UNITA’ DI RICERCA POLITECNICA DELLE MARCHE Direttore Scientifico: Dott.ssa Elisabetta Giorgini

La Spettroscopia Infrarossa è una tecnica analitica molto versatile che permette di studiare a livello molecolare materiali di diversa natura, omogenei e non. L’interazione della materia con la radiazione infrarossa provoca transizioni vibrazionali che interessano i legami chimici. L’analisi di tali transizioni permette di definire sia la composizione che la struttura dei composti chimici in esame. La spettroscopia FTIR Imaging consente l’acquisizione di mappe chimiche (ca. 1000x1000 micron) di campioni non omogenei. Tramite questa mappatura è possibile identificare le diverse componenti molecolari e la loro distribuzione nella matrice in esame, con la possibilità di valutare le proprietà funzionali e strutturali del campione stesso. La spettroscopia FTIR Imaging si è rivelata fondamentale nel settore biomedico e in quello dei biomateriali, nell’acquisizione delle immagini per lo studio delle caratteristiche composizionali, strutturali e morfologiche di svariati sistemi, primi fra tutti quelli biologici. Oltre alle normali sorgenti convenzionali e ai comuni detector, si avvale anche di sorgenti non convenzionali, quali la luce di sincrotrone, che con la sua brillantezza permette di ottenere un’elevata risoluzione, e di multidetectors (FPA, Focal Plane Array detector) in modo da ottenere acquisizioni di aree abbastanza grandi in tempi rapidi e con risoluzione spaziale fino al limite della diffrazione. L’elevato numero di dati spettrali contenuto in una mappa chimica richiede un appropriato trattamento statistico, per valutare le singole bande e/o i rapporti di banda significativi del sistema in esame. Il trattamento dei dati è effettuato mediante l’uso di software dedicati, quali Spectrum 10.4 e Spectrum AutoImage 5.1.0 (Perkin Elmer), Pirouette 4.5 (Infometrix), OPUS 7.1 (Bruker), CytoSpec 2.0, Grams AI 9.1 (Galactic). ANALISI FTIR IMAGING DI CELLULE E TESSUTI DA LESIONI EPITELIALI Il gruppo di ricerca dell’Università Politecnica delle Marche si occupa da diversi anni dello studio vibrazionale di varie lesioni tumorali di natura epiteliale, con lo scopo di discriminare i diversi tipi di lesioni e il corrispondente grado di malignità tramite l’individuazione di specifici marker spettrali caratterizzanti le diverse patologie. Sebbene esistano specifiche tecniche immunoistochimiche per l’analisi delle differenti lesioni tumorali, la Spettroscopia FTIR Imaging può sicuramente giocare un ruolo determinante nella diagnosi precoce della malattia, in quanto una modifica a livello molecolare (valutabile con metodi spettroscopici) si manifesta sicuramente prima di una modifica morfologica (di competenza dell’anatomo-patologo). Numerose ricerche sono state condotte sia su campioni air-dried (sezioni di tessuto provenienti da resezione chirurgica) secondo una procedura ben consolidata, che in living (colture cellulari primarie da biopsie mantenute in soluzione fisiologica). Grazie all’utilizzo di un’innovativa cella microfluidica progettata e realizzata dai ricercatori della beamline SISSI, Elettra Sincrotrone (Trieste), con i quali abbiamo in atto numerosi progetti di proficua collaborazione, è possibile analizzare cellule vive in soluzione fisiologica, mimando quindi una realistica situazione biologica. Questa nuova procedura è stata applicata con successo su colture cellulare primarie di Carcinoma Squamocellulare del cavo orale (OSCC_G1) e su cellule epiteliali sane (CTRL), entrambe prelevate da biopsia. Per i due gruppi sperimentali sono stati acquisiti anche gli spettri IR su campioni seccati all’aria, in modo da valutare gli effetti della disidratazione sulle varie componenti cellulari e, di conseguenza, sul profilo spettrale. Per quanto riguarda l’analisi FTIR di cellule in soluzione fisiologica (Fig.1), l’analisi ha evidenziato i seguenti marker spettrali relativi al Carcinoma Squamocellulare del cavo orale di grado G1: (1) l’insorgenza di effetti epigenetici (incremento della banda a 934 cm-1, Z-DNA,);

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(2) una maggiore attività cellulare (aumento di RNA, 1221 e 992 cm-1), e (3) una maggiore quantità di glicogeno (1155 e 1024 cm-1). L’analisi comparativa degli spettri medi dei due gruppi sperimentali (DII), ha mostrato profili spettrali simili (Fig. 2), confermando la validità di entrambe le procedure di acquisizione.

