Laura Achene Istituto Superiore di Sanità

Reparto Igiene delle acque interne

Cianobatteri nelle acque destinate al consumo umano: Analisi dei dati, gestione del rischio, principi, criteri e metodi di comunicazione del rischio

BARI, 6-7/12/2011

Le cianotossine

Neurotossine Citotossine Epatotossine

Saxitossine

Anatossine

Cilindrospermopsina

Microcistine

Nodularine

Alcaloidi Peptidi ciclici

tossine gastrointestinali e con effetti cutanei acuti quali aplisiatossina, debromoapsiatossina e lingbiatossina prodotte da cianobatteri di origine marina e le endotossine lipopolisaccaridiche (LPS), potenzialmente irritanti

Orale

Vie di esposizione Mezzo

Polmonare

Cutanea

Emodialisi

Acque ad uso ricreazionale Cibo (prodotti ittici, latte, carne, verdure, supplementi alimentari) Attività ricreazionali, lavoro, doccia Attività ricreazionali, lavoro, doccia Acqua usata per emodialisi

Acqua potabile

I due amminoacidi variabili, indicati con R1 e R2, che si trovano in posizione 2 e 4 nella struttura ciclica e le più frequenti variazioni nella struttura chimica dovute all’assenza del gruppo metile nelle posizioni 3 e/o 7, danno luogo ad un numero elevato di altri congeneri. L’insolito amminoacido Adda è alla base della tossicità di questi composti.

H

HCH3

H

CH3

H

H

NH

CH3

HO

NH

COOHH

N

O

CH3

CH2

NH

O

CH3

H

R1

O

R2

O

NHH CH3

COOHH

CH3

O

(5) Adda

(6) D-Glu (iso) (7) N-metildeidroalanina

(Mdha)

(1) D-Ala

(3) D-eritro-b-metilAsp

Le microcistine sono tra le cianotossine quelle più diffuse

Eptapetidi monociclici con peso molecolare variabile tra 500 e 4000 Da

Almeno 80 congeneri I generi che producono le

microcistine comprendono Microcystis, Anabaena, Nodularia, Nostoc e Oscillatoria

Tabella 1. Denominazione e descrizione strutturale di Microcistine selezionate

MICROCISTINA R1 R2

dem-MC- RR Arginina Arginina

MC-RR Arginina Arginina

MC-YR Tirosina Arginina

dem-MC- LR Leucina Arginina

MC-LR Leucina Arginina

MC-LA Leucina Alanina

MC-LY Leucina Tirosina

MC-LF Leucina Fenilalanina

MC-LW Leucina Triptofano

Caratteristiche chimiche

Le MCs devono le loro caratteristiche idrofobiche alla presenza del residuo Adda e all’eventuale presenza di altri amminoacidi a carattere idrofobico.

Sono tossine estremamente stabili e difficilmente subiscono idrolisi chimica e ossidazione a pH neutro; sono resistenti alla temperatura di ebollizione dell’acqua.

Il tempo di emivita nelle acque naturali varia in funzione della temperatura e dell’entità delle popolazioni microbiche presenti (biodegradazione ad opera di batteri piuttosto che da fenomeni chimico-fisici)

Una lenta degradazione di tipo fotochimico può avvenire quando vi è l’esposizione diretta alla luce solare

MC: Farmacocinetica

La distribuzione delle MCs è limitata dalla scarsa capacità di queste tossine di attraversare le membrane cellulari

In primo luogo sono accumulate nel fegato da sistemi di trasporto attivi multispecifici per gli acidi biliari

Il fegato è l’organo bersaglio sia per l’accumulo che per l’escrezione delle MCs

A seguito di somministrazione ip e iv, 50-70% di MC-LR è nel fegato, 7-10% nell’intestino, 1-5% nei reni.

