Università degli Studi di Milano - Laurea in Scienze Biologiche...

Università degli Studi di Milano - Laurea in Scienze Biologiche Laboratorio di Microbiologia generale - A.A. 2005-2006

Programma e organizzazione. Il laboratorio consiste in quattro esercitazioni (16 ore, 1 credito formativo) in cui si eseguiranno i seguenti esperimenti:

A. Isolamento e cararatterizzazione di microrganismi da campioni naturali. B. Antibiogramma. C. Analisi della crescita di microrganismi in coltura liquida.

Ogni esperimento è articolato in diverse attività che si svolgeranno in parallelo nei quattro giorni, come delineato nella tabella sottostante. L'acquisizione del credito richiede la frequenza delle quattro esercitazioni e la preparazione di una relazione in cui i risultati ottenuti personalmente dovranno essere presentati sinteticamente e discussi considerando l’esperimento eseguito dal gruppo e i risultati ottenuti complessivamente dall’intero laboratorio. Importante ricordare che la relazione non deve riportare i protocolli sperimentali (sono già descritti in questo fascicolo, inutile ricopiarli) ma i risultati e le conclusioni. Per ulteriori dettagli sulla relazione (come deve essere redatta, quando consegnarla) attenersi a quanto comunicato dai singoli docenti all'inizio del corso. Esp. A. Isolamento di microrganismi da campioni

naturali. B. Antibiogramma C. Analisi della crescita

microbica in coltura liquida. 1. A.1. Semina di microrganismi da campioni naturali. C.0. Istruzioni per C.1. 2. A.2. Isolamento di cloni puri da A.1. – conteggio C.1. Curva di crescita. 3. A.3. Analisi dei risultati di A.1. e A.2. B.1. B.1. Allestimento di

un antibiogramma C.2. Analisi dei risultati di C.1.

4. A.4. Caratterizzazione microscopica degli isolati: Preparazione e osservazione di preparati freschi e colorati. Raccolta e analisi dei dati

B.2. Analisi dei risultati di B.1.

- I partecipanti al laboratorio lavoreranno in gruppi di due studenti - I risultati ottenuti da ogni gruppo dovranno essere condivisi con gli altri, anche perché in genere

l'esperimento completo prevede il confronto dei risultati ottenuti da più gruppi. - La cooperazione di gruppo e tra gruppi deve comunque permettere a ciascun partecipante di

eseguire in prima persona tutte le operazioni sperimentali previste dal protocollo, ripartendo opportunamente il lavoro.

E' IMPORTANTE: - registrare le operazioni effettuate e annotare tutti i risultati ottenuti (inclusi eventuali fallimenti)

per le successive elaborazioni. Non fidatevi della vostra memoria! Tenete anche presente che i vostri dati dovranno essere condivisi con quelli di altri per ottenere il risultato complessivo dell'esperimento. La mancata registrazione dei risultati può compromettere il buon esito del laboratorio.

- marcare il materiale che producete (piastre, diluizioni etc.) in modo da identificare univocamente il turno, il gruppo di lavoro e il tipo di campione contenuto.

Microbiologia generale - Laboratorio - A.A. 2005-2006

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Scheda 1. NORME DI SICUREZZA IN LABORATORIO MICROBIOLOGICO. Da leggersi con attenzione prima di iniziare il lavoro.

1. Al vostro ingresso in laboratorio non depositate sui piani di lavoro cappotti, zaini, libri ed altri oggetti personali.

2. All’inizio e al termine di ogni sessione di lavoro i banchi devono essere puliti con una soluzione disinfettante che vi verrà fornita (Alcool denaturato, o altra soluzione disinfettante messa a disposizione).

3. Il laboratorio va considerato un ambiente a rischio: ogni comportamento deve essere consapevole e funzionale alle attività di lavoro. Attenzione e buon senso sono richiesti in ogni momento. Assicuratevi di aver localizzato tutte le possibili vie di uscita dal laboratorio.

4. Qualsiasi strumento o reagente presente nel laboratorio deve essere considerato potenzialmente pericoloso e/o nocivo, e va maneggiato con attenzione e secondo le istruzioni ricevute. Strumenti e reagenti notoriamente pericolosi saranno segnalati specificamente, e saranno date istruzioni d'uso specifiche. Particolare attenzione va posta nell'uso di gas, fiamma e apparecchi elettrici.

5. In laboratorio è rigorosamente vietato fumare, mangiare e bere. 6. Durante il lavoro in laboratorio è consigliato indossare il camice allo scopo di proteggere i

vestiti da contaminazioni accidentali (per alcune tipologie di laboratorio l'uso di camice e altri dispositivi di protezione personale è tassativo).

7. I capelli lunghi devono essere raccolti per minimizzare il rischio di incendiarli con la fiamma del Bunsen, o di contaminare il materiale sperimentale.

