un’interruzione nella continuità della membrana

plasmatica, detto poro. La parte idrofilica del peptide delimita il centro del poro, mentre

la parte idrofobica è posta a contatto con i fosfolipidi.

11

1.2.2 CARPET MODEL (Figura 1.5)

Figura 1.5 - Rappresentazione schematica del carpet model [13]

I peptidi si dispongono parallelamente al doppio strato fosfolipidico e lo rivestono

completamente. Ad alte concentrazioni, i peptidi sono portati a distruggere il doppio

strato attraverso un’azione simil-detergente, che può portare anche alla formazione di

micelle.

12

1.2.3 TOROIDAL-PORE MODEL (Figura 1.6)

Figura 1.6 - Rappresentazione schematica del toroidal-pore model [13]

Secondo questo modello i peptidi si inseriscono all’interno del doppio strato forzando i

fosfolipidi a curvare verso l’interno del poro, portando alla formazione di un’apertura di

forma toroidale. Il tipo di poro differisce da quello che si forma secondo il modello

barrel-stave: in questo caso l’interno non è delimitato solamente dai peptidi, ma questi

si inseriscono all’interno del doppio strato facendo in modo che il core sia delimitato sia

dai peptidi che dalla testa idrofilica dei fosfolipidi. La parte polare del peptide è infatti

associata alla parte polare dei fosfolipidi e insieme delimitano il centro del poro.

13

I tre modelli, utilizzati per spiegare l’interazione del peptide con la membrana, non

devono essere arbitrariamente considerati come meccanismi d’azione separati. Essendo

l’interazione peptide-fosfolipide un’interazione di tipo dinamico, appaiono tra loro

correlati e in continua transizione.

I peptidi antimicrobici, oltre alla capacità di interagire con la membrana e portare alla

morte per lisi cellulare, possono causare il killing batterico agendo su target, sia intra

che extracellulari (Figura 1.7).

Figura 1.7 - Rappresentazione schematica dei possibili meccanismi d’azione intracellulari [13]

14

Gli AMPs possono portare, ad esempio, all’attivazione di fosfolipasi e autolisine, come

ad esempio la N-acetilmuramoil-L-alanina amidasi in Staphylococcus simulans.

Alcuni AMPs, come PR-39, possono inibire la formazione del setto e bloccare la

divisione cellulare, provocando così un allungamento della cellula. Altri inibiscono la

biosintesi del peptidoglicano, e dunque la sintesi della parete cellulare, interferendo con

la transglicosilazione. Altri ancora si legano a DNA e RNA. Alcuni bloccano l’uptake di

timidina, uridina e leucina, inibendo così la sintesi di DNA, RNA e proteine.

Per quanto riguarda l’attività degli AMPs un concetto fondamentale è rappresentato

dalla loro selettività nei confronti delle membrane delle cellule batteriche. In condizioni

fisiologiche, sembra che le cellule eucariotiche non siano sensibili all’azione dei peptidi

antimicrobici. È interessante notare che però, allo stesso tempo, le cellule tumorali

sembrano essere più suscettibili, presumibilmente a causa di un’elevata espressione di

molecole anioniche, quali fosfatidilserina, mucine O-glicosilate, gangliosidi sialilati ed

eparan-solfati. Questa alterazione nella composizione lipidica porta ad una parziale

perdita della asimmetria della membrana cellulare e ad un conseguente aumento del

potenziale negativo di membrana. [11]

1.3 RESISTENZA BATTERICA

Il legame peptide-fosfolipide sembra non essere specifico: essendo un’interazione di

tipo elettrostatico dipende in primis dall’attrazione tra carica positiva del peptide e

carica negativa della membrana dei batteri. Inoltre il peptide riesce a penetrare la

membrana grazie al fatto di avere una struttura anfifilica. Per questi motivi i batteri non

sembrano aver sviluppato molti meccanismi di resistenza, come accade invece per altre

molecole quali gli antibiotici di uso clinico. [3]

Nonostante questo, alcuni studi hanno evidenziato delle strategie che i microorganismi

col tempo hanno adottato per difendersi dall’attacco dei peptidi antimicrobici.

15

I diversi meccanismi di resistenza possono essere così riassunti:

Alterazione della carica della membrana

Lo Staphylococcus aureus esterifica la D-alanina all’acido teicoico: l’aggiunta di un

ammino gruppo basico porta così alla riduzione della carica netta negativa del gruppo

fosfato dell’acido teicoico, con conseguente alterazione della carica della membrana.

Inoltre, grazie a MprF (multiple peptide resistance factor), che codifica per LPG-

sintetasi (lisilfosfatidilglicerolosintetasi), aumenta la sintesi di LPG: un fosfolipide

basico contentente L-lisina. Questo porta ad un aumento della carica netta positiva con

conseguente effetto elettron-repulsore per i peptidi carichi positivamente.

In Salmonella typhimurium la carica negativa della membrana viene ridotta alterando la

composizione del lipide A dell’LPS (Figura 1.8): il gruppo fosfato della glucosamina I

(GLcN I) è sostituito da un residuo di fosforiletanolamina con un aminogruppo libero,

mentre al gruppo fosfato della glucosamina II (GlcN II) viene aggiunto

aminoarabinosio.

Figura 1.8 - Rappresentazione schematica del lipide A (in blu) [14]

16

Alterazione del Lipide A

Sempre in Salmonella typhimurium, la fluidità della membrana viene diminuita

aumentando il numero delle code aciliche del lipide A. Questo porta ad un aumento

delle interazioni idrofobiche tra le code e quindi ad una maggior rigidità della

membrana.

Alterazione delle proteine di membrana

In alcuni batteri Gram negativi, proteine mutate espresse nella membrana esterna

aumentano la resistenza verso i peptidi antimicrobici.

Ruolo dei trasportatori

I trasportatori che sono stati associati ad un aumento della resistenza sono quelli

appartenenti alla famiglia delle ABC (ATP Binding Cassette) che importano i peptidi

nella cellula favorendone la proteolisi, e quelli della famiglia RND (Resistance-

Nodulation-Division) che mediano invece l’efflusso dei peptidi.

Enzimi proteolitici

Grazie a questi enzimi i batteri possono degradare i peptidi. Lo S. aureus ad esempio

produce una metalloproteinasi denominata aureolisina capace di inattivare LL-37.

1.4 SINTESI AMPs

I peptidi antimicrobici vengono sintetizzati seguendo diverse tecniche [15]:

Sintesi biologica: sintesi in vitro o in vivo nella quale vengono utilizzati DNA

plasmidico o frammenti di DNA che codificano per il peptide di interesse.

Questo approccio risulta il più costoso per quanto riguarda una produzione su

larga scala. Richiede inoltre più passaggi di purificazione dato che attraverso

questa tecnica viene prodotto un complesso mix di peptidi.

Sintesi chimica: tecnica più utilizzata perché permette l’incorporazione di

componenti non-naturali. Le metodologie più comunemente utilizzate sono:

17

SPS (solution-phase synthesis): tecnica poco costosa nella quale gli

intermedi di reazione possono essere analizzati e purificati in ogni fase

del processo di sintesi. Risulta però essere un processo lungo e

complesso.

SPPS (solid-phase peptide synthesis): tecnica basata sull’accoppiamento

di amminoacidi protetti su un supporto insolubile. Tecnica adeguata per

una produzione su larga scala, anche se richiede molti materiali di

partenza.

Semi-sintesi: tecnica che combina sintesi biologica e sintesi chimica. Il peptide

biologicamente prodotto mediante tecnologia ricombinante viene

successivamente modificato attraverso metodi chimici/enzimatici.

Oggigiorno la sintesi è preceduta da studi di bioinformatica, mediante i quali, attraverso

database dedicati e algoritmi computazionali, si riescono ad avere informazioni

dettagliate riguardo punto isoelettrico, carica, coefficiente di estinzione e idrofobicità

del peptide. In questo modo si riesce a prevedere il comportamento del peptide con una

certa precisione.

1.5 PROSPETTIVE FUTURE

I peptidi antimicrobici presentano numerosi vantaggi. Molti AMPs, oltre alla loro

attività antimicrobica, intervengono nella modulazione del sistema immunitario:

inducono o inibiscono il rilascio di citochine e chemochine da differenti tipi cellulari.

Inoltre esibiscono un’attività chemotattica nei confronti di cellule del sistema

immunitario innato e adattativo. Possono essere quindi usati come immunomodulatori

per potenziare l’immunità. [16]

Gli AMPs permettono inoltre un’uccisione rapida e multitarget, portando a una minor

comparsa di fenomeni di farmaco resistenza. Presentano un ampio spettro d’azione:

hanno attività antibatterica, antivirale, antifungina e antiparassitaria (ad esempio nei

confronti di plasmodium, trypanosoma e leishmania) [17].

18

Per implementare l’efficacia di queste molecole, la ricerca si sta focalizzando sulla

possibilità di utilizzarle in co-somministrazione con i classici antibiotici, in modo da

ottenere così un effetto sinergico: si può sfruttare la capacità dei peptidi di

permeabilizzare la membrana batterica per permettere all’antibiotico di entrare nella

cellula più facilmente ed aumentare così la sua concentrazione. [6] Un esempio

esplicativo è riportato in Figura 1.9.

Figura 1.9 – Rappresentazione schematica del sinergismo tra un AMPs e la ciprofloxacina (inibitore DNA girasi). Nell’esempio il meccanismo di resistenza del batterio è rappresentato da una pompa di efflusso. Il peptide permette all’antibiotico di entrare nella cellula e di raggiungere concentrazioni maggiori nel citoplasma, dove è presente il suo

target. [6]

D’altro canto però, ci sono anche degli svantaggi legati allo sviluppo di AMPs come

farmaci. Da un punto di vista commerciale, i costi effettivi di una produzione su larga

scala di AMPs diventano considerevoli. Bisogna tener conto infatti dei costi relativi alla

sintesi e alla selezione. È stato stimato che la produzione di 1g di peptide costa dai 100

ai 600 $ [7].

19

Essendo dotati di un meccanismo d’azione non selettivo, questo può portare allo

sviluppo di tossicità sistemica o locale. Nel loro utilizzo come trattamenti farmacologici

vanno considerate le condizioni fisiologiche in vivo: le concentrazioni di composto che

riescono a raggiungere il sito d’infezione, la presenza di eventuali sistemi proteolitici

inattivanti (lisozima) e le concentrazioni fisiologiche di sali, siero e pH che possono

causarne una diminuzione dell’attività. Inoltre sono stati descritti fenomeni di

sensibilizzazione legati ad un uso ripetuto. Vanno valutate inoltre tutte le variabili

riguardanti la farmacocinetica e la farmacodinamica. [18]

Sfortunatamente, data la loro natura peptidica, gli AMPs vengono riassorbiti dal tratto

gastrointestinale se somministrati per os, mentre c’è la possibilità di scatenare una

risposta immunitaria indesiderata nel caso di somministrazione ev. Per questo motivo,

ad oggi, gli AMPs vengono studiati come formulazioni topiche per il trattamento di

infezioni della pelle o delle ferite. [19]

I punti chiave su cui ci si sta focalizzando per migliorare la produzione di nuovi farmaci

basati sui peptidi antimicrobici riguardano:

Stabilità

Tossicità

Costi di produzione

In Figura 1.10 sono riportate alcune delle strategie che oggigiorno sono adottate per

migliorare i principali problemi legati alla produzione.

Per quanto riguarda la stabilità, per proteggere il peptide dall’azione di proteasi

endogene, si ricorre alla ciclizzazione della struttura, attraverso il collegamento del

dominio N-terminale con il C-terminale. Si può ricorrere inoltre all’introduzione di D-

aminoacidi o aminoacidi non naturali, dal momento che le proteasi riconoscono e

idrolizzano preferenzialmente L-aminoacidi naturali. Un’altra strategia riguarda

l’acetilazione del dominio N-terminale, che conferisce resistenza all’azione delle

proteasi, e/o l’amidazione del dominio C-terminale, che aumenta l’attività antimicrobica

del peptide, diminuendo al contempo l’attività emolitica, riducendo la carica negativa

della molecola. L’introduzione di aminoacidi come lisina o leucina, porta alla

modificazione dell’equilibrio anfipatico, influenzando la conformazione ad alfa-elica e

20

aumentando la stabilità della molecola. La rapida degradazione di AMPs è dovuta alla

presenza di residui cationici, come arginina o lisina, per cui una loro modificazione

porta a proteggere la molecola dall’azione litica della tripsina. Per esempio si possono

introdurre amminoacidi non naturali come N-Arg con la catena laterale spostata sull’N-

terminale per aumentarne la stabilità.

Per quanto riguarda i problemi legati alla tossicità nei confronti delle cellule dell’ospite,

l’idrofobicità e la carica sono utili indicatori e devono essere adeguatamente modulati.

Si può ricorre a peptidi disegnati ex novo target-specifici, come AMPs batterio-selettivi

(adepantina-1 [20]) o peptidi fusi costituiti da un dominio che riconosce il batterio e un

dominio che ha attività battericida. Altre strategie riguardano la nanoincapsulazione del

peptide tramite polimeri (nanosfere) o formulazioni lipidiche (nanovescicole

liposomiali), l’aggiunta di PEG (polietilenglicole) e l’uso di nuovi sistemi per il drug

delivery, come ad esempio l’uso di albumina da siero umano come carrier.

Un altro problema legato alla produzione di AMPs, sono gli eccessivi costi di

produzione. Strategie utili possono essere la riduzione della dimensione del peptide, la

sintesi ex novo e l’uso di metodi di purificazione più economici. Per ridurre la

dimensione del peptide si può ricorrere allo studio del meccanismo d’azione, che porta a

scoprire solo la minima sequenza attiva necessaria all’attività e al legame con il target.

Figura 1.10 - Strategie per lo sviluppo di nuovi farmaci basati sui peptidi antimicrobici [7]

21

Come riporta Brogden et al. [21], i ricercatori stanno adottando nuovi e sofisticati

approcci per superare questi ostacoli, in particolar modo focalizzando la produzione su

peptidi antimicrobici:

Mimetici: AMPs sintetici non peptidici che mimano AMPs naturali

Ibridi: costituiti dalle regioni attive di due o tre AMPs naturali

Congeneri: composti chimici correlati agli AMPs per composizione (ottenuti dal

rilassamento della loro struttura terziaria, dallo scambio di specifici residui

amminoacidici o dal taglio del dominio N-terminale o C-terminale, o dalla

combinazione dei precedenti)

Ciclici e stabilizzati: AMPs ciclici dati dalla congiunzione “head-tail”,

contenenti tre ponti disolfuro formanti un nodo di cisteine

Coniugati: AMPs coniugati con anticorpi specifici o con ligandi di specifici

recettori batterici

Immobilizzati: AMPs incorporati o assorbiti su materiali, quali plastiche, film,

resine

Ad oggi, alcuni peptidi di origine mammifera sembrano avere un potenziale per essere

impiegati in terapia: ad esempio LL-37, hBD-1, retrociclina per la prevenzione dell’HIV

e coniugati di protegrina-1. Pexiganina, un analogo di maganina-2 (un peptide isolato

dalla pelle di rana Xenopus laevis), si trova al momento in sperimentazione clinica in

fase III sottoforma di antibiotico topico (Locilex® - crema di pexiganina 0,8%,

Dipexium Pharmaceuticals co.) per il trattamento di lievi infezioni da piede diabetico.

