Tripanosomosi Africana

Philum Sarcomastigophora

Classe Zoomastigophore

Ordine Kinetoplastida

Famiglia Trypanosomatidae

Genere Trypanosoma Sezione SALIVARIA

Epidemiologia

50 milioni di persone a rischio <20% sotto sorveglianza 20,000 nuovi casi/anno epidemie periodiche e devastanti 200 foci endemici

Tripanosomosi Africana Distribuzione

§  Trypanosoma brucei gambiense

§ Trypanosoma brucei rhodesiense

§ Trypanosoma brucei brucei

(agente eziologico del “nagana”-malattia dei ruminanti)

Tripanosomi africani :

T.b.gambiense Diffuso nelle zone umide fluviali dell’Africa centro- occidentale VETTORE: Glossina palpalis che vive in ambienti umidi SERBATOI: - uomo

- maiale T.b.rhodesiense Diffuso nelle savane delle regioni africane sudorientali VETTORE: Glossina morsitans che vive in zone secche SERBATOI: - diverse specie animali (insetti zoofili) - solo occasionalmente l’uomo

EPIDEMIOLOGIA

Trypanosoma brucei gambiense E’ diffuso nell’Africa centro occidentale e si distingue in due sottopopolazioni: gruppoI -limitata variabilità genetica -bassa virulenza negli animali di laboratorio gruppoII - maggiore variabilità genetica -media virulenza negli animali di laboratorio

Trypanosoma brucei rhodesiense E’ diffuso nell’Africa orientale, è capace di infettare l’uomo ed è più virulento Gene SRA: - conferisce resistenza - elemento di distinzione certa traT.b.rhodhesiense e T.b.brucei

Trypanosoma brucei gambiense e

Trypanosoma brucei rhodesiense

Glossina

uomo

Agenti eziologici della malattia del sonno

trasmessa all’uomo da ditteri ematofagi

del genere Glossina (mosca tse tse)

Glossina infetta

Uomo

Tripomastigoti snelli

Tripomastigoti metaciclico

Tripomastigoti tozzi

Assunti dalla glossina

CICLO VITALE NELL’UOMO

è depositato nel derma (infiammazione)

•  linfonodi e sangue • Tali forme sono dipendenti dal “glucosio” come fonte di energia che viene metabolizzato nei glicosomi.

- linfa -sangue -liquor cefalorachidiano

Glossina

Tripomastigoti tozzi

Tripomastigoti mesociclici

Tripomastigoti prociclici snelli

Epimastigoti

Tripomastigoti metaciclici

CICLO VITALE NEL VETTORE intestino medio - cambia il proprio metabolismo in funzione della principale fonte energetica dell’insetto costituita prevalentemente dalla prolina - viene sostituita la VSG con un’altra glicoproteina che è la prociclina = perdita dell’infettività verso il mammifero

ghiandole salivari

sostituiscono la superficie di prociclina con VSG

Uomo infetto

Forme di tripanosomi

Morfotipi nell’uomo: Tripomastigote Sottile Tripomastigote

intermedio Tripomastigote tozzo

Morfotipi nel vettore: Tripomastigote Epimastigote Tripomastigote metaciclico

1) forma snella - membrana cellulare ondulante - flagello libero

- nucleo ovale - incessante attività riproduttiva - trasformazione della propria struttura antigenica di superficie determinata dalla glicoproteina VSG (Variant Surface Glicoprotein)

permette l’evasione dalle difese immunitarie dell’ospite

Nell’uomo:Tripomastigoti ematici sono caratterizzati da due forme

2) forma tozza - nucleo rotondeggiante - priva di flagello libero ( poco mobile)

l’unica forma infettante per il vettore

Nell’insetto:

§  Tripomastigoti tozzi intestino medio

§  Tripomastigoti prociclici snelli intestino anteriore

ghiandole salivari

§  Epimastigoti §  Tripomastigoti metaciclici Sole forme infettanti per l’ospite mammifero