L’escrezione dal fegato avviene attraverso la bile ricircolo enteroepatico

Il fegato ha un ruolo importante nella detossificazione delle MCs

MC: Meccanismo di azione Le MC agiscono a livello epatico come inibitori delle fosfatasi proteiche 1 e 2° (PP1 e PP2A)

Ad alte dosi (tox acuta) eventi a cascata

(cambiamenti nel citoscheletro, stress ossidativo, apoptosi, aumento della trascrizione di alcuni geni) tossicità epatica centro lobulare, zone altamente emorragiche per danneggiamento dei sinusoidi epatici

A basse dosi (tox ripetuta) induzione di proliferazione cellulare ed ipertrofia epatica

Tossicità acuta delle MC Le MC sono potenti epatotossine

La MC-LR è considerata il congenere con la più elevata tossicità acuta

MC-LR: DL50 ip – topo: 50-150 µg/Kg pc

MC-RR: DL50 ip – topo: 600 µg/Kg pc

MC-LR: DL50 orale – topo: 5000 µg/Kg pc

La morte si verifica entro breve tempo dalla somministrazione (1-2 ore)

Tossicità

La differenza di tossicità acuta di 30-100 volte nelle due diverse vie di somministrazione (ip/orale) è dovuta a differenze tossicocinetiche I sistemi di trasporto attivo per l’assorbimento intestinale vengono by-passati dal trattamento i.p. La MC-LR diventa direttamente disponibile per il trasporto all’interno della cellula epatica

La somministrazione i.p. poco rappresentativa delle reali condizioni di esposizione umana per via orale (cibi e/o acqua potabile)

MC: Tossicità ripetuta 13 settimane- topo-gavaggio: NOAEL 40 µg MC-

LR/Kg/pc/giorno su danni epatici ed alterazioni dei parametri enzimatici

45 giorni-topo-via orale (dieta): NOAEL di 333 µg MC-LR/Kg/pc/giorno

Gavaggio: alte concentrazioni circolanti immediate

Dieta: la somministrazione è graduale nel tempo; possono intervenire sistemi di detossificazione

Le differenze possono essere attribuite alla tossicocinetica delle due vie di somministrazione

Altri effetti tossici

Estratti di MC-LR testati con 3 saggi di mutagenesi a breve termine (Ara test, Ames test, SOS/umu test) non hanno evidenziato effetti genotossici

Sono state dimostrate proprietà di promotore tumorale correlate all’azione di fosforilazione delle proteine

Lo IARC ha classificato la MC-LR come possibile cancerogeno per l’uomo (gruppo 2B)

Tossicità delle MC Tabella 2. Fattori di conversione definiti per 21 congeneri di MCs basati sulla IC50

definita mediante saggi di inibizione della PP2a (prove in triplicato). Fonte Ikehara et. al.*

* Ikehara et al. (2009) The effect of structural variation in 21 microcystins on their inhibition of PP2A and the effect of replacing cys269 with glycine. Toxicon 54:539.

Considerazioni generali: potenziale rischio per l’uomo

L’uomo può essere esposto soprattutto per via orale attraverso l’acqua potabile, alimenti (pesce soprattutto) e vegetali od il consumo di integratori a base di alghe, in misura minore per via cutanea e via respiratoria

Non sono stati condotti studi in vivo sulla farmacocinetica delle MCs I dati di tossicità acuta suggeriscono uno scarso assorbimento delle

MCs a seguito di esposizione per via orale L’accumulo preferenziale delle MCs avviene negli epatociti grazie al

sistema di trasporto degli acidi biliari I dati sull’esposizione umana hanno mostrato effetti gastrointestinali

acuti (nausea, diarrea e vomito, morte per insufficienza respiratoria - sindrome di Haff) e cutanei

L’esposizione umana accidentale attraverso l’acqua di dialisi ha dimostrato danni epatici gravi e in alcuni casi morte

L’esposizione attraverso la via respiratoria ha identificato come organo target la parte superiore dell’apparato respiratorio

Nodularina

Pentapeptide monociclico con struttura simile alla microcistine

Sono conosciute poche varianti (sette) Chemical structure of nodularin (from Duy et al.