Rappresenta inoltre un promettente candidato per il trattamento di ABSSSI (Acute

Bacterial Skin and Skin Structure Infections). [22]

22

1.6 PEPTIDI DERIVANTI DA RANE

Gli anfibi rappresentano una delle più abbondanti fonti di AMPs. Possiedono infatti

delle ghiandole, poste sulla pelle, ricche in peptidi antimicrobici con struttura ad alfa

elica. Ciascuna specie di rana esprime il proprio repertorio di AMPs (10-20 peptidi),

aventi differenti sequenze, dimensioni e spettro di azione, anche tra specie strettamente

correlate. Le ghiandole sierose degli Anuri producono vari AMPs implicati nella difesa

della pelle contro microorganismi nocivi presenti nell’ambiente. Questi peptidi

presentano un ampio spettro d’azione, che previene la comparsa di fenomeni di

resistenza. Rappresentano una classe eterogenea di peptidi, aventi però tre

caratteristiche in comune tra loro:

Carica netta positiva (presenza di aminoacidi basici)

Composti per il 50% da aminoacidi idrofobici

Tendenza a formare alfa-eliche anfipatiche e/o beta-foglietti in corrispondenza

di membrane fosfolipidiche

Gli AMPs, che sono stati caratterizzati fino ad oggi, sono stati trovati in 14 diverse

famiglie di rane appartenenti all’ordine Archeobatrachia e Neobatrachia. Sulla base

della loro sequenza amminoacidica sono stati suddivisi in più di 40 classi. Si osservano

differenze sia interspecie che intraspecie per quanto riguarda potenza e specificità. Ciò

suggerisce l’esistenza di un sistema di difesa a più livelli che conferisce il massimo

della protezione con un minimo dispendio energetico. [23]

I peptidi sono inizialmente sintetizzati nelle cellule multi-nucleate delle ghiandole

epiteliali come pre-pro-peptidi. Successivamente maturano e vengono conservati

all’interno dei granuli delle ghiandole. Ciascun precursore è il risultato della trascrizione

di un singolo locus genico che codifica per un unico peptide maturo. I precursori sono

costituiti generalmente da tre porzioni (Figura 1.11):

Sequenza segnale in posizione N-terminale

Sequenza acidica interposta che termina generalmente con Lys-Arg

Sequenza che costituisce il peptide maturo in posizione C-terminale

23

Figura 1.11 - Rappresentazione schematica di un pre-pro-peptide.[24]

È interessante notare che la regione pre-pro appare conservata all’interno delle diverse

specie, mentre i peptidi maturi risultano differenti. Questo suggerisce l’esistenza di uno

o più geni che derivano da un progenitore comune. [23]

Figura 1.12 - Schema rappresentativo di vari AMPs provenienti da anfibi [22]

In Figura 1.12 sono riportati alcuni dei più promettenti AMPs anfibi:

Pexiganina, un analogo di maganina-2 (un peptide isolato dalla pelle di rana

Xenopus laevis) [25] [26]

Dermaseptina, isolata dalle secrezioni epiteliali di rane Phyllomedusa, e

piscidina da teleostei, entrambe modificate mediante sostituzione di residui

amminoacidici non polari con lisina per implementare l’effetto antimicrobico e

minimizzare la citotossicità [27]

Temporina, isolato dall’epitelio di rana Pelophylax Saharica. [28]

24

1.6.1 KIADINE

Alcuni AMPs naturali causano effetti tossici nei confronti delle cellule dell’ospite: da

qui deriva la necessità di modificarli o in alternativa disegnarli ex novo, in modo da

aumentare l’attività contro i batteri, diminuendo o possibilmente annullando gli effetti

tossici. Fra i gruppi coinvolti in questo ambito, alcuni ricercatori del Dipartimento di

Scienze dell’Università di Spalato stanno lavorando ad un progetto di studio su peptidi

antimicrobici provenienti da Anuri. Questa classe di rane è particolarmente ricca in

HDPs: peptidi antimicrobici naturali ubiquitari. [29]. Sulla base di studi QSAR hanno

analizzato peptidi con struttura ad alfa elica per determinare un Indice di Selettività (SI)

che mettesse in relazione la MIC verso E.Coli con l’attività emolitica (SI=HC50/MIC).

Hanno successivamente inserito un parametro strettamente correlato con SI, ovvero

“Sequence Moment”, in un algoritmo computazionale validato (denominato “Designer”)

per selezionare nuovi peptidi ad alta selettività. Tra questi sono state selezionate le

adepantine (ADP – Automatically Designed Peptides): corti peptidi lineari ricchi in

residui di glicina/lisina altamente selettivi per i batteri Gram negativi e con bassa

tossicità emolitica. Grazie agli studi effettuati su questa classe, il gruppo ha ideato un

algoritmo capace di elaborare ed identificare AMPs attivi nei confronti di Gram

negativi, in particolare E. coli, con un alto SI. Questi AMPs interagiscono con

membrane neutre, invece di adottare una struttura ad alfa elica in presenza di membrane

cariche negativamente per permeabilizzarle, presumibilmente in base all’elevato

contenuto in glicina. Inoltre, la dimerizzazione gioca un ruolo significativo nella

modulazione sia dell’attività antimicrobica che della citotossicità verso le cellule

dell’ospite. [30]

Partendo dagli studi effettuati sulle adepantine, lo stesso gruppo di ricerca ha descritto

una nuova classe di peptidi ricchi in glicina/lisina, denominata Kiadine, progettate

mediante l’uso di un ulteriore algoritmo computazionale validato. Questi peptidi sono

stati ottenuti sia attraverso la modificazione di un peptide naturale denominato PGLa-H,

sia attraverso una sintesi ab initio mediante studi QSAR.

Il peptide PGLa-H, un frammento C-terminale di PGLa, isolato dalla pelle di rana

Xenopus laevis (da cui è stata isolata anche maganina-2), ha mostrato in vitro attività

25

antimicrobica contro E.coli e S.aureus (incluso MRSA) e bassa attività emolitica.

Forma una struttura ad alfa elica che sembra responsabile della formazione di pori sulla

membrana, causando un’alterazione della permeabilità e portando la cellula batterica a

morte. [31] [32]

Partendo dalla struttura di PGLa-H è stato disegnato un nuovo peptide costituito dalla

ripetizione di questo frammento, ovvero diPGLa-H o (PGLa-H)2. [33] Il peptide ha

mostrato in vitro attività antibatterica verso Gram negativi e Gram positivi, e bassa

tossicità verso le cellule dell’ospite (saggi di emolisi, vitalità cellulare e danno al DNA).

Partendo da diPGLa-H è stato disegnato un analogo, denominato Kiadina-1, contenente

una sostituzione di valina con glicina in una specifica posizione. (Figura 1.13) Questo

ha portato a un leggero miglioramento dell’attività antibatterica e a una riduzione

dell’attività emolitica, probabilmente correlata ad una maggiore flessibilità dell’alfa

elica.

Figura 1.13 - Struttura amminoacidica di PGLa-H, DiPGLa-H e Kiadina-1 a confronto [33]

I saggi di citotossicità e genotossicità sono stati effettuati su cellule isolate dal sangue e

su coltura primaria di fibroblasti umani. Dai risultati è emerso che Kiadina-1 causa una

minor emolisi rispetto a diPGLa-H ed entrambi i peptidi non sono tossici verso cellule

isolate dal sangue a concentrazioni significativamente superiori alla MIC. Al contrario,

possiedono una tossicità marcata verso i fibroblasti, sottolineando un diverso effetto

verso questo tipo di cellule. Per quanto riguarda l’aspetto conformazionale, entrambi i

peptidi mostrano un comportamento diverso: in ambiente acquoso presentano una

struttura random coil, mentre a contatto con le membrane cellulari transiscono verso

una struttura ad alfa elica, suggerendo inoltre un’associazione di più alfa eliche. (Figura

1.14)

26

Figura 1.14 – Rappresentazione delle diverse conformazioni assunte dai peptidi in ambienti diversi: F- diPGLaH in H20; G- kiadin in H20; H- diPGLaH in presenza di fosfolipidi; -I kiadin in presenza di fosfolipidi [33]

Sulla base di questi studi sono state disegnati ulteriori peptidi (Figura 1.15) [34]:

Kiadina 2 e Kiadina 3 da Kiadina 1

Kiadina 4, Kiadina 5 e Kiadina 6 sintesi ab initio

Figura 1.15 - Sequenza amminoacidica dei peptidi appartenenti alla serie delle Kiadine a confronto. In rosso sono evidenziati i residui di glicina [34]

La sequenza amminoacidica di Kiadina-2 (K2) è basata su quella di Kiadina-1 (K1): in

K2 Val5

e Gly15

sono invertite e per Kiadina-3 (K3) Gly occupa entrambe le posizioni (5

e 15). Kiadina-4, Kiadina-5 e Kiadina-6 presentano più modifiche nella sequenza

27

amminoacidica, rispetto al “template naturale”, essendo disegnate ab initio; in

particolare, K4 e K5 presentano 4 residui di Gly.

In seguito a simulazioni di dinamica molecolare che sono state effettuate su questi

peptidi è emerso che tutti i peptidi, tranne Kiadina-5, interagiscono con le membrane

modello anioniche LUVs dipendentemente dalla sequenza amminoacidica di cui sono

costituiti.

Potenza e selettività non dipendono solo dal numero di residui di glicina, che

conferiscono flessibilità conformazionale, ma anche dalla struttura anfipatica della

molecola in toto: un arrangiamento anfipatico simmetrico porta ad un aumento

dell’interazione con la membrana, con conseguente aumento sia dell’attività

antimicrobica che dell’attività citotossica.

Un alto contenuto in glicina, inoltre, porta ad una maggiore distensione della molecola

in soluzione acquosa e ad un aumento dell’instabilità della molecola: i peptidi che,

invece, mantengono stabilità in acqua, riescono a creare un legame più stabile con la

membrana (Figura 1.16).

Figura 1.16 - Rappresentazione della conformazione che i peptidi assumono in H2O ottenuta mediante simulazione

molecolare dinamica [34]

Dai risultati è emerso inoltre che la potenza non appare correlata esclusivamente alla

permeabilizzazione della membrana, ma riguarda anche il tempo di permanenza nel sito

d’azione. Si è notato che tutti i peptidi (tranne Kiadina-5) interferiscono con la crescita

batterica a concentrazioni sub-letali, ma il patogeno riesce comunque a detossificare la

sostanza e continuare a crescere, questo fino alla concentrazione corrispondente alla

MIC (Figura 1.17), alla quale si osservano pori e micellizzazione che causano la morte.

La permeabilizzazione appare tempo-dipendente e concentrazione-dipendente.

28

L’attività emolitica dipende dall’anfipaticità della molecola, in particolare dalla parte

idrofobica, e dalla capacità di mantenere una struttura ad afa elica che vada ad interagire

con la membrana.

29

Figura 1.17 - Valori di MIC, MBC e SI di Kiadine [34]

30

1.6.2 PEPTIDI SERIE P

Come citato precedentemente, gli Anuri, in particolare quelli appartenenti alla famiglia

delle Ranidae, sono caratterizzati da un genoma che codifica per molti AMPs. In

precedenza, l’identificazione di nuovi AMPs richiedeva l’uso di un numero

considerevole di rane, che venivano stimolate mediante noradrenalina (norepinefrina)

per ottenere AMPs, che venivano successivamente testati e purificati. Questo risultava

essere un processo lungo e da un punto di vista etico non così ottimale. Per questo

motivo, i peptidi appartenenti a questa classe, sono stati identificati mediante l’utilizzo

di un metodo alternativo, più rapido, efficiente e meno invasivo, che permette

l’identificazione simultanea di AMPs provenienti da più specie.

Come riporta Rončević et al. [35] i peptidi sono stati identificati da 5 differenti specie di

Ranidae (Pelophylax ridibundus, Pelophylax kl. esculentus, Rana dalmatina, Rana

temporaria e Rana arvalis). L’RNA è stato estratto dall’epidermide delle rane, è stato

successivamente sequenziato e sono state identificate le sequenze codificanti per AMPs.

I dati ottenuti sono stati elaborati e incrociati con diversi database (Database of Anuran

Defense Peptides (DADP) [29] e Sequence Read Archive (SRA) database [36]) come

conferma. Sono stati identificati 128 peptidi, 6 dei quali sono stati selezionati per essere

sintetizzati e testati come agenti antibatterici contro Gram negativi e Gram positivi.

I peptidi sono stati selezionati in base alla carica (da -1 a +6), all’idrofobicità e ad altri

aspetti legati alla struttura. I peptidi 3 (P3) e 4 (P4) contengono due residui di cisteina

formanti un ponte disolfuro. Tutti gli altri peptidi sono lineari. La sequenza

amminoacidica dei vari peptidi è riportata in Tabella 1-1.

31

Peptide Coding sequencea Sequence Charge

Peptide-1 rtemp_4.3_210 LVPFIGRTLGGLLARF-NH2 +4

Peptide-2 rtemp_4.6_20 FLGALGNALSRVL-NH2 +3

Peptide-3 rtemp_32_47 NNLRHIVAWCKNRNYSLAVCARFKPQ +6

Peptide-4 rdal_39_24 NLLGFLQGAKDILKECEADNYQGWLCESYKPQ -1

Peptide-5 rdal_8_600 FLGFVGQALNALLGKL-NH2 +3

Peptide-6 rarv_10.1_19 LLGAALSALSSVIPSVISWFQK-NH2 +3

Tabella 1-1 - Sequenza dei peptidi della serie P e caratteristiche chimico fisiche. a. il nome del peptide è composto

dalla prima lettera del genere della rana dal quale il peptide è stato identificato, seguita da 3 o 4 lettere che si

riferiscono al nome della specie. Il primo numero si riferisce al contig del peptide, mentre il secondo al numero di

reads che lo supportano. [35]

Da un punto di vista evoluzionistico, il peptide-1 (P1) e il peptide 2 (P2) da R.