I vettori Glossine spp

22 specie habitat ombreggiati (20-30oC)

Si nutrono di giorno Il parassita si sviluppa in 10-14 giorni

Vettori Tripanosomosi Africana • Glossina morsitans • T. brucei rhodesiense

• Glossina palpalis • T. brucei gambiense

African Sleeping Sickness

•  Virulence •  Reservoir •  Zoonotic •  Vector •  Distribution

Less More Human/animal Human/animal Less More G.palpalis G.morsitans Western Africa Eastern Africa

T.b.gambiense T.b.rhodesiense

MALATTIA DEL SONNO

La malattia del sonno o tripanosomosi africana si estende dal Sud del Sahara al Nord del Kalahari e si manifesta in due forme:

§  CRONICA dovuta a T.b.gambiense

(manifestazione lenta della malattia) §  ACUTA dovuta a T.b.rhodesiense

(manifestazione rapida e grave della malattia)

I tripanosomi metaciclici inoculati dalla Glossina §  si moltiplicano localmente negli spazi intracellulari

“chancre” cutaneo

- edema

- danno tissutale locale

§  penetrano attraverso la via linfatica nel sangue

§  invadono il sistema nervoso centrale

lesioni a carico delle meningi

PATOGENESI

Tripanosomosi Africana fasi di invasione:

•  Formazione di un nodulo nel punto di inoculo (chancre)

•  Invasione di linfoghiandole, fegato e milza

Tripanosomosi Africana sintomi in fase emolinfatica

•  Febbre intermittente •  Spleno- ed Epatomegalia •  Ingrossamento linfonodi

Tripanosomosi Africana sintomi I fase invasiva del SNC

(da 3 mesi a diversi anni dopo l’inoculo)

•  Regressione dei sintomi precedenti •  Persistenza di febbri intermittenti •  Insonnia, difficoltà di concentrazione •  Irritabilità

Tripanosomosi Africana sintomi II fase invasiva del SNC

(da 3 mesi a diversi anni dopo l’inoculo del parassita)

•  Infiltrati linfocitari nelle meningi •  Infiltrati linfocitari nell’encefalo •  Fenomeni di demielinizzazione

in encefalo e nervi periferici •  Turbe neuropsichiche •  Sonnolenza •  Coma profondo

La tripanosomosi africana va sospettata in soggetti residenti o provenienti da aree endemiche •  per T.b.rhodesiense la maggior parte dei casi si

manifesta allo stato precoce della malattia •  per T.b.gambiense la malattia si manifesta dopo mesi o anni, quando è caratterizzata da meningoencefalite

DIAGNOSI

Le forme tripomastigote vanno ricercate direttamente nel sangue, liquor, aspirati linfonodali •  tecniche parassitologiche dirette •  tecniche sierologiche: DAT, ELISA

Diagnosis •  Direct microscopy

– Blood (T.b. rhodesiense.) – Lymph node aspirate (T.b.gambiense) – Lumbar puncture (Late T.brucei.rhod. &

T.b.gamb.) •  Serology •  Animal inoculation

Tripanosomosi Africana diagnosi di laboratorio

•  Reperimento di tripomastigoti nel sangue, nel liquor ed in aspirati da linfonodi

Il trattamento chemioterapico specifico per la

tripanosomosi africana differisce a seconda

dello stadio della malattia

§ PENTAMIDINA

§ SURAMINA: indicato nello stadio ematolinfatico

§ MELARSOPROLO: indicato nello stadio meningoencefalico

§ Alfa – difluorometilornitina (DFMO):

utile su T.b.gambiense in fase terminale

TERAPIA

Lotta: §  incendi o estirpazioni della vegetazione dove

le mosche tse-tse si moltiplicano

§  disinfestazioni con insetticidi §  distruzione di mandrie di animali

selvatici (T.b.rhodesiense)

LOTTA E PREVENZIONE

Prevenzione: §  esami periodici della popolazione a rischio basati su

esame clinico, sierologico e parassitologico

§  controllo dei maiali (possibili serbatoi della malattia)

Mutual self-defence: the trypanolytic factor story Pays E, Vanhollebeke B.