Prodotta da Nodularia spumigena

Tossicità acuta

Il meccanismo di tossicità è molto simile a quello delle MC

Sono potenti epatotossine

Agiscono a livello epatico come inibitori delle fosfatasi proteiche 1 e 2A (PP1 e PP2A)

Determinano un quadro di tossicità epatica centrolobulare, con distruzione delle cellule parenchimali e dei sinusoidi del fegato con morte o gravi danni al fegato

DL50 ip –topo: 30-50 µg/kg pc (la morte sopraggiunge in 2-3h)

Altri effetti tossici a dosi ripetute

Somministrazione ip a ratti maschi di due dosi per 2 settimane di 25 µg nodularina/kg pc notevole decremento del livello nel siero di testosterone accompagnato da un innalzamento del colesterolo LDL

Non è stata dimostrata attività mutagena Non è stato calcolato un NOAEL Può promuovere la crescita di tumori epatici od altri

tumori a seguito di esposizione ripetuta a basse dosi (ratti femmine)

Cilindrospermopsina Appartiene alla classe degli alcaloidi guanidici La molecola è costituita da un gruppo guanidico

triciclico combinato con idrossimetil-uracile

Otto specie di cianobatteri produttori di cilindrospermopsina: Cylindrospermopsis raciborskii, Aphanizomenon ovalisporum, Aphanizomenon flos-aquae, Umezakia natans, Rhaphdiopsis curvata and Anabaena bergii, Anabaena lapponica, and Lygnbya wollei .Tra questi Cylindrospermopsis raciborskii è la specie che rappresenta il problema maggiore su scala mondiale

Farmacocinetica Ha elevata idrofilicità

Necessita di trasporto attivo – trasportatori degli acidi biliari per gli epatociti

Per le ridotte dimensioni può attraversare parzialmente le membrane biologiche per diffusione passiva

L’accumulo nei tessuti avviene principalmente nel fegato e in misura ridotta nei reni

Nel topo viene escreta per via renale (> 50% in 6h)

Viene bioattivata dal P450 e probabilmente coniugata col glutatione

Meccanismo di azione Attivazione del citocromo P-450

Agisce direttamente inibendo la sintesi proteica con meccanismo non reversibile

I metaboliti formati dal P450 agiscono con meccanismo non noto

Il fegato è l’organo target, il meccanismo di tossicità non è chiaro, probabilmente dovuto alla inibizione delle proteine grave necrosi epatica

Nei reni si manifestano necrosi ed aumento della sezione dei tubuli prossimali ed alterazione dei glomeruli.

Come interferente endocrino è stato ipotizzato alterazione del rapporto progesterone/estrogeni nelle donne a seguito di assunzione della cilindrospermopsina

Studi su animali da laboratorio sono a favore di un possibile effetto genotossico e cancerogeno.

Tossicità acuta

Ha effetti epatotossici e nefrotossici. Altri organi bersaglio sono timo e polmone.

La tossicità acuta è ritardata e progressiva: la morte si verifica a 24-120 h (1-2 h per le MC)

LD50 – topo - ip : 2,1 mg/kg a 24h

0,2 mg/kg a 5-6gg(120-144h)

LD50 - topo – orale: 4,4-6,9 mg/kg a 2-6 gg

Tossicità ripetuta

11 settimane-topo-gavaggio dosi di 0, 30, 60, 120 or 240 μg/kg-giorno NOAEL e LOAEL of 30 e 60 μg/kg-giorno (incremento del peso del rene)

Non sono disponibili dati sugli effetti immunotossici, sebbene il sistema immunitario sembra un bersaglio delle esposizioni a breve termine e ad alte dosi

Dati preliminari in vivo sono a favore di un potenziale cancerogeno (tumori epatici)

CYN purificata può causare inibizione crescita cellulare, alterazione della morfologia cellulare

Anatossine

L’anatossina ATX-a è un alcaloide amminico biciclico con peso molecolare di 165 Da, un’ammina secondaria 2-acetyl-9-azabicyclo(4-2-1)non-2-ene) ed è un analogo strutturale della cocaina. L’omoanatossina-a è un analogo dell’anatossina-a da cui differisce per la presenza di un gruppo propionilico in posizione C-2 invece del gruppo acetilico presente nell’anatossina-a. La anatossina-a(s) ha una struttura chimica diversa essendo un estere fosforico della N-idrossi guanidina.