8. Oltre che alla protezione personale, i comportamenti nel laboratorio devono essere finalizzati alla corretta utilizzazione e manutenzione delle apparecchiature e del materiale sperimentale. Gli strumenti e i materiali che avete a disposizione possono essere molto costosi e vanno sempre trattati con cura adeguata. Il lavoro va sempre eseguito stando sopra il banco di lavoro. Dovendo spostare materiale in posti diversi, impugnarlo saldamente e/o trasportarlo negli appositi contenitori. Qualsiasi uso improprio del materiale di laboratorio deve essere evitato (ad esempio: le micropipettatrici sono strumenti di precisione e costano circa 250 Euro cadauna; abbandonarle sul bordo del bancone, con rischio di caduta, giocherellarci o usarle in modo improprio non è un comportamento responsabile).

9. Segnalate agli esercitatori qualsiasi malfunzionamento o ammanco. 10. Tutte le colture devono essere maneggiate come se fossero potenzialmente patogene. In

particolare devono essere sempre osservate le seguenti precauzioni: a. Le provette contenenti le colture devono essere sempre trasportate con apposito

portaprovette. b. Quando non in uso, le colture vanno lasciate nel portaprovette sul piano di lavoro. c. E’ vietato pipettare a bocca colture batteriche (salvo specifica indicazione). d. Gocce cadute accidentalmente dalle colture dovranno essere coperte con carta saturata

con soluzione disinfettante. Dopo 15 min circa, la carta potrà essere gettata negli appositi contenitori per rifiuti biologici.

11. L’asportazione dal laboratorio di qualunque materiale (soluzioni, strumenti, colture batteriche etc.) è rigorosamente vietata.

12. Al termine della sessione di lavoro vi sarà indicato come eliminare il materiale di scarto (in altre parole non gettate nulla senza prima chiedere se deve effettivamente essere buttato e dove). Il materiale biologico sarà scartato in appositi recipienti.

13. Lavatevi accuratamente le mani prima di lasciare il laboratorio (ovviamente, ciò va fatto anche prima di iniziare il lavoro).


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Scheda 2. LAVORO ASETTICO E TECNICHE DI STERILIZZAZIONE I microrganismi sono presenti praticamente ovunque benché, in certi ambienti, possano sopravvivere ma non moltiplicarsi. In un laboratorio microbiologico, dove i microrganismi si fanno crescere e si studiano in condizioni controllate, si deve evitare che i microrganismi presenti nell’ambiente e nei vari materiali d’uso si sviluppino nelle colture che si stanno studiando. Per evitare queste contaminazioni è necessario:

- Sterilizzare i terreni colturali, i recipienti e gli strumenti che si impiegano, prima di usarli. - Mantenere ciò che si utilizza o che si sta studiando al riparo da contaminazioni esterne,

eseguendo tutte le manipolazioni con tutte le precauzioni. Ricordate, come regola generale, che in laboratorio devono essere adottati tutti quei comportamenti finalizzati a:

- proteggere l'operatore dai rischi insiti nelle operazioni di lavoro. - proteggere il materiale che si utilizza (strumenti, reagenti, colture) da contaminazioni o

danneggiamenti. TECNICHE DI STERILIZZAZIONE PIU' COMUNI: Sterilizzazione fisica. - calore umido (autoclave): 121 °C (+ 1 atm), 15 min - calore secco (stufa a secco): 180 °C, 2 h - filtrazione: attraverso membrane di acetato, nitrato di cellulosa, o altri polimeri.

Diametro dei pori: 0,01-10 µm (in genere 0,2 o 0,45 µm). - radiazioni: - U.V. (240-280 nm) per superfici esterne, hanno scarso potere di penetrazione.

- radiazioni ionizzanti (raggi X, raggi gamma): effetto biocida dovuto alla ionizzazione dell’acqua intracellulare con produzione di radicali che danneggiano il DNA

Sterilizzazione chimica. - ossido di etilene: agente gassoso alchilante (come formaldeide e glutaraldeide). Bolle a 10,8°C.

Usato sotto pressione per sterilizzare materiale termolabile. Ossido di etilene: CH2 CH2

O

LAVORARE IN CONDIZIONI DI STERILITA': Le elementari tecniche di lavoro sterile vi saranno illustrate all'inizio del laboratorio. In particolare dovrete aver ben chiaro come:

- diluire sterilmente in provette da diluizione con pipette graduate. - diluire sterilmente in provette Eppendorf con micropipettatrice.