Lo sviluppo della cella microfluidica e la conferma della fattibilità dell’acquisizione IR in tali condizioni, aprono nuovi scenari nello studio di cellule vive sottoposte a diversi trattamenti. Il nostro gruppo sta al momento definendo una serie di esperimenti per valutare lo stress termico e ossidativo di cellule tumorali del cavo orale, come pure la risposta di tali cellule al trattamento con specifici farmaci chemioterapici. Oltre allo studio di cellule in living, si è continuata anche l’analisi di sezioni di tessuto con diverse patologie epiteliali prelevate tramite resezione chirurgica. I Nevi di Spitz sono lesioni melanocitiche benigne, che presentano in alcuni casi problemi diagnostici (es., nevi di Spitz atipici). Il nostro gruppo di ricerca ha condotto uno studio FTIR sui melanociti spitzoidi, con lo scopo di definire per ognuno di essi dei markers spettrali inequivocabili e di acquisire informazioni in merito alle lesioni “border line”. In particolare, lo studio è stato condotto su singoli melanociti derivanti da epitelio sano (C), melanoma maligno spitzoide (MM) e nevi di Spitz classico (CSN), desmoplastico (DSN) e atipico (ASN). L’analisi FTIR è stata condotta in parallelo con quella istologica. All’interno di ciascuna mappa chimica è stato possibile individuare e isolare, tramite analisi UHCA (Unsupervised Hierarchical Cluster Analysis), i principali elementi tissutali (melanociti, melanofagi, connettivo, epitelio, ecc.), per ognuno dei quali è stato estratto lo spettro medio (Fig. 3). Particolare attenzione è stata dedicata ai cluster dei diversi melanociti, che risultano avere caratteristiche spettrali diverse, come mostrato dalla PCA in Fig. 4.

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L’analisi vibrazionale condotta sugli spettri medi dei diversi melanociti ha permesso di trarre le seguenti conclusioni: (i) nel nevo di Spitz classico si osserva un aumento dei processi fosforilativi (1172/1158 cm−1, νC-O non H-bonded/ν C-O H-bonded); (ii) il nevo di Spitz displastico presenta un diverso pattern proteico con un incremento delle strutture di tipo elica (elica/β); aumenta anche la lunghezza delle catene laterali delle proteine (2923/2959 cm−1, vasymCH2/vasymCH3), mentre diminuisce il contenuto di glicogeno (1045/1545 cm−1, glicogeno/Ammide II); (iii) anche nel nevo di Spitz atipico aumentano nelle proteine le strutture secondarie di tipo elica; per quanto riguarda le catene alchiliche, oltre a un incremento della lunghezza, si osserva, solo in questo caso, un maggior grado di insaturazione (3013/2959 cm−1,v=CH/vasymCH3); a livello di acidi nucleici, si nota una maggiore quantità di DNA (963/997 cm−1,DNA/RNA); (iv) nel melanoma maligno spitzoide diminuisce invece il rapporto tra le strutture elica/β, mentre aumenta il contenuto di RNA (1125/1020 cm−1 ,νC-O RNA/νC-O DNA). Nell’ambito delle lesioni epiteliali del cavo orale, è in corso un’analisi comparativa FTIR fra il comune polipo infiammatorio dei seni paranasali (SNP, a), il papilloma Schneideriano invertito benigno (BSP, b) e displastico (DSP, c), e il carcinoma indifferenziato dei seni paranasali (SNUC, d) (Fig. 5).