Temporaria sembrano essere correlati alle temporine, esibendo una significativa

omologia, in particolare per quanto riguarda la regione propeptidica. Allo stesso modo,

anche il peptide-5 (P5), da R. Dalmatina, sembra essere correlato alle temporine. Il

peptide-6 (P6) invece, identificato da R.Arvalis, non è conforme a nessuna famiglia di

AMPs anuri. Allo stesso tempo, però, il gene che codifica per il peptide sembra essere

presente in singola copia in tutte le specie del genere Rana.

Gli studi di DC eseguiti sui peptidi, indicano che in soluzione acquosa si presentano

come random coil, tranne il peptide-3 (P3) e il peptide-4 (P4) che, avendo ponti

disolfuro, presentano una struttura più rigida. Da ciò ne deriva che probabilmente o la

loro interazione con le membrane è meno forte rispetto agli altri peptidi della serie, o

l’interazione non va ad influire sulla loro conformazione. Il peptide-1 (P1) sembra

essere più selettivo nei confronti delle membrane anioniche rispetto al peptide-6 (P6), il

quale mostra invece spettri molto simili sia in presenza di PG che di DOPC LUVs.

Dai test di MIC (minima concentrazione inibente) e MBC (minima concentrazione

battericida) eseguiti su S. aureus, E. faecalis, E. coli e A. baumannii, è emerso che i

peptidi 1 (P1), 2 (P2), 3 (P3), 4 (P4) e 5 (P5) hanno debole attività nei confronti dei

32

batteri. Il peptide 6 (P6) si è mostrato invece più efficace contro S. aureus, anche nei

confronti di isolati clinici (Tabella 1-2).

Bacterial strains

Peptide-6

MIC MBC

S. aureus ATCC 29213 4 4

S. aureus c.i. 8 16

E. faecalis ATCC 29212 16 16

E. coli ATCC 25922 >64 /

A. baumannii ATCC 19606 32 64

Tabella 1-2 - Valori di MIC e MBC di P6 [35]

Il peptide 6, identificato in Rana Arvalis, è capace di permeabilizzare la membrana

anche a concentrazioni inferiori alla MIC, e a concentrazioni corrispondenti alla MIC e

alla MBC causa evidente danno.

33

2. SCOPO DELLA TESI

34

Lo scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di studiare la citotossicità di nuovi

AMPs verso cellule eucariote in vitro e la loro interazione con membrane modello.

I peptidi sono stati progettati e sintetizzati all’Università di Spalato con cui è attiva una

collaborazione, ed in particolare con il Dott. Dott. Rončević Tomislav che li ha

caratterizzati e ha svolto le prove antimicrobiche preliminari.

Dato che questi peptidi esibiscono un’interessante attività antimicrobica, sono state

svolte le prove per determinare la tossicità su diverse linee cellulari eucariotiche e sono

stati eseguiti dei saggi atti a definire le curve dose-effetto per estrapolare il valore di

IC50.

Successivamente, è stato valutato anche il tipo di danno cellulare con cui questi peptidi

inibiscono le cellule in vitro, mediante tecnica citofluorimetrica.

Per fare ciò è stato necessario valutare il tipo di risposta cellulare alla presenza degli

AMPs, ossia valutare l’attivazione di due differenti pathway di risposta al danno:

L’apoptosi

La necrosi

Infine, poiché è descritto che le proprietà anfipatiche degli AMP ne promuovono

l’interazione con le membrane biologiche, ulteriore scopo di questa tesi è determinare

l’affinità o la costante cinetica dei peptidi più citotossici mediante studi SPR con

membrane modello.

35

3. MATERIALI E METODI

36

3.1 LINEE CELLULARI

Le cellule vengono mantenute in coltura all’interno di un incubatore ad una temperatura

di 37°C e pCO2 del 5%.

Per lavorare con le colture cellulari è necessario che vengano garantite condizioni di

sterilità nell’ambiente di lavoro, queste infatti sono mantenute mediante l’utilizzo di una

cappa a flusso laminare. Nella cappa è presente una lampada UV che ne permette la

sterilizzazione mediante un ciclo di 20-30 minuti effettuato all’inizio di ogni giornata.

3.1.1 MEC-1

Questa linea cellulare deriva da un paziente caucasico di 61 anni affetto da una leucemia

linfocitica cronica. [37] [38] La coltura è costituita da linfociti B neoplastici che

crescono in sospensione ed hanno un tempo di duplicazione di circa 40h, sono quindi in

attiva proliferazione. Le cellule vengono mantenute in flask in terreno completo (con

rosso fenolo). Il mantenimento della coltura viene eseguito con split 1:2 o 1:3 ogni 2 o 3

giorni (mantenendo le cellule a ≈ 200000/mL). La rimozione del terreno consumato

viene eseguita diluendo abbondantemente le cellule con tampone PBS, e successiva

centrifugazione (330xg per 5 minuti a 4°C). Si procede con la conta cellulare mediante

l’utilizzo del test di esclusione con Trypan Blue. Le cellule vengono poi messe in una

nuova flask con terreno fresco.

3.1.2 HaCat

È una linea cellulare derivante da cheratinociti umani immortalizzati. [39] [40] In vitro

queste cellule crescono adese alla flask formando un monostrato. Vengono mantenute

ad una concentrazione ≈ 200000/mL di terreno completo. Per il passaggio le cellule

devono essere staccate dalla flask: è stata utilizzata tripsina con EDTA (acido

etilendiamminotetracetico). Per il passaggio il terreno nella flask viene eliminato,

successivamente viene aggiunta la soluzione di tripsina per 10 minuti in incubatore a

37°C e successivamente vengono recuperate le cellule tripsinizzate e poste in tubo da

centrifuga con PBS e FBS. Se rimangono cellule adese nella flask si consiglia un

ulteriore recupero con tripsina o con PBS. Si procede con la centrifugazione a 300xg per

37

5 minuti a 4°C. Viene eliminato il surnatante, viene rotto il pellet e si procede con la

conta cellulare mediante l’utilizzo del Trypan Blue. Le cellule vengono poi messe in

una nuova flask contenente terreno fresco.

3.1.3 MCF-7

MCF-7 è una linea cellulare di cancro al seno isolata da una donna caucasica nel 1970.

Il nome deriva dall’istituto che ha prodotto la linea cellulare, il Michigan Cancer

Foundation [41, p. 7]. La coltura cresce in adesione formando un monostrato sulla

parete della flask. Viene mantenuta ad una concentrazione di ≈ 200000/mL di terreno

completo per cellule in adesione. Il passaggio viene effettuato analogamente a quanto

descritto per la linea cellulare HaCat.

3.2 TAMPONI E TERRENI

Le cellule vengono mantenute in proliferazione mediante l’utilizzo di terreni completi

contenenti siero per fornire i fattori di crescita necessari alla divisione continua delle

cellule. I terreni si distinguono in terreni per cellule in sospensione e terreni per cellule

in adesione.

3.2.1 TERRENO COMPLETO PER CELLULE IN SOSPENSIONE

Il terreno completo per cellule in sospensione è composto da:

RPMI 1640: contenente amminoacidi, vitamine, fosfato, potassio, magnesio e

calcio

10% FBS (siero fetale bovino)

2mM L-Glutamina

100 U-100 μg/mL penicillina-streptomicina

38

3.2.2 TERRENO COMPLETO PER CELLULE IN ADESIONE

Il terreno completo per cellule in adesione è composto da:

DMEM High Glucose

10% FBS (siero fetale bovino)

2mM L-Glutamina


3.2.3 PBS: PHOSPHATE BUFFERED SALINE

Il PBS viene utilizzato per fare tutti i lavaggi delle cellule.

È costituito da:

137 mM NaCl

2,7 mM KCl

8,1 mM Na2HPO4 2H2O

1,47 mM KH2PO4

Sali sciolti in acqua demineralizzata e successivamente la soluzione viene sterilizzata in

autoclave.

3.3 ISOLAMENTO DI MONOCITI

I monociti sono stati estratti a partire da buffy coat, ovvero concentrati di leucociti e

piastrine. Sono stati ottenuti mediante centrifugazione di sangue intero di donatori

volontari, privato del plasma e della maggior parte dei globuli rossi. I buffy coat

utilizzati sono provenienti da donatori sani della Banca del Sangue dell’Ospedale

Maggiore di Trieste.

Il contenuto del buffy coat è stato diluito in rapporto 1:1 con una soluzione tampone di

PBS-EDTA-glucosio (EDTA (etilendiaminotetraacetatotetrasodico) 1mM – glucosio

5mM). La sospensione ottenuta è stata poi stratificata su Histopaque 1077 in rapporto

39

1:2 e centrifugata per 30 minuti a 400xg a 18°C. Grazie al gradiente di densità si

formano un pellet con eritrociti/granulociti, banda all’interfaccia con linfo-monociti.

Viene prelevata la banda linfo-monocitaria e diluita 1:1 con PBS-EDTA-glucosio,

centrifugata a 400xg a 4°C per 5 minuti e lavata altre due volte in PBS, eliminando il

surnatante e riunendo i pellet. Le cellule vengono quindi contate con il Trypan Blue

mediante la camera di Burker. Dalla concentrazione totale di cellule si ricava la

concentrazione dei monociti, considerando come da formula leucocitaria la componente

monocitaria come ≈ 30% del totale delle cellule. Si prepara dunque una sospensione

cellulare in terreno di adesione (RPMI 1640 e HEPES 25 mM). Si procede quindi con

l’incubazione in termostato a 37°C, 5% CO2 per 90 minuti: in questo modo i monociti

aderiscono alla flask, mentre i linfociti rimangono in sospensione. Il surnatante viene

recuperato per ottenere i linfociti. Ai monociti adesi si aggiunge quindi il terreno

completo composto da:

RPMI-1640

Hepes 25mM pH 7.4

2mM L-Glutamina


10% FBS

Le flask sono dunque poste in incubatore a 37°C con 5% CO2 e le cellule sono

utilizzabili fino a 48h dalla data dell’estrazione.

3.4 GENERAZIONE DI MDM

I monociti che sono stati estratti dal sangue secondo la procedura descritta in

precedenza vengono differenziati in vitro in macrofagi aggiungendo al terreno di coltura

lo stimolo pro-infiammatorio (LPS).

Il terreno completo per l’ottenimento di cellule macrofagiche (MDM-LPS) è costituito

da:

40

RPMI-1640

Hepes 25mM pH 7.4

2mM L-Glutamina


10% FBS

LPS 10 ng/mL (soluzione di lipopolisaccaride ottenuto da E.Coli)

Le cellule vengono incubate in termostato a 37°C con 5% di CO2. Al terzo o al quarto

giorno di incubazione viene aggiunta la stessa quantità di terreno fresco con LPS alla

concentrazione 2x per mantenere costante la concentrazione finale. Le cellule sono

utilizzabili in sesta giornata.

3.5 ISOLAMENTO DI LINFOCITI

I linfociti vengono isolati a partire da buffy coat. Si esegue lo stesso procedimento usato

per l’isolamento dei monociti fino allo step di adesione in termostato per 90 minuti.

Dopo l’incubazione vengono recuperati i linfociti presenti nel surnatante e centrifugati a

400xg per 5 minuti a 4°C. Si elimina il surnatante e si procede con la conta cellulare

utilizzando il Trypan Blue e la camera di Burker. In seguito vengono seminate in

terreno completo per linfociti costituito da:

RPMI-1640

Hepes 25mM pH 7.4

2mM L-Glutamina


10% FBS

1mM aminoacidi non essenziali

1mM sodio piruvato

0,05 mM 2-mercaptoetanolo

Le flask sono dunque poste in incubatore a 37°C con 5% CO2 e le cellule sono

utilizzabili fino a 48h dalla data dell’estrazione.

41

3.6 CONTA CELLULARE

La conta cellulare viene effettuata mediante l’utilizzo del Trypan Blue (Figura 3.1): un

colorante derivato dalla toluidina con un peso molecolare di circa 960 Da.

Figura 3.1 – Struttura chimica del Trypan Blue [42]

Il TB è una molecola che risulta impermeabile alla membrana cellulare, di conseguenza

riesce a penetrare solo le cellule la cui integrità di membrana è compromessa. Una volta

all’interno si lega alle proteine intracellulari, facendo così apparire la cellula di colore

blu. Le cellule vitali assumeranno perciò una colorazione più chiara. [43]

Per procedere con la conta si utilizza come supporto la camera di Burker (Figura 3.2 e

Figura 3.3):

Figura 3.2 - Camera di Burker

42

La camera di Burker è un dispositivo formato da due griglie (una superiore e una

inferiore) e da un vetrino coprioggetti. La griglia è formato da 9 grandi quadranti,

ognuno della superficie di 1 mm2. Ogni quadrante è a sua volta suddiviso in 16

quadranti più piccoli aventi lato di 0,25 mm. Nel quadrante centrale più grande, ogni

quadrante più piccolo è a sua volta diviso in 16 piccoli quadranti. Per il conteggio delle

cellule si utilizza solitamente uno dei grandi quadranti posti agli angoli.

Inizialmente si pone parte del pellet con il Trypan Blue in rapporto 1:5 o 1:10.

Si procede ponendo una goccia di sospensione con il TB nel reticolo superiore e una nel

reticolo inferiore. Attraverso il microscopio si vanno a contare le cellule vitali

(colorazione più chiara) nei 4 quadranti di 0.25 mm posti ai 4 vertici del grande

quadrante, più un quadrante a caso tra i restanti. Si procede con la conta nello stesso

modo anche nel reticolo inferiore.

La concentrazione di cellule per millilitro viene calcolata mediante l’equazione:

𝑵°𝒄𝒆𝒍𝒍𝒎𝑳⁄ = (∑ 𝒖𝒑𝟓 + ∑ 𝒅𝒐𝒘𝒏𝟓 ) x 25 x1000 x FD

Dove con “Σ5 up” si intende la somma delle cellule vitali contate nel reticolo superiore,

“Σ5 down” la somma delle cellule vitali contate nel reticolo inferiore, e “FD” il fattore

di diluizione utilizzato per il TB.

Figura 3.3 – Rappresentazione schematica della camera di Burker e ingrandimento di una griglia

43

3.7 TEST MTT

Questo tipo di test sfrutta un metodo colorimetrico per un’analisi di tipo quantitativa

[44] [45] [46] e misura indirettamente la vitalità delle cellule. In questo progetto

abbiamo usato questo metodo per testare la citotossicità di alcuni peptidi antimicrobici,

espressa come IC50, concentrazione di composto alla quale viene inibito il 50% della

popolazione cellulare.

L’MTT (bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) è un sale di

tetrazolio che viene metabolizzato dall’enzima succinato deidrogenasi del mitocondrio

in sale di formazano blu (Figura 3.4).