Nota 1: facendo diluizioni o trasferimenti di campione con pipette, chi pipetta deve avere il controllo totale dell'operazione e deve pertanto impugnare con una mano la pipetta e con l'altra la provetta con cui si opera. Per motivi di sicurezza personale e per l'accuratezza dell'operazione, è vietato pipettare da o in provette sostenute da altri. Nota 2: Il lavoro in condizioni asettiche non solo è indispensabile per la manipolazione corretta dei microrganismi, ma è anche un aspetto importante della protezione personale.


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Scheda 3. MATERIALI E METODI DI USO GENERALE E' inteso che tutto il materiale fornito è sterile e deve essere utilizzato secondo le procedure indicate. Tutte le operazioni dovranno essere condotte modo da garantire al massimo possibile le condizioni asettiche. TERRENI COLTURALI: E' riportata la composizione di un terreno liquido completo complesso ("brodo") e dello stesso solido (si aggiunge solitamente agar 15-20 g/l). Quando necessario, possono essere fatte aggiunte specifiche (vitamine, antibiotici etc) alle concentrazioni richieste. LB (Luria-Bertani broth) Estratto di lievito 5 gTriptone 10 gNaCl 10 gH2O 1 lpH 7.0 LBA LB 1 lAgar 20 g Per le diluizioni utilizzerete di norma: Soluzione Fisiologica (SF): NaCl 8.5 g/l USO DELLE MICROPIPETTATRICI Prima di iniziare il laboratorio familiarizzatevi con le micropipettatrici in dotazione. Assicuratevi di comprendere perfettamente le indicazioni degli istruttori relative a: - l'escursione dei volumi prelevabili con ciascun tipo di pipettatrice. - come variare il volume di prelievo. Attenzione a non forzare le ghiere volumetriche. - la corsa del pistone (spazio volumetrico, spazio morto di espulsione). - il prelievo, l'uso e lo scarto dei puntali. - come prelevare, trasferire e depositare con precisione il volume richiesto. TITOLAZIONE DI COLTURE BATTERICHE (CONTA VITALE) 1. DILUIZIONI SERIALI Eseguirete le diluizioni in provette Eppendorf monouso, con micropipettatrice. − Diluizioni 1:10 (x10): si inocula 100 µl di diluendo in 0.9 ml di diluente (SF) sterile. − Diluizioni 1:100 (x100): si inocula 10 µl di diluendo in 1 ml di diluente (SF) sterile. − Predisponete, in base alle diluizioni seriali che dovete eseguire, le provette Eppendorf da 2 ml

contenenti il diluente necessario. − Numerate progressivamente le provette in modo da poterle distinguere dopo che avete eseguito

le diluizioni. Tenete traccia sul brogliaccio di come eseguite le diluizioni richieste.


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− Le diluizioni devono essere eseguite in condizioni di sterilità ed è necessario mescolare accuratamente prima di prelevare il campione per effettuare la diluizione successiva.

− Scartate il puntale. La diluizione successiva dovrà essere fatta utilizzandone uno nuovo − Eseguite le diluizioni seriali. Vedi la figura per un esempio. NOTE:

Registrate sempre nel brogliaccio le diluizioni effettivamente eseguite e il volume seminato. Assicuratevi di aver compreso bene il concetto di diluizione seriale e di aver predisposto correttamente tutto il materiale necessario prima di iniziare il lavoro. Campione (µl) 10 10 100100

Diluente (ml)

Diluizione

Diluizionecomplessiva

Fattore didiluizione

10-0

100

1

10-2

10-2

102

0.9

10-1

10-5

105

0.9

10-1

10-6

106

1

10-2

10-4

104

Campione (µl) 10 10 100100

Diluente (ml)

Diluizione



10-0

100

1

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10-2

102

0.9

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10-5

105

0.9

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106

1

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Diluente (ml)

Diluizione



10-0

100

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10-2

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0.9

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106

1

10-2

10-4

104

Figura: Esempio di diluizioni seriali

2. SEMINA PER SPATOLAMENTO. a. Marcare sul fondo le piastre necessarie per l'esperimento. Apporre l'identificativo di turno,

gruppo e di campione. b. Depositare 100 µl della diluizione da titolare nella piastra corrispondente. Con una spatola

sterile (monouso, oppure in vetro, passata in alcol e flambata) spandere il campione sulla piastra spatolando finché il liquido è perfettamente assorbito.

c. Incubare le piastre capovolte in termostato a 30 °C per 24-48 ore.


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3. ANALISI DEI RISULTATI. 1. Osservare la morfologia delle colonie sviluppatesi durante l’incubazione (vedi Figura) 2. Contare le colonie in tutte le piastre in cui siano contabili. 3. Riportare nel brogliaccio i dati qualitativi e quantitativi per ciascuna piastra. 4. Stimare la carica batterica del campione naturale esprimendo il titolo come unità formanti

colonia/ml (ufc/ml). 5. Se necessario, conservate le piastre in frigorifero, oppure riunitele con nastro o in sacchetti di

plastica e scartatele negli appositi contenitori per rifiuti biologici.