Microbes Infect. 2008 10:985-9

Around 1900 Laveran and Mesnil discovered that African trypanosomes (prototype: Trypanosoma brucei brucei) do not survive in the blood of some primates and humans. The nature of the trypanolytic factor present in these sera has been the focus of a long-standing debate between different groups, but recent developments have allowed the proposal of a coherent model incorporating most seemingly divergent views and providing an interesting example of the complex interplay that continuously occurs between hosts and parasites. Possibly as an adaptation to their natural environment, great African apes (Hominoidea) and humans have acquired a new member of the apolipoprotein-L family, termed apoL1. This protein is the only one of the family to be secreted in the blood, where it binds to a subset of HDL particles that also contain another human-specific protein, haptoglobin-related protein or Hpr. T. b. brucei possesses a specific surface receptor for the haptoglobin-hemoglobin (Hp-Hb) complex, as a way to capture heme into hemoproteins that contribute to cell growth and resistance to the oxidative stress of the host. As this receptor does not discriminate between Hp and Hpr, Hpr-containing HDL particles of human serum are efficiently taken up by the parasite, leading to the simultaneous internalization of apoL1, Hpr and Hb-derived heme. Once in the lysosome, apoL1 is targeted to the lysosomal membrane, where its colicin-like anionic pore-forming activity triggers an influx of chloride ions from the cytoplasm. Osmotic effect linked to this ionic flux leads to uncontrolled swelling of the lysosome, ultimately causing the death of the parasite.

Two T. brucei clones, termed Trypanosoma brucei rhodesiense and Trypanosoma brucei gambiense, have managed to resist this lysis mechanism and, therefore, cause sleeping sickness in humans. While the mechanism of this resistance is still not known in the case of T. b. gambiense, the dominant factor responsible for resistance of T. b. rhodesiense has been identified. This protein, named SRA for Serum Resistance-Associated, is a truncated version of the major and variable surface antigen of the parasite, the Variant Surface Glycoprotein or VSG. Presumably due to its defective nature, SRA is not targeted to the plasma membrane as do regular VSGs, but ends up in the late endosomal compartment. In this location SRA is thought to neutralize apoL1 through coiled-coil interactions between alpha-helices.

Mutual self-defence: the trypanolytic factor story Pays E, Vanhollebeke B.

Microbes Infect. 2008 10:985-9

Meccanismi specifici di evasione del T. brucei

• Variazione antigenica: le VSG

• Attivazione policlonale ed aspecifica di

linfociti B

• Immunosoppressione dell’ospite

• Produzione di gp63-like protein

Variazione antigenica: le VSG

Struttura:

• Glicoproteine dimeriche di superficie

• C-terminale ancorata alla membrana, N-terminale caratterizzata da regioni variabili e costanti

Variant Surface Glycoprotein 60kd (450aa) glycoprotein (CHO 7-17%) C-terminal anchored in membrane Often as a dimer (alpha helix) Only epitopes in end third of N-terminal exposed Densely clustered 107molecules/parasite

Chapter 40, Figure 2

Schematic representation of the major surface glycoconjugates of procyclic and metacyclic Trypanosoma brucei

Essentials of Glycobiology Second Edition

Variazione antigenica: le VSG La variazione antigenica porta alla mancata eliminazione di

subpopolazioni di parassiti.

Il sistema immunitario, infatti, non è in grado di esprimere in tempo anticorpi specifici contro gli antigeni temporaneamente espressi.