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Tramite PCA, è stato possibile separare gli spettri IR dei diversi tipi di epitelio: transizionale (Tre, cluster rosso) e displastico (De, cluster blu), corrispondenti rispettivamente al papilloma Schneideriano invertito benigno e displastico, tumorale (Te, cluster verde) nel carcinoma indifferenziato e respiratorio (Re, cluster rosa) tipico del polipo infiammatorio. In particolare, PC1 discrimina bene l’epitelio respiratorio da quelli di natura neoplastica, mentre tramite PC2, è stato possibile ottenere una discreta separazione fra gli epiteli di tipo Schneideriano e quello tumorale. Per i vari tipi di epitelio, diversi rapporti di banda sono stati calcolati. L’analisi dei risultati è in corso al fine di individuare per ciascuna lesione epiteliale, dei marker spettrali utili al fine di una diagnosi precoce. Un risultato interessante è stato ottenuto dall’analisi multivariata dei dati spettrali acquisiti su cisti del cavo orale di varia natura, quali tessuto sano (1), carcinoma squamocellulare G3 (2), carcinoma adenocistico (3), adenocarcinoma polimorfo a basso grado (4), epitelio squamoso displastico (5), tunore odontogenico cheratocistico (6), cisti radicolare (7), cisti residua (8), ameloblastoma unicistico (9), and fibroma ameloblastico (10). L’analisi HCA dei vari compartimenti epiteliali nell’intervallo spettrale 1800-900 mostra la sovrapposizione dei clusters 5,10 e 4,7, che presentano epiteli simili (Fig. 6). Restringendo l’analisi nella regione dei fosfati e degli acidi nucleici (1350-900 cm-1), si ottiene una migliore separazione con l’ameloblastoma unicistico (9) suddiviso in tre gruppi, in quanto caratterizzato da tre diversi epiteli (A,B,C, Fig. 6).

L’analisi l’HCA dei connettivi di campioni tumorali, è risultata addirittura più indicativa rispetto alle zone epiteliali. La sovrapposizione spettrale del displastico (5) con l’ameloblastoma unicistico

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(9) e del tumore cheratostico odontogenico (6) con il connettivo sano (1), confermano che queste lesioni infiltrano il tessuto connettivo. ANALISI VIBRAZIONALE DI GAMETI UMANI Da diversi anni il nostro gruppo di ricerca collabora con il centro di riproduzione assistita TECNOBIOS, Bologna, per lo studio delle problematiche relative alle tecniche di inseminazione artificiale. A tale proposito per la prima volta è stata utilizzata la tecnica FTIR Imaging per lo studio di gameti femminili e maschili, con lo scopo di individuare dei marker spettrali relativi a una buona qualità di oociti e spermatozoi. L’analisi FTIR Imaging è stata effettuata su oociti supernumerari MII freschi e congelati (processo di slow freezing) prelevati da pazienti consenzienti.

I dati vibrazionali mostrano che la tecnica di crioconservazione non causa degradazione degli acidi nucleici, anche se piccole modificazioni sono state osservate nella composizione macromolecolare degli oociti, soprattutto nel pattern proteico e nei lipidi.

Per quanto riguarda l’infertilità maschile, sono stati analizzati spermatozoi da pazienti affetti da i teratospermia (TS), astenozoospermia (AS), oligozoospermia (OS). Significative modificazioni spettrali sono state trovate fra spermatozoi sani (NS) e quelli derivanti da pazienti affetti dalle patologie sopra citate, nelle regioni dei lipidi e delle bande AI/II. In particolare in TS e AS, sono stati osservati una maggior grado di perossidazione delle catene alchiliche (3011 cm-1, ν=CH) e diversa struttura secondaria delle proteine.

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Un interessante progetto, in collaborazione con TECNOBIOS e Elettra-Sincrotrone, è stato finanziato dalla Merk Serono, per l’applicazione della tecnica FTIR Imaging allo studio delle cellule della granulosa, con l’intento di mettere a punto una metodica rapida, non invasiva e di facile attuazione che permetta la valutazione indiretta di oociti di buona qualità da utilizzare nella tecnica di riproduzione assistita. A tale proposito sono state analizzate cellule della granulosa in living e air-dried, da pazienti consenzienti sia sane che affette da endometriosi. L’analisi vibrazionale, ancora in corso, mostra comunque un maggior contenuto di lipidi e una destrutturazione delle proteine nelle cellule della Granulosa da pazienti affette da endometriosi.

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