Figura: Morfologia di colonie batteriche Nota: Ricordate che:

Titolo (ufc/ml) = n. di colonie in piastra x fattore di diluizione/volume (ml) seminato (o anche: n. di colonie in piastra/ diluizione x volume (ml) seminato

Es.: trovo 35 colonie sulla piastra derivata dalla diluizione 1:106 di un campione di acqua: Titolo del campione = 35 colonie/(10-6 x 0.1 ml) = 35 colonie x 106/0.1 ml = 3.5 x 108 ufc/ml = 35 colonie x 106 x 10/ml ossia 350 milioni di ufc/ml

Consigli: - Utilizzate preferenzialmente la “notazione scientifica” (es.: 3.4 x 106; 2.5 x107; 9.3 x108; etc.),

specialmente se trattate con numeri > 1000. Eviterete molti errori di calcolo e di lettura. - Non usate la calcolatrice per la parte esponenziale! Rischiate soltanto di fare errori. Sommare

mentalmente (o per iscritto) gli esponenti non dovrebbe essere un’impresa insormontabile. ATTENZIONE. E' importante riportare sempre la lettura effettiva di ogni dato sperimentale che si acquisisce, annotando anche eventuali inconvenienti (piastra contaminata, sparita, etc). Per il calcolo del titolo si consiglia di riportare , il fattore di moltiplicazione scomposto nelle sue due componenti: diluizione e volume.


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- Il titolo si calcola sul conteggio più significativo. Se si vogliono (e si possono) utilizzare i conteggi di diluizioni diverse, occorre calcolare la media pesata.

- Si calcolerà un solo titolo per campione, indipendentemente dal numero di piastramenti eseguiti.

STRISCIO SU PIASTRA PER OTTENERE COLONIE SINGOLE 1. Si preleva mediante un'ansa sterile (o altro utensile, es. stuzzicadenti) parte della patina di una

singola colonia, ben separata dalle altre, e si striscia sulla superficie di un opportuno terreno agarizzato in modo da rilasciare e separare sul terreno solido cellule singole che, dopo crescita, daranno origine a colonie distinte (ossia: si fa uno "striscio per colonia singola"). − Può essere utile risospendere la colonia in un piccolo volume di diluente (0.1 ml) ed eseguire

lo striscio a partire dalla sospensione. − E' opportuno suddividere lo striscio di un singolo campione in 3-5 parti, sterilizzando l'ansa (o

cambiando utensile) dopo ogni striscio e ripassandola sullo striscio precedente, allo scopo di diluire progressivamente il campione.

− Annotate origine (campione, terreno e diluizione di provenienza, condizioni di incubazione), e caratteristiche (dimensione, colore, forma) della colonia prelevata.

2. Incubare la piastra capovolta nelle condizioni di coltura opportune (nel nostro caso, 30 °C) fino a quando diverranno visibili le colonie. Una singola colonia ben distinta potrà essere prelevata singolarmente come capostipite di un clone ("isolato") batterico.

Figura: Schema di isolamento di colonia singola mediante striscio su piastra. TRAPIANTO DI UNA COLTURA PURA PER IL MANTENIMENTO DELL'ISOLATO ED INOCULO DI COLTURE PRIMARIE (pro memoria) 1. Si preleva mediante ansa sterile parte della patina cresciuta su piastra e si striscia su una

piastra di terreno fresco. 2. Il trapianto mantiene vitale nel tempo una coltura microbica sostituendo con terreno colturale

fresco il vecchio terreno esaurito. 3. Per la preparazione di colture primarie si stempera una colonia prelevata sterilmente con un'ansa

in un piccolo volume (5-100 ml) di terreno liquido appropriato, che sarà incubato fino a saturazione (fase stazionaria). La coltura primaria potrà essere usata per inoculare una o più colture secondarie.

4. Colture secondarie non dovranno essere utilizzate per inoculare successivamente altre colture (salvo, ovviamente, specifico interesse).


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INCUBAZIONE IN ANAEROBIOSI La ricerca e la conta di microrganismi anaerobi implica l’incubazione in assenza di O2. I metodi più efficaci contemplano l’uso di cabine anaerobiche o di contenitori a tenuta (es. giare per Gas Pack) L’atmosfera anaerobica viene realizzata eliminando chimicamente l’O2 presente. Le procedure più comunemente utilizzate sono: a Na-boroioduro, Na-carbonato e acido citrico vengono posti, in quantità determinate, a contatto

con acqua. In ambiente acido dal primo composto si sviluppa H2 e dal secondo CO2. E’ presente anche del Palladio, che catalizza la reazione 2H2 +O2 = 2H2O L’ossigeno viene in tal modo eliminato dalla fase gassosa. Entro 1-2 ore, l’aria presente nel recipiente a tenuta viene così trasformata in un’atmosfera N2+CO2+H2 (H2 rimane un eccesso).

b Polvere di Fe++. Inumidita condizione Fe++ si ossida legando l’O2 presente. Non è necessario un catalizzatore, ma il processo è più lento del precedente e non si forma CO2, indispensabile alla crescita di certi microrganismi anaerobi.