Parasitemia in African Sleeping Sickness

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 10 20 30

Days after Infection

Log

10 T

rypa

noso

mes

per

ml

Espressione VSG

•  Fase infettante (tripomastigote metaciclico) espressione di 10-15 diverse VSG

•  7 giorni dall’infezione: inizio switch periodico delle VSG

•  Fase tardiva: possibile ri-espressione VSG iniziali

Production of VSG Gene rearrangement Produces an expression linked copy (ELC) ELC transposed to telomeric end of chromosome -

replacing existing gene Switch occurs every 106 divisions 100-1000 copies of different VSG’s in clone

Genetic mechanisms of antigenic variation. The Trypanosoma brucei genome contains more than 1,000 variant surface glycoprotein (VSG) genes (shown as coloured boxes). Only one of these VSG variants is expressed at any one time. Gene expression occurs in a telomeric expression site (ES), where the VSG gene is co-transcribed with expression-site-associated genes (ESAGs; shown as numbered boxes).The T. brucei genome contains a set of 15–20 similar (but not identical) ESs, 3 examples of which are depicted. In T. b. rhodesiense, one particular ES, known as R-ES, contains the serum-resistance associated (SRA) gene, which confers resistance to lysis by human serum40. Antigenic variation (that is, the expression of a different VSG variant) can result from two mechanisms (indicated in red): transcriptional switching and homologous recombination. Transcriptional switching occurs by a process known as in situ activation, in which expression of the active ES is turned off, and expression of a previously silent ES is turned on. This process does not involve DNA rearrangement. By contrast, homologous recombination involves replacement of the active VSG gene. This can occur by one of two mechanisms: gene conversion, which involves replacement with a copy of a VSG gene from the repertoire; or reciprocal exchange, which involves replacement with a VSG gene from another ES (and thereby exchange of a VSG gene between two ESs). These replacements occur through recombination between homologous regions, such as 70

base-pair repeats.

Gain and loss of resistance to human serum. Tsetse flies inject the mammalian host with T. b. rhodesiense in the metacyclic form, and these trypanosomes then transform into long, slender bloodstream forms, in which different VSG ESs can be activated. Only trypanosomes in which the R-ES is active can resist lysis by human serum. Under these conditions, in situ activation (transcriptional switching) of other VSG ESs is counter-selected (indicated by a small red cross), owing to the requirement for SRA expression to resist lysis. Therefore, antigenic variation only occurs through homologous recombination targeted to the active VSG gene. In non-human hosts, expression of the R-ES seems to be counter-selected, although in situ inactivation of the R-ES does require many passages in mice6, 39. This counter-selection might result from the absence of most ESAGs from the R-ES, because these ESAGs might not be completely dispensable.

Il meccanismo di variazione antigenica

realizzato con le VSG rende particolarmente

complesso lo sviluppo di un vaccino contro

il T. brucei

Meccanismi specifici di evasione del T. brucei

• Variazione antigenica: le VSG

• Attivazione policlonale ed aspecifica di

linfociti B

• Immunosoppressione dell’ospite

• Produzione di gp63-like protein

Attivazione policlonale di linfociti B

Le molecole rilasciate dai tripanosomi o le stesse VSG agiscono da mitogeni

Espansione clonale non specifica dei linfociti B

Produzione massiva di IgM non specifiche

IgM eterospecifiche e autoanticorpi contro proteine e acidi nucleici

dell’ospite

Formazione complessi Ag-Ab con iperplasia di milza e linfonodi

Meccanismi specifici di evasione del T. brucei

• Variazione antigenica: le VSG

• Attivazione policlonale ed aspecifica di

linfociti B

• Immunosoppressione dell’ospite

• Produzione di gp63-like protein

Immunosoppressione dell’ospite

1.  Alterazione delle funzioni cellulari B e T: –  produzione di IgM non seguita da produzione di IgG

–  soppressione della proliferazione dei linfociti T

2.  Alterazione nell’attivazione dei macrofagi:

–  iperattivazione dei macrofagi da parte di porzioni delle proteine VSG

3. Variazione del pattern di citochine rilasciate da linfociti

Soppressione proliferazione linfociti T

Prodotti di secrezione dei Tripanosomi (es.proteina T Lymphocyte Triggering Factor)