Figura 3.4 - Reazione di riduzione dell'MTT ad opera della succinato deidrogenasi mitocondriale [47]

In questo modo si osserva un colore blu quando le cellule sono vitali e hanno quindi un

sistema metabolico capace di trasformare l’MTT in un sale blu, mentre si nota un colore

giallo quando le cellule, non più vitali e quindi con un mitocondrio non più funzionale,

non sono in grado di attuare questo processo.

Il vantaggio di utilizzare un test di tipo colorimetrico si collega alla rapidità e alla

precisione di questo metodo, evitando così l’utilizzo di sostanze che potrebbero esporre

l’operatore a rischi.

Il test è stato effettuato in piastre da 96 pozzetti a fondo piatto, sterili. In ogni pozzetto

sono stati immessi 90 μL di cellule in terreno completo. Il trattamento, costituito da 10

44

μL di peptidi in PBS diluiti all’opportuna concentrazione, è stato effettuato per ogni

pozzetto, ottenendo così un volume finale di 100 μL (nei pozzetti di controllo sono stati

aggiunti 10 μL di PBS). Nel caso della linea cellulare MEC-1 i peptidi sono stati

aggiunti subito dopo la semina delle cellule, nel caso invece della linea HaCat sono stati

aggiunti il giorno successivo per permettere alle cellule di aderire al pozzetto. La piastra

è stata poi posta in incubatore a 37°C con 5% CO2 per 24 ore. Nelle ultime 4 ore di

incubazione, in ogni pozzetto, sono stati messi 20 μL di MTT.

La soluzione di MTT è stata preparata sciogliendo 5mg di MTT per mL di PBS.

Successivamente è stata sterilizzata per filtrazione tramite una siringa con filtro da 0,22

μM e mantenuta a 4°C.

Trascorso il tempo necessario per l’incubazione dell’MTT, è possibile osservare al

microscopio i cristalli di formazano blu presenti nei pozzetti contenenti cellule vitali,

come mostrato in Figura 3.5 e Figura 3.6:

Successivamente in ogni pozzetto sono stati messi 100 μL di IGEPAL (tert-

octylphenoxy poly(oxyethylene)ethanol – (C2H4O)nC14H22O) con HCl 0,01 N per

solubilizzare i cristalli di formazano e la piastra è stata posta in incubatore overnight.

La lettura della D.O. della piastra è stata effettuata a una lunghezza d’onda di 620 nm.

Figura 3.6 - MEC-1 Figura 3.5 - HaCat

45

3.8 SPETTROFOTOMETRO

Per misurare l’assorbimento di una radiazione elettromagnetica si opera mediante

l’utilizzo di uno spettrofotometro.

Lo spettrofotometro (Figura 3.7) è costituito da:

Figura 3.7 Schematizzazione della struttura di uno spettrofotometro [48]

Sorgente: lampada che emette radiazioni con diverse lunghezze d’onda

Monocromatore: filtro che seleziona la lunghezza d’onda desiderata

Cella: compartimento contenente il campione in soluzione

Rilevatore: misura l’intensità della radiazione emessa

Il concetto si basa sulle seguenti formule:

T = 𝐼

𝐼0 A= − log 𝑇 A=log

𝐼0

𝐼

T = trasmittanza

I = intensità della luce incidente

I0 = intensità della luce trasmessa

A = assorbanza

E sulla legge di Lambert-Beer: A=εbc

ε=coefficiente di estinzione molare

b=cammino ottico

c=concentrazione

46

Secondo questa legge quando una radiazione monocromatica colpisce un campione,

parte della radiazione viene assorbita. L’assorbanza sarà perciò direttamente

proporzionale alla concentrazione della specie assorbente. Per questo motivo lo

spettrofotometro, che va a misurare dunque la radiazione assorbita, sarà necessario per

un’analisi di tipo quantitativo. Nel caso specifico del test MTT, la misurazione viene

effettuata alla lunghezza d’onda di 620 nm. Tenendo conto del picco di assorbimento

dell’MTT, maggiore sarà il valore di densità ottica (assorbanza) misurato, maggiore sarà

la concentrazione di sale di formazano nel campione (seguendo appunto la legge di

Lambert-Beer). Inoltre, sapendo che maggiore sarà la concentrazione di formazano,

maggiore sarà la vitalità cellulare, ne deriva di conseguenza che assorbanza e

percentuale di cellule vitali saranno dunque direttamente proporzionali (Figura 3.8).

D.O.

n° cell

3.9 TEST DI APOPTOSI/NECROSI

Questo test è stato effettuato mediante l’utilizzo del citofluorimetro. Il test di

necrosi/apoptosi è un test funzionale, che consente di valutare la funzionalità della

cellula a livello della membrana plasmatica e del mitocondrio. Vengono utilizzate due

sonde: lo ioduro di propidio (PI) e la DiOC6. Questi due fluorocromi sono eccitabili alla

stessa lunghezza d’onda, ovvero a 488 nm (lunghezza d’onda del laser) ed emettono a

lunghezze d’onda diverse.

Figura 3.8 - Schema rappresentativo della correlazione tra densità ottica e numero di cellule

47

Lo ioduro di propidio (Figura 3.9) è una molecola carica che si intercala nel DNA. Una

volta che viene eccitata dal laser, emette a 610 nm una fluorescenza rossa. Se la

membrana della cellula è integra, questa non permette l’ingresso del PI, e di

conseguenza non si osserva emissione di fluorescenza rossa.

Figura 3.9 – Struttura chimica di PI [49]

La DiOC6 (3,3'-Dihexyloxacarbocyanine Iodide) (Figura 3.10) è una sonda vitale

potenziometrica: misura la differenza di potenziale della membrana del mitocondrio e

non risulta tossica per la cellula. Questa sonda emette a 525 nm una fluorescenza verde.

Quando il sistema di trasporto mitocondriale degli elettroni si trova a livelli fisiologici,

la sonda si aggrega ed emette fluorescenza. Nei casi in cui si instaura una

depolarizzazione di membrana (ad esempio durante l’apoptosi), e di conseguenza il

transito degli elettroni rallenta, si osserva invece una diminuzione dell’intensità di

fluorescenza verde perché la sonda tende a disaggregare.

48

Figura 3.10 – Struttura chimica di DiOC6 [50]

Nel campione che rappresenta il controllo positivo le cellule vengono trattate con CCCP

(carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone) (Figura 3.11) : è un protonoforo, ovvero

una molecola che è in grado di trasportare protoni dallo spazio intermembrana (ricco in

protoni) alla matrice del mitocondrio, dissipando così il gradiente protonico. In questo

modo induce una depolarizzazione mitocondriale. Questo composto presenta un’attività

depolarizzante sia concentrazione-dipendente che tempo-dipendente.

Figura 3.11 – Struttura chimica di CCCP [51]

49

3.9.1 PROTOCOLLO DEL TEST

Fase di staining: la sospensione cellulare (1x106 cell) viene colorata con DiOC6 10 µM

(concentrazione finale 0,2 µM) a 37°C per 15 minuti. Si effettuano due lavaggi in PBS a

15-18°C per eliminare l’eccesso di sonda. Eliminato il surnatante, le cellule vengono

risospese in PBS, a cui viene aggiunto il PI 10x (concentrazione finale 10 μg/mL). La

sospensione viene poi aliquotata nei tubi da citofluorimetro per allestire i gruppi di

trattamento. Le letture al citofluorimetro vengono effettuate a 15, 30 e 60 minuti.

3.10 CITOFLUORIMETRO E ANALISI DEI DATI

Quando un’onda elettromagnetica colpisce una particella, parte dell’energia viene

assorbita e parte dell’energia viene riemessa sottoforma di radiazione riflessa/diffusa

secondo quello che viene definito come “light scattering” (LS). Nel caso di cellule si

può sfruttare l’LS per risalire alle loro dimensioni e alla loro forma. Nel citofluorimetro

la radiazione viene rilevata tramite il forward scatter (FSC) e il side scatter (SSC).

Il forward scatter è posto lungo la direzione della luce incidente (con angolo quindi di

0°) e rileva la luce rifratta, mentre il side scatter è posto a 90° rispetto alla luce incidente

e rileva la luce riflessa. La sospensione unicellulare viene fatta flussare in modo tale che

intersechi una sorgente di radiazione (laser). Oltre a rilevare la luce riflessa e rifratta,

mediante l’utilizzo di fluorocromi è possibile rilevare anche l’intensità di fluorescenza.

Il fluorocromo infatti assorbe energia dal laser e la rilascia sottoforma di fotoni.

Il citofluorimetro è costituito da:

Un sistema fluidico: che permette al campione di flussare e di essere colpito dal

raggio del laser

Un sistema ottico: che genera e seleziona i segnali luminosi

Un sistema elettronico: che permette la trasformazione dei segnali luminosi in

segnali elettrici e la loro memorizzazione in una memoria multicanale

50

Un sistema di software: che media l’elaborazione e l’analisi dei dati raccolti dal

sistema elettronico

Tramite il flusso si riescono a raccogliere contemporaneamente valori di FSC, SSC e

fluorescenza per ogni singola cellula presente nella sospensione. Per il segnale FSC si

mantiene una soglia che consente di escludere detriti cellulari e particelle che

potrebbero interferire con l’analisi. I dati una volta analizzati possono essere combinati

secondo un istogramma monoparametrico o un diagramma biparametrico.

L’istogramma monoparametrico (Figura 3.12) confronta il numero di eventi rilevati con

l’intensità di fluorescenza di DiOC6.

Il diagramma biparametrico (Figura 3.13) combina i valori di FS (forward scatter) e SS

(side scatter).

CTRL MEC-1

AP241117 MEC1 CCCP T30 00033740 379.LMD

AP241117 MEC1 P6 11uM T30 00033741 380.LMD

AP241117 MEC1 P6 28uM T30 00033742 381.LMD

AP241117 MEC1 P6 57uM T30 00033743 382.LMD

DiOC6 (FL1Log, 525nm)

events

100

101

102

103

104

0

25

51

76

101

M1

Figura 3.12 - Esempio di istogramma monoparametrico

51

Figura 3.13 - Esempio di diagramma biparametrico

Gate 1: cellule integre

Gate 2: cellule danneggiate

Gate 3: tutte le cellule

Il diagramma biparametrico (Figura 3.14) può inoltre combinare i valori di fluorescenza

di PI e DiOC6.

Figura 3.14 - Esempio di diagramma biparametrico

SP230218 MEC1 in PBS 1 CTRL T60 37^C 00033963 577.LMD

SS Log

FS

Lin

100

101

102

103

104

0

256

512

768

1024

Gate 2

Gate 1

Gate 3

< SP230218 MEC1 in PBS 1 CTRL T60 37^C 00033963 577.LMD >

Gate 3

DiOC6 (FL1 Log, 525nm)

PI (F

L3

Lo

g, 6

10

nm

)

100

101

102

103

104

100

101

102

103

104

91,07%

0,00%

6,51% 2,42%

Gate 4

L3 Upper Left (UL) L2 Upper Right (UR)

L1 Low Left (LL) L4 Low Right (LR)

52

FL3 rileva la fluorescenza rossa

FL1 rileva la fluorescenza verde

L2 (UR): cellule tardo apoptotiche (doppie positive)

L3 (UL): cellule necrotiche (PI positive)

L4 (LR): cellule vitali

3.11 LIPOSOMI

I liposomi sono dei piccoli globuli formati da uno o più strati lipidici. In questo progetto

sono stati utilizzati come modello per simulare la membrana plasmatica di una cellula

eucariote per studiare le interazioni tra questa e alcune molecole, nel caso specifico

peptidi antimicrobici.

I liposomi sono innanzitutto formati da fosfolipidi (Figura 3.15). Data la loro struttura

chimica, una volta immessi in ambiente acquoso, si organizzano in un doppio strato

mantenendo la coda idrofobica all’interno e la testa idrofilica a contatto con l’ambiente

acquoso.

Figura 3.15 - Struttura chimica di un fosfolipide e rappresentazione schematica della struttura di un liposoma

53

Esistono diversi tipi di fosfolipidi: neutri o carichi. In questo progetto sono stati

utilizzati fosfolipidi neutri DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine). I

liposomi che si formano possono essere classificati in base a diversi parametri:

dimensione o numero di doppi strati fosfolipidici che li compongono (unilamellari,

multilamellari). In questo caso sono stati utilizzati i LUVs, ovvero large unilamellar

vescicles.

3.11.1 PREPARAZIONE DEI LIPOSOMI

I liposomi sono stati preparati partendo da una soluzione di fosfolipidi in

metanolo/cloroformio (in rapporto 2:1) 10 mg/mL. Sono stati prelevati 393,7 μL e sono

stati immessi in un palloncino di vetro. Il solvente è stato poi evaporato mediante un

flusso di azoto gassoso, mantenendo il sistema in rotazione. Così facendo si è formato

uno strato di fosfolipidi secchi adeso al fondo del palloncino (cake). Successivamente è

stato messo in liofilizzatore overnight per eliminare completamente il solvente.

Il giorno successivo il film lipidico è stato reidratato con 1 mL di PBS non sterile

(concentrazione finale 5 mM) : il pallone è stato dunque messo nel rotavapor in

agitazione e lasciato a bagnomaria ad una temperatura superiore ai 50°C per 1 ora. In

questo modo si ha la formazione di liposomi disomogenei, multilamellari/unilamellari e

di dimensioni variabili.

In seguito a questa fase si è sottoposta la soluzione a shock termico: si è immerso prima

il pallone in azoto liquido per alcuni secondi, e successivamente a bagnomaria ad una

temperatura intorno ai 25°C. Questo è stato fatto all’incirca per una decina di volte.

Questo passaggio permette la rottura delle vescicole multilamellari e la formazione di

una sospensione più omogenea di vescicole unilamellari.

Il passaggio successivo consiste nella fase di estrusione: la sospensione è stata fatta

passare usando un Mini-Extruder Kit (Avanti Polar Lipids, Inc.) attraverso una serie di

filtri in policarbonato con pori di dimensioni decrescenti, per permettere la formazione

di liposomi di dimensioni ottimali per l’esperimento. Sono state utilizzate membrane

con pori di 1 μm, 0,4 μm e 0,1 μm per ottenere liposomi LUVs 100 nm.

54

3.12 BIACORE

Il biacore utilizza la tecnologia della risonanza plasmonica di superficie (surface

plasmon resonance – SPR). Il concetto base consiste nell’attacco di una molecola

(ligando) sulla superficie di un chip, e successivamente nel far fluire una soluzione

contente un campione (analita) sulla superficie del chip (Figura 3.16). L’attacco di

molecole sulla superficie del chip genera una risposta che risulta proporzionale alla

massa legata.

Figura 3.16 - Rappresentazione schematica dell'interazione sul chip [52]

L’analisi viene effettuata iniettando la soluzione sul sensore del chip: la soluzione viene

trasportata tramite un flusso continuo di tampone chiamato running buffer.