Per queste e altre procedure sono disponibili in commercio apposite bustine (es.: GasPack) da inserire nelle giare, che si attivano per aggiunta di acqua, oppure al contatto con l'aria. Il raggiungimento e mantenimento dell’anaerobiosi viene visualizzato da un “indicatore di anaerobiosi”. Si tratta, ad esempio, di una striscia di carta assorbente, impregnata di blu di metilene, il quale inizia a virare dal blu al bianco quando l’O2 scende all’incirca sotto le 1.000 ppm (nell’aria ci sono quasi 210.000 ppm di O2 vol/vol). In ogni caso nella giara la concentrazione di O2 scende sotto le 100 ppm. Immediatamente dopo la semina e la solidificazione dell'agar le piastre verranno riposte, capovolte, nella giara, unitamente ai reattivi necessari per ottenere l’anaerobiosi, e incubate alla temperatura desiderata. Figura A-1: Giara e Gas Pack per incubazione in anaerobiosi. Altre tecniche saranno illustrate quando necessario.


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Esperimento A. ISOLAMENTO DI MICRORGANISMI DA CAMPIONI NATURALI.

Obiettivo: Con questo esperimento si valuterà qualitativamente il contenuto microbico di alcuni campioni naturali (Esperimento A.1), e si isoleranno cloni puri di microrganismi ambientali (A.2, A.3). Questi saranno ulteriormente caratterizzati per alcune caratteristiche fisiologiche (A.3 e C.1) e a livello microscopico (A.4). Le procedure che utilizzeremo permetteranno di isolare e caratterizzare parzialmente alcune specie comuni di microrganismi eterotrofi aerobi (obbligati o facoltativi) e di anaerobi (perlopiù aerotolleranti). Si apprenderanno alcune tecniche-base di microbiologia (lavoro in condizioni asettiche; semina in piastra, titolazione di una coltura batterica (conta vitale), colorazioni e osservazione al microscopio) Traccia dell'esperimento. La microflora presente in un determinato campione naturale sarà evidenziata mediante la tecnica del "conteggio vitale in piastra". 1. Vi saranno forniti campioni ambientali (acqua, terra, compost o altro, come vi sarà specificato) e

colture pure di riferimento. 2. Un'aliquota di alcuni campioni subirà preventivamente un trattamento di pastorizzazione

(riscaldamento a 80°C per 10 min) per facilitare l'isolamento di batteri sporigeni. 3. I campioni saranno diluiti serialmente e seminati in terreno di coltura solido in capsule di Petri

(piastre) mediante spatolamento. 4. Le piastre inoculate saranno incubate in aerobiosi oppure in anaerobiosi a temperatura costante

(30 °C) per qualche giorno. 5. I microrganismi capaci di moltiplicarsi in queste condizioni colturali daranno origine a "colonie"

visibili a occhio nudo. Idealmente, ogni colonia è costituita da cellule derivate da una singola cellula microbica iniziale. - Il numero delle colonie che si svilupperanno su ogni piastra sarà funzione del numero di cellule presenti nel campione, della diluizione effettuata e del volume seminato. Assumendo che ogni colonia abbia avuto origine da una singola cellula sarà quindi possibile risalire al numero di microrganismi "capaci di formare colonia nelle condizioni sperimentali utilizzate" presenti per unità di volume del campione originale (conta vitale totale). - L'eterogeneità della morfologia delle diverse colonie è un primo indice della diversità delle specie microbiche presenti nei campioni analizzati.

6. Una colonia ben isolata ottenuta dal primo piastramento, sarà successivamente "purificata" mediante "striscio" in piastra allo scopo di ottenere cloni puri, e se ne verificherà la capacità di crescere anche in anaerobiosi e la sensibilità ad alcuni antibiotici (C.1).

7. Il materiale ottenuto da questo esperimento sarà utilizzato per un'ulteriore caratterizzazione microscopica (A.4).

Ogni gruppo si farà carico di un campione, eseguendo tutte le operazioni previste per la sua analisi. A.1. Semina di microrganismi da campioni naturali in terreni di coltura solidi. 1. Saranno assegnate ai diversi gruppi campioni diversi che potranno essere trattati in modo diverso.