Induzione dei CD8+a produrre alti livelli di IFN-γ

Diminuzione dell’espressione dei IL-2R e della sintesi dell’IL-2

Induzione della produzione di una MAP chinasi che contribuisce

alla proliferazione dei tripanosomi

Attraverso esperimenti di laboratorio, effettuati su ratti e topi, è stato evidenziato che:

• i Tripanosomi stimolano la produzione di IFN-γ nei linfociti CD8+ ma non nei CD4+

• la proteina TLTF (T-lymphocytes triggering factor) si lega direttamente alla molecola CD8 esposta sulla superficie dei linfociti

• la produzione di IFN-γ induce la produzione di una MAP-chinasi responsabile della proliferazione dei Tripanosomi

Meccanismi specifici di evasione del T. brucei

• Variazione antigenica: le VSG

• Attivazione policlonale ed aspecifica di

linfociti B

• Immunosoppressione dell’ospite

• Produzione di gp63-like protein

Produzione di gp63-like protein

Anche i Tripanosomi hanno geni codificanti proteine simili alle gp-63 presenti nella Leishmania. Sebbene la loro funzione non sia stata ancora ben definita, si suppone abbiano

un ruolo specifico nell’evasione della lisi mediata dal complemento

Riassumendo… I tripanosomi utilizzano vari meccanismi per evadere dalla risposta immune, e le strategie dipendono dalle momentanee necessità del parassita (stadio, localizzazione nell’ospite e stato del sistema immunitario).

I più comuni sistemi di evasione sono volti a prevenire il confronto tra parassita e sistema immunitario.

Si realizzano attraverso:

• Secrezione di molecole che modulano il sistema immunitario

• Controllo del set di citochine prodotte

• Anergia delle cellule immunitarie

Nuove evidenze

sulla biologia cellulare di T.brucei

The genome of the African trypanosome Trypanosoma brucei. Berriman M, Ghedin E, Hertz-Fowler C, Blandin G, Renauld H, Bartholomeu DC, Lennard NJ, Caler E, Hamlin NE, Haas B, Böhme U, Hannick L, Aslett MA, Shallom J, Marcello L, Hou L, Wickstead B, Alsmark UC, Arrowsmith C, Atkin RJ, Barron AJ, Bringaud F, Brooks K, Carrington M, Cherevach I, Chillingworth TJ, Churcher C, Clark LN, Corton CH, Cronin A, Davies RM, Doggett J, Djikeng A, Feldblyum T, Field MC, Fraser A, Goodhead I, Hance Z, Harper D, Harris BR, Hauser H, Hostetler J, Ivens A, Jagels K, Johnson D, Johnson J, Jones K, Kerhornou AX, Koo H, Larke N, Landfear S, Larkin C, Leech V, Line A, Lord A, Macleod A, Mooney PJ, Moule S, Martin DM, Morgan GW, Mungall K, Norbertczak H, Ormond D, Pai G, Peacock CS, Peterson J, Quail MA, Rabbinowitsch E, Rajandream MA, Reitter C, Salzberg SL, Sanders M, Schobel S, Sharp S, Simmonds M, Simpson AJ, Tallon L, Turner CM, Tait A, Tivey AR, Van Aken S, Walker D, Wanless D, Wang S, White B, White O, Whitehead S, Woodward J, Wortman J, Adams MD, Embley TM, Gull K, Ullu E, Barry JD, Fairlamb AH, Opperdoes F, Barrell BG, Donelson JE, Hall N, Fraser CM, Melville SE, El-Sayed NM. Science. 2005 Jul 15;309(5733)

La funzione flagellare è essenziale per la forma sanguigna del Trypanosoma.