Si definisce rigenerazione (regeneration) il processo mediante il quale l’analita viene

rimosso dalla superficie del chip dopo un ciclo di analisi. In questo modo si dovrebbe

riuscire ad ottenere ligando libero, pronto per una nuova analisi. Questo dipende però

dalla forza del legame analita-ligando. Se questa infatti è molto forte, non si riuscirà a

rimuovere completamente l’analita.

La risposta generata dal legame viene misurata in RU (resonance units). L’intensità

della risposta è direttamente proporzionale alla quantità di molecole che si lega sulla

superficie. L’interazione viene poi illustrata tramite un grafico (sensogramma - Figura

3.17) che mette in relazione risposta (RU) e tempo.

55

Figura 3.17 - Rappresentazione schematica di un sensogramma [52]

La risonanza plasmonica di superficie è un fenomeno che si osserva in sottili strati di

materiale conduttore in corrispondenza dell’interfaccia tra mezzi con differente indice di

rifrazione. Nel biacore i mezzi sono rappresentati da una slide in vetro del chip e la

soluzione contente il campione. Tra questi è posto il materiale conduttore, che è

costituito da un sottile strato di oro sulla superficie del chip (Figura 3.18).

Figura 3.18 - Rappresentazione schematica della SPR [52]

56

Durante l’interazione le condizioni che permettono l’instaurazione del fenomeno di

risonanza sono molto sensibili a variazioni nell’indice di rifrazione della soluzione. Per

questo motivo anche minimi cambiamenti nella concentrazione della soluzione causano

cambiamenti nell’indice di rifrazione e di conseguenza nella risposta della SPR.

In questo progetto abbiamo utilizzato come ligando i liposomi LUVs e come analita i

peptidi antimicrobici a differenti concentrazioni. Gli studi di interazione tra peptidi e

membrane modello sono stati effettuati usando un Biacore X100 (GE Lifescience). Il

chip utilizzato è il chip L1 che presenta delle molecole di destrano modificate con dei

residui lipofilici che hanno lo scopo di ancorare i liposomi al chip (Figura 3.19).

Figura 3.19 - Rappresentazione schematica del chip L1 [52]

Inizialmente i liposomi sono stati immobilizzati sul chip iniettando una soluzione 1 mM

di DOPC LUVs: sono state effettuate tre iniezioni per 10 minuti con un flusso di 5

μL/min. Sono stati effettuati poi dei lavaggi con NaOH per eliminare eventuali liposomi

non ancorati al chip. Si è raggiunto un segnale di circa 9000 RU. Successivamente è

stata fatta flussare una soluzione di BSA (albumina da siero bovino) 0,1 mg/mL per

occupare i siti attivi del chip non occupati dai liposomi. Dopodichè sono stati effettuati

gli esperimenti di binding iniettando concentrazioni crescenti di peptide. Il flusso

dell’iniezione è stato mantenuto a 10 μL/min con un tempo di contatto di 540 secondi,

seguito da un tempo di dissociazione di 1200 secondi mediante PBS. I sensogrammi

sono stati ottenuti usando il software BIAevaluation v1.1 e quindi elaborati usando

GraphPad v 6.04.

57

4. RISULTATI E DISCUSSIONE

58

In questo progetto sono state analizzate diverse serie di peptidi antimicrobici identificati

e caratterizzati dal Dott. Tomislav Rončević e dal gruppo di ricerca del Dipartimento di

Scienze dell’Università di Spalato, nell’ambito di una collaborazione scientifica con il

gruppo di ricerca in cui ho svolto la tesi.

I peptidi in oggetto sono stati suddivisi in tre classi:

Serie P

Clarkine

Kiadine

Il gruppo del Dott. Rončević, ha precedentemente condotto degli studi per saggiare

l’attività antibatterica dei peptidi, dai quali è stato possibile estrapolare un valore di

MIC (minima concentrazione inibente) e di MBC (minima concentrazione battericida).

Partendo da questi dati preliminari, in questo progetto abbiamo focalizzato la nostra

attenzione sullo studio degli effetti tossici in vitro che queste molecole possono causare

alle cellule dell’ospite, andando così a indagare la possibile interazione con membrane

cellulari e l’induzione del danno.

In particolare in questo progetto sono stati effettuati, dapprima, degli studi di

citotossicità su diverse linee cellulari, utilizzando sia cellule in attiva proliferazione che

cellule resting. Successivamente si è analizzata la capacità di interazione di questi

peptidi con membrane modello: si è cercato di ottenere delle informazioni riguardo il

possibile meccanismo d’azione, il tipo di interazione e sul possibile ruolo che altri

fattori possono svolgere.

59

4.1 STUDI DI CITOTOSSICITÀ – TEST MTT

Sono stati condotti i test MTT per valutare se il trattamento con peptidi antimicrobici

potesse essere tossico anche per le cellule dell’ospite.

Il test MTT si basa sulle proprietà che questo composto ha di attraversare la membrana

plasmatica e di essere ridotto all’interno del mitocondrio delle cellule metabolicamente

attive in blu di formazano. Tenendo conto del picco di assorbimento dell’MTT, è stato

possibile correlare il valore di densità ottica con la concentrazione di cellule vitali nel

pozzetto.

4.1.1 MEC-1 – SERIE P

Le prime prove sono state effettuate trattando le cellule MEC-1 per 24h in terreno

completo (TC) con i peptidi della serie P a concentrazioni scalari da 1 μM a 100 μM;

inoltre, ogni set sperimentale comprendeva il gruppo di controllo (cellule non trattate

con i peptidi). I risultati ottenuti sono riportati nella Figura 4.1 e sono espressi come

valori medi della percentuale di cellule vitali (±SEM) dopo 24h di esposizione con i

peptidi alle concentrazioni indicate in asse X; le colonne in grigio riportano i valori del

gruppo di controllo.

Dall’analisi si può notare che i peptidi P3, P4 e P5 non hanno alcun effetto sulla vitalità

della linea cellulare, fino alla concentrazione più elevata. Per quanto riguarda i peptidi

P1 e P2, solo alla concentrazione di 100 μM la vitalità scende in modo statisticamente

significativo, ed in particolare P1 raggiunge il valore di IC50.

Per quanto riguarda il P6 le cellule risultano molto più sensibili: già a 50 μM la

percentuale di vitalità scende a 15,7% ± 0,10, mentre a 10 μM si osserva il 91% ± 2,75

di vitalità. I risultati appaiono statisticamente significativi.

60

**

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0 1 10 25 50 100

Vit

alit

à (%

)

Peptide (μM)

P1

**

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0 1 10 50 100

Vit

alit

à (%

)

Peptide (μM)

P2

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0 1 10 50 100

Vit

alit

à (%

)

Peptide (μM)

P3

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0 1 10 50 100

Vit

alit

à (%

)

Peptide (μM)

P4

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0 1 10 50 100

Vit

alit

à (%

)

Peptide (μM)

P5

** *

*** ***

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0 1 5 10 50 100

Vit

alit

à (%

)

Peptide (μM)

P6

Figura 4.1 – Test MTT su cellule MEC-1 (10^6 cell/mL) – Grafici a istogrammi rappresentanti in ordinata i valori di vitalità espressi in percentuale, e in ascissa i valori di concentrazione del trattamento con i peptidi P1 - P6 (0-100

μM) per 24h in TC. Valori medi di campioni in triplicato ± SEM (* P<0,05 **P<0,01 *** P<0,001 – analisi statistica effettuata con Test Student Newman Keuls, ANOVA)

61

4.1.2 MEC-1 – CLARKINE

Successivamente le cellule della linea MEC-1 sono state trattate con i peptidi

appartenenti alla classe delle Clarkine, mantenendo lo stesso range di concentrazione. I

risultati ottenuti sono riportati in Figura 4.2.

Dai grafici risulta che nessuno dei peptidi appartenenti a questa classe è capace di

causare una diminuzione nella percentuale di vitalità cellulare, pertanto sembra non

esserci alcun tipo di interazione con la membrana delle cellule dell’ospite. I risultati

infatti non risultano statisticamente significativi (analisi statistica effettuata con Test

Student Newman Keuls, ANOVA).

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0 1 10 50 100

Vit

alit

à (%

)

Peptide (μM)

P9

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0 1 10 50 100

Vit

alit

à (%

)

Peptide (μM)

P10

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0 1 10 50 100

Vit

alit

à (%

)

Peptide (μM)

P11

Figura 4.2 – Test MTT su cellule MEC-1 (10^6 cell/mL) – Grafici a istogrammi rappresentanti in ordinata i valori di vitalità espressi in percentuale, e in ascissa i valori di concentrazione del trattamento con i peptidi P9 – P11 (0-100

μM) per 24h in TC. Valori medi di campioni in triplicato ± SEM

62

4.1.3 MEC-1 – KIADINE

I test di citotossicità sono stati inoltre effettuati utilizzando come trattamento una nuova

serie di peptidi antimicrobici appartenenti alla classe delle Kiadine, peptidi sintetici

ricchi in residui di Gly e Lys, ottenuti a partire dal “template” di un piccolo peptide

naturale (PGLa-H). Partendo dalle analisi già condotte su questa classe di peptidi

riportate in letteratura [33] [34], i risultati dei nostri test, effettuati con una diversa linea

cellulare, sono in accordo con i dati precedentemente riportati.

In questo set di esperimenti sono state mantenute concentrazioni di peptide fino a 50

μM, in riferimento ai dati riportati negli articoli riguardo l’attività antimicrobica (valori

di MIC e MBC).

Dai risultati riportati in Figura 4.3 emerge che tutti i peptidi di questa serie riducono la

percentuale di vitalità cellulare.

In particolare, per quanto riguarda (PGLaH)2, l’IC50 viene raggiunta ad una

concentrazione di 10 μM.

Kiadina-2 (K2) e Kiadina-3 (K3) appaiono meno citotossici nei confronti di MEC-1:

alla massima concentrazione utilizzata (25 μM) circa l’80% della popolazione cellulare

risulta ancora vitale. Le modifiche introdotte nella struttura risultano quindi utili nel

ridurre la tossicità per la cellula ospite.

Nel caso di Kiadina-4 (K4) e Kiadina-6 (K6), rispettivamente a 50 μM e 25 μM, la

percentuale di vitalità è di circa il 20%. K6, in particolare, mantiene un’attività

citotossica confrontabile con il peptide naturale.

63

* ***

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0 1 5 10 25

Vit

alit

à (%

)

Peptide (μM)

K2

* **

*** ***

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0 1 5 10 25

Vit

alit

à (%

)

Peptide (μM)

(PGlaH)2

* **

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0 1 5 10 25

Vit

alit

à (%

)

Peptide (μM)

K3

***

***

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0 0,5 1 5 50

Vit

alit

à (%

)

Peptide (μM)

K4

**

***

***

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0 1 5 10 25

Vit

alit

à (%

)

Peptide (μM)

K6

Figura 4.3 - Test MTT su cellule MEC-1 (10^6 cell/mL) – Grafici a istogrammi rappresentanti in ordinata i valori di vitalità espressi in percentuale, e in ascissa i valori di concentrazione del trattamento con i peptidi della serie

Kiadine (0-25/50 μM) per 24h in TC. Valori medi di campioni in triplicato ± SEM (* P<0,05 **P<0,01 *** P<0,001 – analisi statistica effettuata con Test Student Newman Keuls, ANOVA)

64

4.1.4 MCF-7_ADR – SERIE P

In seguito ai risultati riportati negli esperimenti finora descritti, è stata impiegata

un’ulteriore linea cellulare per verificare se il comportamento del peptide potesse essere

linea cellulare-dipendente. La linea cellulare utilizzata, derivante da un carcinoma

mammario, è resistente all’adriamicina ed è caratterizzata da overespressione di P-gp

(glicoproteina-P) [53]. Sono state mantenute le stesse condizioni di concentrazione e di

tempi di trattamento utilizzate per la linea MEC-1. I risultati sono visibili in Figura 4.4.

*** ***

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0 1 10 50 100

Vit

alit

à (%

)

Peptide (μM)

P1

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0 1 10 50 100

Vit

alit

à (%

)

Peptide (μM)

P2

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0 1 10 50 100

Vit

alit

à (%

)

Peptide (μM)

P3

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0 1 10 50 100

Vit

alit

à (%

)

Peptide (μM)

P5

Figura 4.4 - Test MTT su cellule MCF-7_ADR (10^5 cell/mL) – Grafici a istogrammi rappresentanti in ordinata i valori di vitalità espressi in percentuale, e in ascissa i valori di concentrazione del trattamento con i peptidi P1 – P2 – P3 – P5 (0-100 μM) per 24h in TC. Valori medi di campioni in triplicato ± SEM (* P<0,05 **P<0,01 *** P<0,001 – analisi

statistica effettuata con Test Student Newman Keuls, ANOVA)

65

Dagli istogrammi sopra riportati, si evince che questa linea cellulare risulta molto meno

sensibile ai peptidi utilizzati rispetto alla linea MEC-1. Questo comportamento può

dipendere dal fenotipo resistente; si tratta, infatti, di una linea MDR che iperesprime la

pompa di estrusione per farmaci. [53] La vitalità cellulare si mantiene intorno al 90%

alla concentrazione massima utilizzata per P2, P3 e P5, eccezion fatta per il P1, che, a

100 μM appare leggermente più tossico, portando la percentuale di vitalità al 70% circa.

In questo caso infatti si può osservare una significatività statistica dei risultati.

La minor suscettibilità di questa linea e la diversa attività citotossica dei peptidi, hanno

indotto ad estendere lo studio anche ad altre cellule, sia proliferanti, sia resting,

focalizzandolo sui due peptidi più citotossici, ovvero il P1 e il P6.

4.1.5 HaCat – P1 e P6

La linea HaCat rappresenta un modello di cheratinociti in attiva proliferazione che

crescono in adesione. I risultati dei test MTT riportati in Figura 4.5 mostrano che questa

linea risulta sensibile agli effetti tossici di P1 e P6 tanto quanto la linea MEC-1. I dati

inoltre, mediante analisi statistica, sono risultati altamente significativi (P<0,001) anche

tra le varie concentrazioni dei singoli peptidi.