Prendete nota del campione e delle operazioni che saranno assegnate al vostro e agli altri gruppi. 2. Alcuni gruppi designati pastorizzeranno il campione incubandolo per 10 min a 80 °C. 3. Diluire il campione serialmente e seminare in piastra mediante spatolamento 0.1 ml delle

diluizioni indicate nel prospetto. Per ogni campione sarà indicata la serie di diluizioni e di piastramenti da eseguire. Riportate il tutto nella tabella sottostante.

3. Incubare le piastre capovolte a 30 °C per 24-48 h in aerobiosi oppure in giare da anaerobiosi, come assegnato al vostro gruppo.


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SCHEMA ASSEGNAZIONE DELLE COLTURE RISULTATI Grup-

po Cam-

pione n. Pastoriz-zazione

Aero/ Anaero-

biosi

Diluizioni e piastramento n. colonie Titolo (ufc/ml)


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SCHEMA DILUIZIONI, PIASTRAMENTI E RACCOLTA DATI (lo schema è puramente indicativo, quello effettivo vi sarà illustrato dagli esercitatori e potrà variare da campione a campione. Sostituite nello schema sottostante, e riportate sinteticamente nella tabella, le diluizioni che dovete eseguir e i risultati che otterrete)

RISULTATI DILUIZIONI SERIALI N° COLONIE DESCRIZIONE

x100 x100 x10 x10 ─→ piastra 1 _______ _________________________________ │ │ │ └─────→ piastra 2 _______ _________________________________ │ └────────→ piastra 3 _______ _________________________________

TITOLO (ufc/ml): _________ A.2. Isolamento di clone puro e analisi della crescita in anaerobiosi STRISCIO SU PIASTRA PER OTTENERE COLONIE SINGOLE Scopo di questa operazione è ottenere una coltura pura di un ceppo microbico proveniente da un campione eterogeneo (campione naturale, coltura mista, etc.). Ogni studente purificherà una colonia (quindi due colonie per gruppo), scelta tra quelle ottenute nel piastramento A1. Vedere sopra (istruzioni generali) come eseguire lo “striscio per colonia singola” e procedere come segue: 1. Risospendere bene una colonia in 100 µl di soluzione fisiologica. 2a. Gruppi che hanno incubato le piastre in aerobiosi: ogni studente farà uno striscio su mezza piastra di LBA (i due strisci di un gruppo in una piastra) che sarà incubata a 30 °C in aerobiosi. Lo striscio sarà ripetuto su un quarto di una seconda piastra (i quattro strisci di due gruppi in una piastra) che sarà incubata in giare da anaerobiosi a 30 °C. 2b. Gruppi che hanno incubato le piastre in anaerobiosi: ogni studente farà uno striscio su mezza piastra di LBA (i due strisci di un gruppo in una piastra) che sarà incubata a 30 °C in giare da anaerobiosi. Lo striscio sarà ripetuto su un quarto di una seconda piastra (i quattro strisci di due gruppi in una piastra) che sarà incubata in aerobiosi a 30 °C. Riportare di seguito le osservazioni relative alla crescita degli strisci in aerobiosi e in anaerobiosi. A.3. Rinnovo dello striscio Una colonia ben isolata dallo striscio A.2 sarà ristrisciata. Questa operazione sarà fatta dagli istruttori il giorno prima dell’ultimo laboratorio, in modo da avere colonie fresche per l’analisi microscopica successiva A.4.


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Esperimento A.4: OSSERVAZIONE AL MICROSCOPIO DI PREPARATI A FRESCO E COLORATI

La morfologia dei batteri può essere esaminata al microscopio ottico sia osservando direttamente i microrganismi vivi in preparati umidi, sia dopo fissazione e colorazione specifica. VETRINO PREPARATO A FRESCO DA OSSERVARE CON MICROSCOPIO CON CONTRASTO DI FASE 1. Depositare su un vetrino porta oggetto una piccola goccia di acqua (~10-20 µl, a seconda che il

vetrino copri oggetto disponibile sia quadrato o rettangolare). 2. Prelevare sterilmente con l’ansa parte di una colonia ben isolata, sospenderla nella goccia di

acqua, sino ad ottenere un leggero intorbidamento. 3. Ricoprire con un vetrino copri oggetto. Evitare che si formino bolle d'aria. 4. Osservare in contrasto di fase. FISSAZIONE AL CALORE PER PREPARATI DA COLORARE (vedi FIGURA 1 di seguito) 1. Sgrassare alla fiamma il vetrino portaoggetti. 2. Depositare su vetrino una goccia di acqua (~10-20 µl). 3. Prelevare sterilmente con l’ansa parte di una colonia ben isolata, sospenderla nella goccia

d'acqua sino ad ottenere un leggero intorbidamento e stendere uniformemente su almeno metà del vetrino la sospensione batterica. Oppure, stendere uniformemente una goccia di coltura liquida ben cresciuta.