L’induzione di un danno flagellare potrebbe essere il punto di partenza per curare la malattia del sonno

Sia la forma sanguigna che quella prociclica (nel vettore) del Trypanosoma Brucei presentano un flagello che emerge da un pocket flagellare posteriore. Tale flagello comprende: 1- assonema circondato da membrana 2- PFR - ”paraflagellar rod”

Come si può impiegare la proteomica del flagello per la lotta al Tripanosoma?

-Isolamento di assonema, PFR associato e corpo basale del flagello della forma prociclica -Separazione delle proteine mediante elettroforesi.

- Digestione delle bande ottenute con tripsina

- Analisi dei peptidi risultanti con LC – MS

-Identificazione di 331 proteine costituenti il Proteoma Flagellare di T. brucei (TbFP)

Le proteine del TbFP presentano omologhi nel genoma di T.Cruzi e L.Major.

La comparazione tra le proteine del TbFP e del proteoma flagellare di Chlamydomonas e Tetrahymena thermophila ha confermato invece la presenza di un ampio numero di proteine nel TbFP non codificato negli altri 2 organismi.

Molto probabilmente queste proteine risiedono nel PFR che rappresenta una struttura flagellare specifica del Tripanosoma.

L’identificazione di omologhi del TbFP nell’uomo

responsabili delle malattie ereditarie legate alla

motilità ciliare ha fornito lo spunto per bloccare la

funzionalità flagellare nel T.brucei

Identificazione, oltre alle 3 dineine assonemali, di omologhi di altre 7 proteine direttamente implicate in

patologie umane. Tra le proteine ci sono: Hydin,

PACRG e Scorpion.

Analisi funzionale con la tecnica dell’RNAi della proteina Hydin nella forma prociclica del Trypanosoma

GRAVE DIFETTO DI MOTILITA’

Analisi di altre 10 proteine del TbFP con l’approccio dell’RNAi, 8 delle quali mostrano in seguito

ad ablazione, un fenotipo flagellare.

2 geni (Tb PACRGA e Tb PACRGB) non hanno effetti se

ablati singolarmente ma la repressione simultanea determina

la paralisi del flagello.

Tutti gli esperimenti di RNAi a cui sono state sottoposte le

forme procicliche dei Tripanosomi mostrano che la

motilità può essere seriamente compromessa mentre la

proliferazione cellulare rimane inalterata.

Uso della stessa tecnica di RNAi inducibile contro 5 proteine del TbFP

della forma sanguigna.

Tutte le 5 analisi risultano in un Trypanosoma che non completa la

citochinesi, formando cellule mostruose incapaci di proliferare.

Trypanosoma

RNAi induced

Le cellule cessano di dividersi ma continuano a progredire attraverso il ciclo cellulare.

Le cellule iniziano nuovi cicli di

fase S e mitosi,portando a grandi cellule contorte

contenenti più Kinetoplasti e più nuclei

MOSTRI

Cellule 4K4N e cellule 8K8N

1 Kinetoplasto 1 Nucleo

1K1N

Sono replicati 1 volta durante il ciclo cellulare

Cellule non indotte hanno morfologia

normale, producendo un nuovo flagello durante il

ciclo cellulare prima della citochinesi, con il flagello che

emerge dal pacchetto flegellare e che si estende

lungo il Trypanosoma

In seguito ad induzione con RNAi e ablazione di PFR2 eTAX1, le cellule producono un nuovo flagello ma non completano la divisione e perdono tutti i normali assi morfogenetici diventando contorte e multiflagellate.

La spiegazione del fenotipo letale nelle cellule circolanti è che la citochinesi

fallisce come primo evento in assenza della corretta motilità flagellare

I cicli cellulari successivi formano nuovi

flagelli in posizioni inappropriate

La mancanza di assi morfogenetici precisi compromette l’equilibrio membrana/

citoscheletro durante la morfogenesi del pocket flagellare

La compromissione della funzione flagellare cui consegue

l’incapacità del parassita di dividersi “POTREBBE” aprire una nuova prospettiva per il

controllo della malattia.