*** *** ***

***

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0 1 10 25 50 100

Vit

alit

à (%

)

Peptide (μM)

P1

** ***

***

*** ***

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0 1 5 10 50 100

Vit

alit

à (%

)

Peptide (μM)

P6

Figura 4.5 - Test MTT su cellule HaCat (2 x 10^5 cell/mL) – Grafici a istogrammi rappresentanti in ordinata i valori di vitalità espressi in percentuale, e in ascissa i valori di concentrazione del trattamento con i peptidi P1 - P6 (0-100 μM)

per 24h in TC. Valori medi di campioni in triplicato ± SEM (* P<0,05 **P<0,01 *** P<0,001 – analisi statistica effettuata con Test Student Newman Keuls, ANOVA)

66

Come ulteriore modello in vitro per studiare la citotossicità dei peptidi sono stati

utilizzati dei leucociti, estratti da sangue di donatori sani, per allestire delle colture

primarie. Da letteratura è stato riportato che le cellule da coltura primaria o da linea

mantenuta in vitro, presentano caratteristiche in parte diverse, quali la fluidità della

membrana e marker di differenziamento [54] [55]. Pertanto, i leucociti ottenuti ex vivo,

rappresentano un utile e predittivo modello sperimentale in quanto consentono di

studiare gli effetti su cellule circolanti, il cui ruolo è fondamentale nei sistemi di difesa

dell’ospite dalle infezioni.

4.1.6 MONOCITI – P1 e P6

I monociti sono stati isolati dal buffy coat, precedentemente separato dall’Ospedale

Maggiore di Trieste, e sono stati messi in coltura e trattati con P1 e P6 a concentrazioni

analoghe a quelle usate per le linee cellulari in attiva proliferazione. Si è voluto

indagare, infatti, l’effetto dei peptidi su cellule resting estratte dal sangue. I risultati

degli esperimenti condotti sono riportati in Figura 4.6.

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0 1 10 25 50 100

Vit

alit

à (%

)

Peptide (μM)

P1

***

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0 1 5 10 50 100

Vit

alit

à (%

)

Peptide (μM)

P6

Figura 4.6 - Test MTT su monociti estratti da buffy coat (10^6 cell/mL) – Grafici a istogrammi rappresentanti in ordinata i valori di vitalità espressi in percentuale, e in ascissa i valori di concentrazione del trattamento con i peptidi

P1 - P6 (0-100 μM) per 24h in TC. Valori medi di campioni in triplicato ± SEM (* P<0,05 **P<0,01 *** P<0,001 – analisi statistica effettuata con Test Student Newman Keuls, ANOVA)

67

Analizzando i grafici si evince che risultano meno sensibili rispetto alle colture cellulari

immortalizzate, solo a concentrazioni più alte (100 μM) notiamo una diminuzione della

vitalità cellulare di circa il 20% con entrambi i peptidi. Questo perché, essendo una

coltura primaria, le cellule sono vitali ma non in attiva proliferazione e di conseguenza

la loro attività metabolica risulta rallentata rispetto alle linee cellulari neoplastiche.

4.1.7 LINFOCITI – P1 e P6

In seguito i test MTT sono stati condotti su linfociti, analogamente estratti da sangue

proveniente da donatori sani. I risultati sono riportati in Figura 4.7.

Anche in questo caso si può osservare lo stesso trend: sensibilità minore riguardo agli

effetti tossici, ma comunque significativa (P<0,01) per P6 a 50 μM.

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0 1 10 25 50 100

Vit

alit

à (%

)

Peptide (μM)

P1

**

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0 1 5 10 50 100

Vit

alit

à (%

)

Peptide (μM)

P6

Figura 4.7 - Test MTT su linfociti estratti da buffy coat (10^6 cell/mL) – Grafici a istogrammi rappresentanti in ordinata i valori di vitalità espressi in percentuale, e in ascissa i valori di concentrazione del trattamento con i peptidi P1 - P6 (0-100 μM) per 24h in TC. Valori medi di campioni in triplicato ± SEM (* P<0,05 **P<0,01 ***

P<0,001 – analisi statistica effettuata con Test Student Newman Keuls, ANOVA)

68

4.1.8 MACROFAGI – P1 e P6

Infine a partire da monociti estratti da buffy coat, è stato indotto il differenziamento in

macrofagi mediante la somministrazione di lipopolisaccaride batterico (LPS), ovvero un

endotossina in grado di attivare la risorsa immunitaria dell’ospite, ottenendo così cellule

MDM-LPS (procedura dettagliata riportata nella sezione Materiali e Metodi). La coltura

è stata utilizzata per effettuare il test MTT con P1 e P6 alle stesse condizioni di

trattamento usate per le altre linee. I risultati sono così riportati in Figura 4.8.

Questa coltura appare meno sensibile a P1 e P6 rispetto alle altre due colture primarie. I

risultati infatti non risultano statisticamente significativi.

Riassumendo, dai risultati riportati negli esperimenti finora descritti, si può quindi

effettuare un confronto tra le diverse linee cellulari, per quanto riguarda P1 e P6, come

riportato in Figura 4.9 e Figura 4.10.

Per quanto riguarda P1 le linee MEC-1 e HaCat risultano più sensibili rispetto alle

colture primarie. In particolare si può osservare una chiara dipendenza dalla

concentrazione nella linea HaCat. Mentre monociti e linfociti appaiono poco sensibili e

solo le concentrazioni più alte (intorno a 100 μM) causano una lieve inibizione della

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0 1 10 25 50 100

Vit

alit

à (%

)

Peptide (μM)

P1

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0 1 5 10 50 100

Vit

alit

à (%

)

Peptide (μM)

P6

Figura 4.8 - Test MTT su MDM-LPS (10^6 cell/mL) – Grafici a istogrammi rappresentanti in ordinata i valori di vitalità espressi in percentuale, e in ascissa i valori di concentrazione del trattamento con i peptidi P1 - P6 (0-100

μM) per 24h in TC. Valori medi di campioni in triplicato ± SEM.

69

vitalità. P6 invece appare molto più tossico in MEC-1 e HaCat, riducendo la percentuale

di cellule vitali al di sotto del 20% già a 50 μM. Per quanto riguarda le colture primarie

invece, gli effetti sono sovrapponibili a quelli riportati per P1: tossicità trascurabile,

tranne alle concentrazioni più alte.

*** ***

***

***

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

MEC-1 HaCat Monociti Linfociti Macrofagi

Vit

alit

à (%

)

P1

0

1

10

25

50

100

**

Figura 4.9 – Istogramma riassuntivo che mette a confronto i risultati dei test MTT di P1 nelle diverse linee cellulari. In ordinata i valori di vitalità espressi in percentuale e in ascissa i nomi delle linee cellulari. Valori medi di

campioni in triplicato ± SEM (* P<0,05 **P<0,01 *** P<0,001 – analisi statistica effettuata con Test Student Newman Keuls, ANOVA)

**

**

*** *

***

*** **

*** ***

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

MEC-1 HaCat Monociti Linfociti Macrofagi

Vit

alit

à (%

)

P6

0

1

5

10

50

100

Figura 4.10 - Istogramma riassuntivo che mette a confronto i risultati dei test MTT di P6 nelle diverse linee cellulari. In ordinata i valori di vitalità espressi in percentuale e in ascissa i nomi delle linee cellulari. Valori medi di


*** ***

70

4.1.9 ASSOCIAZIONE P1-P6

Visti i risultati degli esperimenti, il gruppo di ricerca dell’Università di Spalato ha

effettuato successivamente dei test di MIC valutando l’effetto dell’associazione di P1 e

P6 (in rapporto 1:1), per indagare se i due peptidi in combinazione potessero avere o

meno un effetto sinergico. Gli esperimenti sono stati condotti in due condizioni

differenti (full MH e 20%MH) su S. aureus (ATCC e c.i.), E. faecalis ATCC, E. coli

(ATCC e c.i.), A. baumanii (ATCC e c.i.). I risultati più rilevanti sono emersi nei

confronti di S. aureus e sono riportati in Tabella 4-1, messi a confronto con i precedenti

risultati dei singoli peptidi.

Tabella 4-1 – Risultati dei test di MIC

MH P1 P6 MIX FIC index

S. aureus ATCC 29213 16 4 2 0,625

S. aureus c.i. 64 8 8 1,125

20%MH

S. aureus ATCC 29213 4 1 1 1,250

S. aureus c.i. 32 4 4 1,125

Valori di MIC (µM) di P1, P6 e MIX (P1 + P6 in rapporto 1:1) ottenuti in terreno completo (MH) e in 20% MH. Si

riporta il FIC index calcolato.

È stato calcolato il FIC index (fractional inibitory concentration) [56] applicando la

formula:

𝑭𝑰𝑪 𝒊𝒏𝒅𝒆𝒙 = 𝑭𝑰𝑪 (𝑨) + 𝑭𝑰𝑪 (𝑩) = ( 𝑴𝑰𝑪 𝒐𝒇 𝑨 𝒘𝒊𝒕𝒉 𝑩 )

( 𝑴𝑰𝑪 𝒐𝒇 𝑨 𝒂𝒍𝒐𝒏𝒆 )+

( 𝑴𝑰𝑪 𝒐𝒇 𝑩 𝒘𝒊𝒕𝒉 𝑨 )

( 𝑴𝑰𝑪 𝒐𝒇 𝑩 𝒂𝒍𝒐𝒏𝒆 )

Il valore di FIC index varia da 0 a 2 (Figura 4.11), dove per valore:

≤ 0,5 associazione sinergica

> 0,5 e ≤ 1 associazione additiva

> 1 e ≤ 2 associazione indifferente

> 2 associazione antagonista

71

Figura 4.11 - Figura rappresentativa della distribuzione dei valori di FIC index calcolati nel caso di un'associazione di due farmaci [57]

Il valore di FIC index calcolato (Tabella 4-1) evidenzia che la combinazione dei due

peptidi in terreno MH ha un effetto di associazione additiva impiegando il ceppo ATCC

di S. aureus, mentre in tutti gli altri casi l’associazione risulta indifferente. I due peptidi

associati non mostrano effetto antagonista.

Per questo motivo abbiamo condotto i successivi test MTT utilizzando come

trattamento l’associazione dei due peptidi, al fine di valutare l’effetto tossico sulle

cellule dell’ospite. Le concentrazioni sono state scelte valutando il valore di MIC

calcolato negli esperimenti effettuati dall’Università di Spalato, combinandolo con il

valore di IC50 calcolato nei test MTT fino ad ora descritti. Sono state utilizzate tre

differenti combinazioni:

P1 25 μM + P6 5 μM ≈ MIC

P1 25 μM + P6 10 μM 1 4⁄ IC50

P1 100 μM + P6 50 μM IC50

72

I risultati sono riportati in Figura 4.12 mettendo a confronto le varie linee cellulari.

Dal grafico si nota che, alle concentrazioni batteriostatiche (MIC), l’associazione è ben

tollerata dalla linea MEC-1 (fino a ¼ IC50). L’effetto citotossico si manifesta in maniera

marcata alla concentrazione più alta utilizzata. Gli stessi risultati si sono osservati anche

per la linea HaCat. Per quanto riguarda le colture primarie si può osservare una

diminuzione della vitalità cellulare concentrazione-dipendente meno evidente

(inibizione del 10-25%), ma comunque presente.

Le prove di citotossicità descritte finora sulle diverse linee cellulari, indicano che per

quanto riguarda le Kiadine, tutti i peptidi analizzati risultano avere un effetto tossico

marcato per le cellule, ad eccezione di K2 e K3. Per quanto riguarda invece i peptidi

della serie P solo P6, e in parte P1, mostrano un’attività citotossica nei confronti delle

diverse linee impiegate e che questa attività è chiaramente concentrazione-dipendente.

** ** *

*** **

**

***

0

20

40

60

80

100

120

MEC-1 HaCat Monociti Linfociti MDM-LPS

Vit

alit

à (%

) 0

P1 25 + P6 5

P1 25 + P6 10

P1 100 + P6 50

Figura 4.12 - Istogramma riassuntivo che mette a confronto i risultati dei test MTT di P1 + P6 nelle diverse linee cellulari. In ordinata i valori di vitalità espressi in percentuale e in ascissa i nomi delle linee cellulari. Valori medi di


73

Successivamente alle prove di citotossicità, si è proceduto con l’analisi del danno

cellulare indotto dall’esposizione con i peptidi P1 e P6 mediante l’utilizzo del

Citofluorimetro e inoltre della Risonanza Plasmonica di Superficie per dettagliare

l’interazione con membrane modello.

4.2 MECCANISMO D’AZIONE

4.2.1 EFFETTO DEL TRATTAMENTO SULLA MORFOLOGIA

CELLULARE

I primi esperimenti sono stati effettuati impiegando la tecnica citofluorimetrica per

andare a valutare se l’interazione con P1 e P6 causasse un danno diretto alla membrana

plasmatica. La sonda PI che è stata utilizzata è infatti in grado di attraversare la

membrana solo nel caso in cui questa non sia integra (evento correlato a un danno di

tipo necrotico).

Per tutte le analisi eseguite al citofluorimetro è stata utilizzata la linea MEC-1

mantenendola in PBS nel tempo di incubazione con i peptidi (fino a 60 minuti). Le

condizioni impiegate consentono di valutare la relazione tempo-danno, in un ambiente

minimo, quale il tampone fosfato-salino, che previene sia interazioni che sequestro del

peptide.

Le prime prove sono state effettuate con P1 alla concentrazione di 10 μM e 25 μM. Gli

istogrammi biparametrici (FS/SS) riportati in Figura 4.13 mostrano che, anche dopo 60

minuti, alla concentrazione più elevata non si osserva un’alterazione nella morfologia

delle cellule, che appaiono sovrapponibili al controllo.

74

AP241117 MEC1 CTRL T30 00033739 378.LMD

SS Log

FS

Lin

100

101

102

103

104

0

256

512

768

1024

Gate 3

Gate 1

Gate 2

AP241117 MEC1 P6 28uM T30 00033742 381.LMD

SS Log

FS

Lin

100

101

102

103

104

0

256

512

768

1024

Gate 2

Gate 1

Gate 3

Figura 4.14 - Istogrammi biparametrici dot plot che correlano i segnali di side scatter (SSlog) con quelli di forward scatter (FSlin). A sinistra cellule di controllo a T30, a destra cellule trattate con P6 a ≈25μM a T30.

Questo dato conferma i risultati dei test MTT condotti su MEC-1, dove a 25μM si

osserva una percentuale di cellule vitali del 96% ± 0,69.

Successivamente si è andato a valutare P6 alle stesse condizioni di trattamento e tempo

di esposizione di P1. Da questi risultati preliminari si è visto che alla concentrazione di

10 μM, sia a T30 che a T60, la percentuale di cellule in Gate 1 si mantiene intorno

all’80%. Al contrario, a 25μM, già a T30 si osserva uno shift verso il Gate 2 (cellule

danneggiate) che raccoglie circa il 90% delle cellule (Figura 4.14).