4. Asciugare all'aria (eventualmente ventilare in prossimità della fiamma, ma non mettere il vetrino sopra la fiamma finché non è asciutto).

5. Fissare il preparato passando il vetrino per 3 volte direttamente sulla fiamma. 6. Colorare con le metodiche sotto descritte. 7. Osservare al microscopio con obiettivo a immersione. COLORAZIONE DI GRAM (vedi FIGURA 2 di seguito) Si basa sulla permeabilità differenziale della parete dei batteri: tutti i batteri si colorano blu-viola con cristal violetto, ma quelli che hanno una parete ricca di lipidi e con strato di peptidoglicano sottile (Gram-negativi) vengono decolorati rapidamente da solventi organici (alcool etilico e/o acetone) mentre quelli con parete priva di lipidi e con uno spesso strato di peptidoglicano (Gram-positivi) non vengono decolorati. Lo iodio agisce da mordenzante (fissante) del cristal violetto. Per poter vedere i batteri decolorati si esegue una seconda colorazione, tipicamente con safranina che colorerà in rosso i Gram-negativi. ATTENZIONE: Se le cellule dei batteri Gram-positivi non sono in attiva crescita, le loro pareti possono essere parzialmente idrolizzate e apparire di colore tendente al rosso come i Gram-negativi. Attenzione anche al tempo di trattamento con il colorante secondario: la safranina potrebbe coprire la colorazione di Gram).


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ESECUZIONE: Seguire la procedura illustrata in FIGURA 2 di seguito. Per i tempi, attenersi a quanto riportato in tabella.

Fase Procedura-tempo Colore osservabile gram+ gram-

Colorazione di Gram cristal violetto (2% in alcol 20%) - 60 s violetto violetto Mordente sol. di Lugol (iodio-ioduro 1%) - 45 s violetto violetto Decolorazione etanolo 95% fino a decolorazione violetto incolori Colorazione di contrasto safranina (2.5% in alcol 95%) - 15 s violetto rosa COLORAZIONE DELLE SPORE Il verde malachite impregna e non viene lavato via dalle strutture specifiche del rivestimento delle spore, mentre non si fissa alle strutture delle cellule vegetative. 1. Fissare il preparato come descritto sopra (vedi Figura 1). 2. Ricoprire lo striscio con Verde malachite e disporre il vetrino su una piastra riscaldante (o sopra

il bunsen) fino a che il campione emette vapori ma senza bollire. 3. Tenere il preparato in questa condizione per 3 min, aggiungendo se necessario Verde malachite

per mantenere il campione sempre ricoperto di colorante. 4. Lasciar raffreddare il vetrino. Lavare con acqua. 5. Colorare con Safranina per 3 min 6. Lavare con acqua e lasciar asciugare all'aria. 7. Osservare al microscopio con obiettivo a immersione. Le spore si colorano di verde, le cellule vegetative di rosso.


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FIGURA 1. Preparazione e fissazione di uno striscio batterico.


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FIGURA 2. Colorazione di Gram. Per i tempi di trattamento con i diversi reacenti riferirsi alla tabella nel testo.


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Esperimento B: ANTIBIOGRAMMA E’ un test che consente di determinare velocemente la sensibilità di un microrganismo ad una serie di antibiotici. Può fornire utili indicazioni per la scelta della terapia antibiotica da adottare nel trattamento di infezioni batteriche. Il microrganismo in esame è piastrato per inclusione con la tecnica dell'agar soffice (top agar o soft agar) su un terreno di coltura agarizzato. Sulla superficie del terreno sono poi depositati dischetti di carta da filtro, ciascuno imbevuto con un determinato antibiotico. La diffusione dell’antibiotico nel terreno forma un gradiente di concentrazione intorno al dischetto: quanto più il microrganismo è sensibile, tanto maggiore è il diametro dell’alone di inibizione della crescita che si evidenzierà intorno al dischetto. B.1. ESECUZIONE Batteri: colonie di ceppi isolati da diversi campioni e ceppi di riferimento Terreno: LB agar (solidificato) e LB agar soffice (7g/l; sciolto) 1. Una colonia batterica viene stemperata in 0,1-0,2 ml di fisiologica. Con questi si inocula una

provetta contenente 5 ml di LB agar soffice, precedente sciolta a 100°C e poi raffreddato a 45°C-50°C (alternativamente si può inoculare con 0,1-0,2 ml di coltura del batterio in esame). Dopo l’agitazione l’agar soffice viene versato in una piastra contenente 15 ml di LB agar già solidificato.

2. Quando anche lo strato di agar soffice si è solidificato, si depongono sulla sua superficie i dischetti, servendosi di una pinzetta sterile.