L’ATX-a è prodotta da alcuni ceppi di Anabaena (in particolare Anabaena flos-aquae ed almeno da altri 4 generi di cianobatteri Aphanizomenon, Microcystis, Oscillatoria (Planktothrix), Cylindrospermun. L’omoanatossina-a è prodotta da Planktothrix formosa e O. formosum (Phormidium formosum). L’ATX-a(S) è prodotta da Anabaena sp.: A. flos-aquae e A. lemmermannii

Struttura chimica della anatossina-a, dell’omoanatossina-a e dell’anatossina-a(S)

Meccanismo di azione L’anatossina-a è un agonista colinergico che si lega ai

recettori dell’acetilcolina nel sistema nervoso centrale e periferico e nelle giunzioni neuromuscolari causando stimolazione continua con blocco della trasmissione elettrica. La morte sopraggiunge per paralisi muscolare ed asfissia. Gli effetti acuti sembrano rappresentare il rischio principale per la salute umana.

L’omoanatossina-a è un potente agente bloccante neuromuscolare.

L’anatossina-a(s) inibisce l’attività dell’acetilcolinesterasi ma solo nel sistema nervoso periferico.

Tossicocinetica Studi di tossicità orale acuta indicano che ATX-a è

rapidamente assorbita dal tratto gastrointestinale con successivi segni di neurotossicità (perdita di coordinazione, spasmi muscolari e morte per paralisi respiratoria)

L’ATX-a causa la morte nel tempo di pochi minuti ad alcune ore (a seconda della specie e dalla dose di tossina ingerita

Non si hanno dati sulla distribuzione, metabolismo ed escrezione

Tossicità acuta

LD50 orale: varia da 1 a 10 mg/Kg pc a seconda della specie

LD50- topo-ip: 250 µg/kg pc (dose più bassa che causa la morte)

375 µg/kg pc

<100 µg/kg pc

200-250 µg/kg pc

LD50-topo-i.v.: <100 µg/kg pc

LD50- topo-ip: 250 µg/kg pc

I sintomi dell’avvelenamento sono molto gravi (morte per arresto respiratorio in 7-12 mini)

Le endotossine LPS

Componenti delle membrane cellulari dei cianobatteri e dei batteri gram-negativi. Le differenze nella subunità esterna (Antigene O) nei batteri causano la specificità serologica; anche il lipide A è variabile. Le LPS dei cianobatteri differiscono leggermente da quelle batteriche e contengono fosfati nelle catene esterne

Le endotossine LPS Associazione tossine LPS con effetti topici (irritazione di pelle, occhi,

mucose, e gastroenteriti) o reazioni allergiche/ infiammatorie mai dimostrata sperimentalmente, solo ipotizzata in analogia agli effetti dovuti alle LPS dei batteri Gram-negativi

Il lipide A è responsabile della tossicità e la sua variabilità determina il livello di tossicità (da nullo ad alto)

La struttura del Lipide A dei cianobatteri non nota perciò non è possibile trarre conclusioni sul grado di tossicità. Possibile presenza e/o sinergia di fattori eziologici diversi e concorrenti. Risultati test sensibilizzazione cutanea indicano che estratti inducono gradi indipendentemente dalla produzione altre cianotossine Torokne et al., 2001)

Risultati di test di sensibilizzazione cutanea indicano che estratti di cianobatteri inducono diversi gradi di sensibilizzazione indipendentemente dalla produzione di altre cianotossine (Torokne et al., 2001)

Durante bloom di cianobatteri si formano molti altri composti organici (aldeidi, chetoni e terpenoidi) che si dissolvono in acqua, hanno una certa volatilità e spesso sono dotati di attività irritante e sensibilizzante.

Indicate come responsabili di dermatiti da contatto

(swimmer’s itch), gastriti, ulcerazioni della mucosa buccale e della lingua, irritazione e danni gravi alla mucosa g.i., diarrea, mal di testa e febbre)

Le cianotossine nell’acqua potabile

Le cianotossine possono contaminare l’acqua potabile quando siano utilizzate come fonti di approvvigionamento acque contenenti cianobatteri. I livelli dipendono strettamente dall’entità della loro presenza nelle acque grezze e dall’efficienza dei metodi utilizzati per il trattamento e dalla loro efficacia

MC-LR e acqua potabile Si stima che l’80% della ingestione totale di MC-LR

avvenga attraverso il consumo di acqua potabile: AF=0,8

Consumo giornaliero: si assume che sia 2L al giorno per un adulto di 60Kg di peso

Il per l’acqua potabile

* TDI- tolerable daily intake