SP230218 MEC1 in PBS 4 P1 25uM T60 00033966 580.LMD

SS Log

FS

Lin

100

101

102

103

104

0

256

512

768

1024

Gate 2

Gate 1

Gate 3

SP230218 MEC1 in PBS 1 CTRL T60 37^C 00033963 577.LMD

SS Log

FS

Lin

100

101

102

103

104

0

256

512

768

1024

Gate 2

Gate 1

Gate 3

Figura 4.13 – Istogrammi biparametrici dot plot che correlano i segnali di side scatter (SSlog) con quelli di forward scatter (FSlin) di cellule MEC-1. A sinistra cellule di controllo a T60, a destra cellule trattate con P1 a 25μM

per 60 minuti (T60).

75

Questi risultati sono in accordo con quelli ottenuti nei test MTT in cui il trattamento con

P6 causa tossicità cellulare concentrazione-dipendente.

In Tabella 4-2 sono riportati i dati relativi alle % di cellule in Gate 1 e Gate 2 per

entrambi i peptidi, in funzione della concentrazione e del tempo di trattamento.

T15 P1 (10 μM) P1 (25 μM) P6 (10 μM) P6 (25 μM)

% Gate 1 95,38 94,52 64,61 ± 10,97 6,11 ± 0,49

% Gate 2 3,94 4,68 31,88 ± 9,59 86,41 ± 2,36

T30

% Gate 1 94,63 92,38 51,86 ± 19,43 8,58 ± 1,56

% Gate 2 4,57 6,45 32,51 ± 8,67 70,46 ± 5,72

T60

% Gate 1 94,67 91,61 - -

% Gate 2 4,41 6,77 - -

Tabella 4-2 - % di cellule in Gate 1 e Gate 2 per P1 e P6 in funzione della concentrazione e del tempo di trattamento. Valori medi di campioni in triplicato ± SEM.

4.2.2 ANALISI DEL DANNO – APOPTOTICO O NECROTICO

La valutazione del danno causato dai peptidi, in particolare P6, è stata effettuata

utilizzando una doppia marcatura con una sonda vitale potenziometrica (DiOC6) ed il

PI, indicatore di danno di membrana. L’impiego di entrambe le sonde permette di

discriminare il danno cellulare di tipo necrotico o di tipo apoptotico; in particolare, le

cellule vitali si raccolgono nel quadrante LR, le tardo apoptotiche nel quadrante UR e le

necrotiche in quello UL. In Figura 4.15 sono riportati dei dot-plot rappresentativi di

cellule con la doppia marcatura del gruppo di controllo (A) o trattate con i peptidi (B,

C).

76

Dai grafici si può notare che, nel caso di P1, sia le cellule di controllo che le cellule

trattate con il peptide a 25μM, si posizionano per circa il 90% all’interno del quadrante

in basso a destra (LR) e rappresentano la percentuale di cellule vitali. La situazione

rimane invariata anche dopo 60 minuti dall’esposizione al trattamento.

Per quanto riguarda P6, invece, dopo 30 minuti dall’esposizione a 25μM di peptide, le

cellule shiftano per più dell’80% nel quadrante delle tardo apoptotiche in alto a destra

(UR): un aumento della fluorescenza verde e un concomitante aumento della

fluorescenza rossa indicano che il peptide è in grado di indurre danno e portare la

< SP230218 MEC1 in PBS 4 P1 25uM T60 00033966 580.LMD >

Gate 3


PI (F

L3

Lo

g, 6

10

nm

)

100

101

102

103

104

100

101

102

103

104

86,77%

0,00%

10,40% 2,83%

Gate 4

< AP241117 MEC1 P6 28uM T30 00033742 381.LMD >

Gate 3


PI (F

L3

Lo

g, 6

10

nm

)

100

101

102

103

104

100

101

102

103

104

15,90%

0,04%

83,44% 0,62%

Gate 4

< AP241117 MEC1 CTRL T30 00033739 378.LMD >

Gate 3


PI (F

L3

Lo

g, 6

10

nm

)

100

101

102

103

104

100

101

102

103

104

Gate 4

0,56% 1,99%

0,00%

97,45%

Figura 4.15 – Grafico biparametrico dot plot che correla i segnali relativi a PI (FL3Log) e a DiOC6 (FL1Log). Le cellule MEC-1 (1x10^6 cell/mL) sono state colorate con DiOC6 e PI. A) cellule di controllo a T60, B) cellule trattate

con P1 a 25uM a T60, C) cellule trattate con P6 a ≈ 25 μM

UR UL

LL LR

B

UL UR

LL LR

UR UL

LL LR

A

C

77

cellula in apoptosi. Pressoché la stessa situazione si presenta anche dopo 60 minuti,

indicando che si raggiunge rapidamente l’effetto massimo e che questo risulta

concentrazione-dipendente.

4.2.3 EFFETTO DEL PEPTIDE IN TERRENO COMPLETO

Negli esperimenti successivi si è deciso di indagare il possibile effetto di altre varianti

nell’influenzare la tossicità di P6. In particolar modo, si è deciso di valutare se

l’ambiente extracellulare, e quindi la quantità di sali, potesse avere qualche effetto nel

modulare la tossicità. È noto, infatti, che l’azione dei peptidi antimicrobici è

strettamente correlata alla sequenza amminoacidica e corrispondentemente alla

conformazione che il peptide assume quando viene a contatto con il doppio strato

fosfolipidico. Come noto, uno svantaggio nell’uso dei peptidi come terapia

antimicrobica è dovuto alla loro “salt-sensitivity”. E’ stato descritto che per alcuni AMP

l’attività antimicrobica risulta diminuita dalla presenza di sali nell’ambiente

extracellulare. Ci sono molti esempi in letteratura che trattano questo argomento [58]

[59] [60] allo scopo di comprendere e implementare la salt-resistance. [61] [62]

Gli AMPs necessitano di un’interazione elettrostatica con la membrana dei batteri per

formare strutture secondarie ed esplicare quindi la loro funzione antimicrobica. Questa

attrazione è influenzata dalla concentrazione di sali. Una stabilizzazione, infatti, della

struttura secondaria sembra portare ad un aumento della salt-resistance. [63]

Poiché i risultati citofluorimetrici hanno evidenziato per P6 una notevole tossicità, a

parità di concentrazione, più marcata rispetto ai test MTT, pur esponendo le cellule per

un’ora rispetto alle 24h del test MTT, un’ulteriore variante nello svolgimento delle due

prove (citofluorimetrica e spettrofotometrica), ha riguardato il fatto che per i test

citofluorimetrici i peptidi sono stati mantenuti in tampone PBS, rispetto al terreno

completo impiegato nei test MTT. Per comprendere il ruolo dei due mezzi (PBS o

Terreno Completo) in cui sono stati sciolti i peptidi, i successivi esperimenti al

citofluorimetro sono stati condotti utilizzando sempre la stessa concentrazione di

peptide (10 μM e 25μM), sospendendo però le cellule sia in PBS che in terreno di

coltura e confrontando i risultati sul danno cellulare indotto dal peptide. I risultati sono

esposti utilizzando un grafico a istogramma (Figura 4.16):

78

Figura 4.16 - Grafico a istogrammi che mette a confronto cellule in PBS e cellule in TC trattate con P6 a 10 μM e a 25μM a T30. Valori medi di campioni in triplicato ± SEM (* P<0,05 **P<0,01 *** P<0,001 – a: P<0,05 aa: P<0,01 aaa:

P<0,001 analisi statistica effettuata con Test Student Newman Keuls, ANOVA)

Dal grafico si può notare che, per quanto riguarda le cellule sospese in PBS, si osserva

una diminuzione della percentuale di cellule vitali con l’aumentare della concentrazione

di P6. Corrispondentemente si nota un aumento della percentuale di cellule danneggiate,

accumulate in tarda apoptosi, mentre la percentuale di cellule necrotiche rimane

trascurabile. I valori sono statisticamente significativi rispetto al controllo in PBS.

Per quanto riguarda invece le cellule sospese in terreno completo (TC), il peptide perde

l’effetto tossico a bassa concentrazione, infatti, non si nota con P6 a 10 μM, nessuna

riduzione nella percentuale di cellule vitali, che risultano completamente confrontabili

con il gruppo non trattato dei controlli (CTRL). Aumentando la concentrazione (25 μM)

vi è un brusco calo nella percentuale di cellule vitali per entrambe le condizioni (<20%),

ma il danno osservato sembra dipendere dal mezzo in cui si trovano le cellule. In PBS,

ovvero in una situazione minima di un tampone che contiene la concentrazione di sali

necessaria e sufficiente a mantenere funzionali i sistemi di trasporto e la vitalità

***

*** ***

**

***

*

***

0

20

40

60

80

100

120

CTRL_PBS 10_PBS 25_PBS CTRL_TC 10_TC 25_TC

% p

op

ola

zio

ne

ce

llula

re

P6 T30

% vitali

% late apo

% necrotiche

aaa

aaaa

aaa

79

cellulare, il peptide risulta particolarmente tossico già a 10 μM. Al contrario, in TC, è

interessante notare che fino a 10 μM, sembra che il terreno svolga un ruolo protettivo

nei confronti della cellula, mantenendola vitale, forse sequestrando parte del peptide.

Questo rappresenta un’ulteriore conferma dei risultati dei test MTT condotti

precedentemente. Il test infatti viene condotto in terreno completo, non in PBS.

Aumentando la concentrazione (25 μM) il TC perde la capacità di ridurre il danno

indotto dal peptide ed infatti la % di cellule vitali (< 20%) è confrontabile nelle due

condizioni; risulta però diverso il tipo di danno, in quanto in TC le cellule muoiono per

necrosi.

Le prove sono state effettuate sia a 15 che a 30 minuti. Il grafico si riferisce ai dati

raccolti a 30 minuti, ma risulta esattamente sovrapponibile al grafico dei dati raccolti a

T15. Questo conferma l’ipotesi che era emersa nei precedenti esperimenti riguardo la

dipendenza dal tempo: gli effetti tossici nei confronti delle cellule MEC-1 si

manifestano in tempi rapidi e si mantengono nel tempo. In conclusione si può affermare

che la capacità del peptide di indurre tossicità risulta influenzata dall’ambiente di

incubazione.

4.3 STUDI DI INTERAZIONE CON MEMBRANE

MODELLO– SURFACE PLASMON RESONANCE

Dopo aver effettuato gli studi per testare la tossicità dei peptidi su diverse linee cellulari,

si è deciso di continuare analizzando l’interazione di questi con membrane modello, per

identificare con maggiore precisione il tipo di legame che si instaura con il doppio strato

fosfolipidico della membrane cellulari.

Per fare questo sono stati utilizzati dei liposomi (LUVs) grandi 100 nm, costituiti da

fosfolipidi neutri, ovvero DOPC. La struttura chimica è riportata in Figura 4.17.

Possiede una temperatura critica (Tc) di - 20C°, di conseguenza a temperatura ambiente

si trova in fase liquida.

80

Figura 4.17 – struttura chimica fosfolipide DOPC (Dioleoylphosphatidylcholine)[64]

I liposomi sono stati testati sia con i peptidi appartenenti alla serie P (P1 e P6), sia con

le Kiadine, integrando così le informazioni raccolte dagli articoli riguardanti questa

classe.

I liposomi LUVs, preparati come riportato nella sezione Materiali e Metodi, costituiti da

DOPC, sono stati immobilizzati sul sensor chip L1 del Biacore: il chip presenta delle

molecole di destrano modificate con dei residui lipofilici che hanno lo scopo di ancorare

i liposomi al chip, quando questi vengono fatti flussare sulla sua superficie. Dopo la

prima iniezione di DOPC si verifica un notevole aumento di RU, fino a circa 9000,

valore che rimane costante nelle successive iniezioni. Questo suggerisce una possibile

saturazione dei siti sulla superficie del chip. Per confermare questa ipotesi, viene

iniettata BSA per occupare gli eventuali siti liberi. Il livello di immobilizzazione

raggiunto dalla BSA è talmente basso da indicare che la superficie è già stata

completamente coperta dai liposomi LUVs. Successivamente è stata testata la capacità

di binding, tramite l’iniezione di una serie di concentrazioni crescenti di peptidi.

In primo luogo sono stati analizzati i peptidi P1 e P6. In Figura 4.18 sono riportati il

sensogramma di binding (A) e la relativa curva di affinità (B) ottenuti per P1.

81

Dal grafico emerge che P1 è in grado di legarsi alla membrana, il segnale di RU

aumenta all’aumentare della concentrazione di peptide iniettata. Nonostante questo non

è possibile raggiungere la saturazione. Per questo motivo, tramite BiaEvaluation

Software, non è stato possibile calcolare accuratamente la KD, che viene stimata a

5,084E-4 M. Durante la fase di dissociazione a 32 μM la curva di binding non ritorna

alla baseline dopo il lavaggio con il running buffer, suggerendo che il peptide a questa

concentrazione forma un complesso stabile e irreversibile con i fosfolipidi della

membrana modello. Dai sensogrammi non si evidenzia una diminuzione improvvisa del

segnale, indicando che non ci dovrebbe essere uno sfaldamento del LUVs. [65]

Figura 4.18 - Sensogramma rappresentativo dell'interazione di P1 con DOPC (sopra) e curva di affinità(sotto). I sensogrammi sono stati ottenuti iniettando concentrazioni crescenti di P1 (0-32 μM) su DOPC LUVs immobilizzati su

chip L1. Le curve di affinità sono state adattate applicando il modello matematico “affinity-steady state”. Gli esperimenti sono stati eseguiti in duplicato.

82

Quindi conferma quanto emerso dagli esperimenti condotti al citofluorimetro in cui non

si evidenzia alcun effetto membranolitico.

Successivamente sono stati condotti gli esperimenti con P6, i risultati sono riportati in

Figura 4.19.

Figura 4.19 - Sensogramma rappresentativo dell'interazione di P6 con DOPC (sopra) e curva di affinità(sotto). I sensogrammi sono stati ottenuti iniettando concentrazioni crescenti di P6 (0-16 μM) su DOPC LUVs immobilizzati su

chip L1. Le curve di affinità sono state adattate applicando il modello matematico “affinity-steady state”. Gli esperimenti sono stati eseguiti in duplicato.

83

Osservando i grafici si può notare che P6, analogamente a P1, è in grado di legarsi alla

membrana, infatti, anche in questo caso, il segnale di binding aumenta all’aumentare

della concentrazione di peptide, ma mostra un comportamento molto diverso rispetto al

peptide precedente. Il segnale di RU cresce esponenzialmente, in maniera non lineare.

Si può osservare infatti un aumento netto che passa dai 2000 RU di binding quando si

inietta il peptide a 8 μM a 8000 RU quando la concentrazione è raddoppiata a 16 μM.

Questa anomalia nel segnale suggerisce che in corrispondenza di queste concentrazioni

il peptide forma degli aggregati, probabilmente anche degli oligomeri, sulla superficie

dei liposomi. In questo caso la curva non è propriamente una curva di affinità, ed è

perciò impossibile calcolare una KD. Anche in questo caso troviamo conferma dei

risultati condotti al citofluorimetro, dove tra 10 µM e 25 µM la percentuale di cellule

vitali diminuiva. Questo ci indica che probabilmente l’effetto tossico di P6 è

strettamente correlato con la formazione di dimeri/oligomeri.