3. La piastra viene posta ad incubare a 35°C-37°C per 18/24 ore prima della lettura. La sensibilità del batterio in esame verso i diversi antibiotici viene evidenziata dalla presenza di un alone di inibizione della crescita intorno ai singoli dischetti. Il criterio di valutazione (resistente, intermedio, suscettibile) è strettamente collegato con la dose di antibiotico contenuta in ciascun dischetto, tenendo conto della velocità di diffusione nell’agar di ogni singolo antibiotico. NOTA: I gruppi che non hanno ottenuto crescita di colonie in aerobiosi, utilizzeranno un clone

isolato da un altro gruppo. CEPPO: ____________________________

ANTIBIOTICO Q/ DISCHETTO

DIAMETRO DI INIBIZIONE

(mm)

VALUTAZIONE

Cephalothin 30 µg Ciprofloxacin 5 µg Sulfamethoxazole + Trimetoprim

23.75 µg 1.25 µg

Vancomycin 30 µg


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Esperimento C. ANALISI DELLA CRESCITA DI COLTURE PURE ED EFFETTO DI ANTIBIOTICI.

Verrà seguita la crescita di una coltura batterica misurando l'incremento di torbidità (funzione della biomassa presente). A tempi diversi dopo l'inoculo della coltura saranno effettuati prelievi e se ne determinerà la densità ottica a 600 nm (OD600) allo spettrofotometro. Ogni gruppo eseguirà una curva di crescita di un ceppo batterico specifico. Dopo 90 minuti dall’inizio dell’incubazione, sarà aggiunto un antibiotico o un placebo di controllo, come assegnato al gruppo di lavoro, per osservarne l’effetto sulla crescita. Materiale fornito: - Saranno forniti inoculi di ceppi batterici diversi cresciuti in terreno LB a saturazione per una notte a

37 °C con agitazione. - Beuta contenente 20 ml di terreno LB. - Bottiglia con soluzione fisiologica per le diluizioni. - Cuvette per spettrofotometro. Per la lettura allo spettrofotometro basta 1 ml, ma non meno, di

campione. - Campioni di antibiotici in soluzione acquosa o placebo (acqua). - Carta da grafico lineare e semilogaritmica. PROCEDURA PER MISURARE LA DENSITA’ OTTICA 1. Una cuvetta rimarrà fissa in ogni spettrofotometro e farà da riferimento per la lettura delle

cuvette dei vari gruppi. 2. Le letture dei campioni ai vari tempi di crescita si eseguiranno trasferendo 1 ml di coltura in

cuvetta e leggendo la OD600. PROCEDURA: 1. Inoculare la beuta contenente 19.6 ml di LB con 0.4 ml di coltura primaria (diluizione =___). 2. Agitare la beuta per rimescolare. 3. Prelevare 1.5 ml ed eseguire la lettura OD600. Riportare il valore nella tabella sottostante. 4. Subito mettere la beuta in bagno agitato a 37°C; iniziare a misurare il tempo (t=0). 5. Ai tempi riportati in tabella, ripetere la lettura allo spettrofotometro. 6. A 90 min, sarà aggiunto l’antibiotico da saggiare (in soluzione acquosa) o il placebo (acqua) in

rapporto 1:50 del volume di coltura rimanente dopo i prelievi. gruppi 1-4-7: ___ µl acqua distillata sterile. gruppi 2-5-8: ___ µl streptomicina 5 mg/ml (conc finale ___ µg/ml). gruppi 3-6-9: ___ µl ampicillina 5 mg/ml (diluire 1:50, conc finale ___ µg/ml). gruppi ____: _____________________________________________________

ANALISI DEI RISULTATI

1. Riportare in grafico i valori di densità ottica (ciascuno costruisca un grafico semilogaritmico; provate anche a riportare i dati in grafico lineare e osservate le differenze sia nella definizione degli assi che nella forma del grafico ottenuto).

2. Ciascuno studente riporti i dati relativi ad almeno un ceppo batterico con placebo/streptomicina/ampicillina (quindi i dati propri e quelli dei due altri gruppi collegati).

3. Valutare e commentare l'andamento della curva dei diversi ceppi batterici. 4. Calcolare il tempo di generazione dei diversi ceppi nelle condizioni di crescita utilizzate. 5. Valutare le conseguenze dell’aggiunta di antibiotico nelle diverse specie.


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SCHEMA SPERIMENTALE E RISULTATI (riportate l'ora effettiva e il tempo dall'inizio dell'esperimento, se diverso da quello indicato)

h Tempo

(min)

OD600 NOTE

0

30

60

90 aggiungere antibiotico o placebo:

120

150

180

210

240


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TABELLA RIASSUNTIVA DATI ESPERIMENTO A. Clone purificato

Crescita in Morfol./ Gram Spore Cam-pione

n.

Grup-po

TITO-LO

(ufc/ml)

Morfologie della colonia analizzata

aero-biosi

anaero-biosi

Motilità

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