Gli esperimenti successivi sono stati condotti usando come peptidi quelli appartenenti

alla classe delle Kiadine. Per quanto riguarda i liposomi, sono stati utilizzati gli stessi

fosfolipidi usati per gli altri peptidi, ovvero DOPC. I LUVs sono stati sintetizzati

mediante la stessa procedura.

Per quanto riguarda diPGLa-H i risultati degli esperimenti condotti sono riportati in

Figura 4.20. Dal sensogramma si nota che il peptide è capace di legarsi ai liposomi,

infatti è stato possibile calcolare una KD = 5,2 µM. I segnali di RU infatti aumentano

proporzionalmente in base alla concentrazione iniettata.

84

In seguito i successivi esperimenti sono stati condotti su K1. I risultati sono riportati in

Figura 4.21.

Figura 4.20 - Sensogramma rappresentativo dell'interazione di (PGLaH)2 con DOPC (sopra) e curva di affinità(sotto). I sensogrammi sono stati ottenuti iniettando concentrazioni crescenti di (PGLaH)2 (0-16 μM) su DOPC LUVs immobilizzati su chip L1. Le curve di affinità sono state adattate applicando il modello matematico

“affinity-steady state”.

85

Da questo grafico risulta che K1 è in grado di legarsi ai liposomi DOPC LUVs. Nel

sensogramma in corrispondenza di 8 µM e 16 μM la curva non torna alla baseline

durante la fase di dissociazione tramite il lavaggio con il running buffer. Questo indica

che il peptide forma un complesso stabile con i liposomi e non riesce a dissociarsi. Per

questo motivo non viene raggiunta la saturazione, e risulta impossibile calcolare una

KD. Rispetto a diPGLaH, si nota quindi un aumento dell’interazione con i liposomi e la

Figura 4.21 - Sensogramma rappresentativo dell'interazione di K1 con DOPC (sopra) e curva di affinità(sotto). I sensogrammi sono stati ottenuti iniettando concentrazioni crescenti di K1 (0-16 μM) su DOPC LUVs immobilizzati su

chip L1. Le curve di affinità sono state adattate applicando il modello matematico “affinity-steady state”.

86

formazione di un legame più forte rispetto al peptide precedente. Si noti infatti che il

segnale di RU raggiunge circa i 2000, contro i 600 raggiunti da diPGLaH.

Per quanto riguarda K2 i grafici sono riportati in Figura 4.22.



87

In questo caso il peptide K2 risulta anch’esso capace di legarsi ai liposomi, infatti si

nota che il segnale di binding aumenta all’aumentare della concentrazione di peptide.

Rispetto ai peptidi precedenti però, mostra un comportamento molto particolare alla

concentrazione di 16 µM: il segnale decresce improvvisamente. Questo potrebbe essere

dovuto a perdita del materiale immobilizzato sul chip, quindi probabilmente a rottura o

sfaldamento dei liposomi. L’esperimento è stato condotto in duplicato e il risultato è

stato confermato. Questa volta è stato possibile calcolare una KD che è risultata essere

rispettivamente 2,7 μM e 2,4 µM.

Per quanto riguarda K3 i risultati sono riportati in Figura 4.23.

88

Il peptide K3 risulta in grado di legarsi ai liposomi DOPC LUVs e con alta affinità. A

16 μM è capace di formare un complesso stabile con le membrane modello, infatti il

segnale di binding non ritorna alla baseline dopo i lavaggi con il running buffer. La KD

è stata calcolata 6,4 µM.



89


In questo grafico K4 risulta capace di legare i liposomi DOPC LUVs (esattamente come

le altre kiadine). A 16 µM forma un complesso stabile con le membrane modello, infatti

anche in questo caso il segnale di binding non ritorna alla baseline dopo i lavaggi con il



90

buffer. Dai due esperimenti che sono stati condotti, le KD sono state calcolate

rispettivamente 18 µM e 30 μM.




91

Nel caso di K5, ugualmente capace di legare i liposomi DOPC LUVs, si nota un diverso

profilo delle curve di affinità del sensogramma, forse dato da un meccanismo di

interazione differente. Non è stato possibile calcolare una KD perché la curva di affinità

non riesce a raggiungere la saturazione. Il valore è stato solamente stimato a 0,2 M.




92

Nel caso di K6, ugualmente capace di legare i liposomi DOPC LUVs, in corrispondenza

di 16 μM si può dedurre la formazione di un complesso stabile con le membrane

modello. Sono stati condotti due esperimenti e, nonostante questo, non è stato possibile

raggiungere la saturazione e calcolare un valore di KD. Analogamente a K1, il segnale

raggiunge circa i 2000 RU.

In Tabella 4-3 sono riportati i valori di KD calcolati per ciascun peptide appartenente

alle Kiadine.

PEPTIDE KD

diPGLa-H

5,2 μM

K1

n.d.

K2

2,5 μM

K3

6,4 μM

K4

24 μM

K5

n.d.

K6 n.d.

Tabella 4-3 - Valori di KD calcolati per ciascun peptide. n.d. - non viene raggiunta la saturazione e non è stato possibile calcolare un valore di KD

93

5. CONCLUSIONI

94

Questo progetto di tesi è stato svolto nell’ambito di una collaborazione scientifica con il

Dipartimento di Scienze dell’Università di Spalato, ed in particolare con il dott.

Roncevic che si sta occupando di un progetto di studio su peptidi antimicrobici

provenienti da Anuri. I peptidi sono stati valutati per le proprietà citotossiche in modelli

di cellule eucariote e per la capacità di interazione con membrane modello; i peptidi

antimicrobici oggetto dello studio sono stati denominati “serie P”, “Kiadine” e

“Clarkine”.

I peptidi della serie P derivano da studi bioinformatici di analisi di database incrociati

con dati di sequenziamenti di RNA di 5 specie di Ranidae; sono stati selezionati 6

peptidi, in base alla idrofobicità, carica e altri aspetti legati alla struttura, per essere

sintetizzati e testati come agenti antibatterici.

Le Kiadine sono invece peptidi ricchi in glicina/lisina, progettati mediante l’uso di un

algoritmo computazionale validato. Questi peptidi sono stati ottenuti sia attraverso la

modificazione di un peptide naturale denominato PGLa-H, sia attraverso una sintesi ab

initio mediante studi QSAR.

Gli esperimenti condotti sui peptidi della serie P, hanno portato ad affermare che P1 e

P6 sono i peptidi più citotossici della serie, in particolare nei confronti delle linee

cellulari in attiva proliferazione, mentre per quanto riguarda le colture primarie la

tossicità appare trascurabile. Associando i due peptidi, alle concentrazioni

batteriostatiche (MIC), l’associazione è ben tollerata da tutte le colture cellulari

utilizzate. Gli esperimenti condotti hanno portato ad affermare inoltre che la

citotossicità evidenziata in P6 appare influenzata dall’ambiente.

Per quanto riguarda la classe delle Kiadine, è interessante notare che le modifiche

introdotte nella sequenza amminoacidica vanno a influenzare il comportamento del

peptide e quindi anche la tossicità verso le cellule dell’ospite.

Kiadina-4, Kiadina-5 e Kiadina-6 presentano più modifiche nella sequenza

amminoacidica, rispetto a K2 e K3, essendo disegnate ab initio. Dai risultati degli studi

condotti in questo progetto, si deduce che l’introduzione di molte modifiche nella

sequenza amminoacidica porta ad un mantenimento della tossicità verso le cellule

dell’ospite. Si può notare, invece, che, singole modifiche apportate alla sequenza

95

amminoacidica, come nel caso di K2 e K3, portano ad un miglioramento della

citotossicità, senza influenzare l’attività antibatterica.

Tutti i peptidi perdono parzialmente la struttura ad alfa-elica in ambiente acquoso, in

particolare K5, che appare completamente destrutturata, anche quando viene a contatto

con le membrane cellulari. K5 infatti, oltre alla struttura secondaria, perde anche

l’attività antimicrobica. Comportamento confermato dal diverso profilo delle curve di

affinità del sensogramma degli esperimenti di SPR.

K2 e K6 si approcciano parallelamente alla membrana, mantenendo la struttura ad alfa

elica, mentre K3 e K4 assumono una posizione verticale, legandosi alla membrana con

il dominio N-terminale carico positivamente.

Per quanto riguarda K6 si osserva un profilo di tossicità analogo al “template” naturale.

Riassumendo, i peptidi meno citotossici appaiono essere K2 e K3. Dagli esperimenti al

Biacore però, è emerso che K2 provoca alla concentrazione più alta, rottura o

sfaldamento dei liposomi. Questo appare in disaccordo con i risultati dei test MTT dove

si osserva una vitalità cellulare di circa l’80%. Questo diverso profilo di citotossicità

porta ad ipotizzare che sussista lo stesso comportamento osservato nel caso di P6: la

citotossicità potrebbe essere influenzata dall’ambiente di incubazione; gli esperimenti al

Biacore sono infatti condotti in PBS, contrariamente ai test MTT condotti in TC.

In conclusione si può affermare che, tra i peptidi studiati e riportati in questa tesi, i

risultati più interessanti sono stati ottenuti con Kiadina-3, che potrebbe essere valutata

come antibiotico di nuova generazione, grazie alla sua attività contro batteri MDR e alla

sua limitata citotossicità, non influenzata dall’ambiente.

96

GLOSSARIO

ABC = ATP Binding Cassette

ABPs = antibiofilm peptides

ABSSSI = Acute Bacterial Skin and

Skin Structure Infections

ADPs = Automatically Designed

Peptides

AMPs = antimicrobial peptides

Arg = arginina

AVPs = antivirus peptides

BSA = siero di albumina bovina

CCCP = carbonyl cyanide m-

chlorophenyl hydrazone

CPPs = cell penetrating peptides

D.O. = densità ottica

DADP = Database of Anuran Defense

Peptides

DC = dicroismo circolare

DiOC6 = 3,3'-Dihexyloxacarbocyanine

Iodide

DOPC = 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-

phosphocholine

EDTA = acido

etilendiamminotetracetico

Ev = endovena

FBS = siero fetale bovino

FC = flow cell

FD = fattore di diluizione

FIC = fractional inibitory concentration

FSC = forward scatter

GLcN I = glucosamina I

GLcN II = glucosamina II

Gly = glicina

HDPs = host defence peptides

IC50 = concentrazione inibente il 50%

della popolazione

KD = costante di affinità

LPG = lisilfosfatidilglicerolo

LPS = lipopolisaccaride

LS = light scattering

LUV = large unilamellar vescicle

Lys = lisina

MBC = minima concentrazione

battericida

MDM = monocyte derived macrophage

MDR = Multi-Drug Resistance

MFI = intensità media di fluorescenza

MH = Müller-Hinton

MIC = minima concentrazione inibente

MprF = multiple peptide resistance

factor

MRSA = Methicillin-Resistant

Staphylococcus Aureus

MTT = bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-

2-il)-2,5-difeniltetrazolio

n.d. = non determinato

o.n. = overnight

PBS = phosphate buffered saline

PEG = polietilenglicole

97

P-gP = glicoproteina-P

PI = propidio ioduro

QSAR = Quantitative Structure-Activity

Relationship

RND = Resistance-Nodulation-Division

RU = resonance units

SI = Indice di Selettività

SPPS = solid-phase peptide synthesis

SPR = surface plasmon resonance

SPS = solution-phase synthesis

SRA = Sequence Read Archive

Database

SSC = side scatter

TB = trypan blue

TC = terreno completo

UV = ultravioletto

Val = valina

98

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of the human cathelicidin LL-37’, Peptide Science, 2018.

104

RINGRAZIAMENTI

Voglio ringraziare innanzitutto la Prof.ssa Sabrina Pacor, per avermi permesso di

svolgere la tesi sperimentale nel Dipartimento di Scienze della Vita, per avermi guidato

durante tutto il mio progetto con il suo costante aiuto, i suoi preziosi consigli e la sua

esperienza.

Ringrazio la Dott.ssa Filomena Guida per avermi accompagnato e sostenuto in questo

progetto e per avermi dato tutto l’aiuto possibile.

Vorrei ringraziare inoltre il Dott. Tomislav Rončević per la sua disponibilità e per il

materiale fornitomi per questa tesi.

Vorrei ringraziare tutte le persone che hanno fatto parte di questi ultimi anni della mia

vita, che mi hanno accompagnato in questo percorso che ho scelto di intraprendere.

Ringrazio i miei colleghi di laboratorio e i miei compagni di corso, che mi hanno

accompagnato con la loro quotidiana presenza, rendendo il tutto più piacevole e

divertente.

In particolare vorrei ringraziare Martina ed Erica, fedeli compagne di risate, senza di

voi, la vita triestina, sarebbe stata decisamente molto triste e piatta.

Un pensiero in particolare va a Federica, che non smetterò mai di ringraziare per tutto

l’appoggio e l’affetto dimostratomi. Grazie per il tuo costante supporto, per la tua

sincerità e la tua disponibilità. Mi hai insegnato a vedere sempre il lato positivo delle

cose e, anche se non so dove mi porteranno questi prossimi anni, sono sicura che ti

porterò sempre nel cuore.

Grazie a tutte le mie coinquiline per avermi sopportato e supportato nella quotidianità

della mia vita triestina, per avermi fatto ridere e divertire. Un grazie in particolare va

ad Ester, per avermi accolto e guidato fin dall’inizio. Grazie per avermi fatto sentire a

casa e per avermi accompagnato in questo mio viaggio.

105

Voglio ringraziare le mie amiche di sempre: Irene, Silvia e Alessandra. Nonostante la

distanza e nonostante la vita ci abbia portato a fare delle scelte e ad intraprendere

percorsi diversi, voi siete e sarete sempre con me. Grazie per essere state sempre

presenti in tutti questi anni e per esserci sempre.

Il mio ringraziamento più speciale va a te, Fabrizio, che mi hai accompagnato in

quest’ultimo anno. Vorrei dirti quanto io sia grata per averti accanto ogni giorno.

Grazie per essermi stato vicino nelle sfide della vita di tutti i giorni, grazie per avermi

ascoltato in qualsiasi momento, supportato in ogni mio passo, e sopportato in ogni

circostanza.

Ringrazio i miei genitori e mia sorella Chiara, che mi hanno sempre sostenuto in ogni

scelta che ho compiuto e che mi hanno accompagnato in ogni passo di questo viaggio.

Grazie a voi, che avete permesso tutto questo e avete creduto in me, fin dall’inizio, e

che ancora adesso, giorno per giorno, mi spronate a migliorare.

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