Tesis de Maestría CIENCIAS - FARMACOLOGÍA PERFIL DE …
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Tesis de Maestría CIENCIAS - FARMACOLOGÍA PERFIL DE TIPO ANSIOLÍTICO Y/O ANTIDEPRESIVO DEL COMPUESTO PIRAZOLOTRIAZINICO MH4a EN RATONES ALBINOS Nelson Hamid Hermida Gutiérrez UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE FARMACIA Bogotá, Colombia 2016
Transcript of Tesis de Maestría CIENCIAS - FARMACOLOGÍA PERFIL DE …
Tesis de Maestría
CIENCIAS - FARMACOLOGÍA
PERFIL DE TIPO ANSIOLÍTICO Y/O ANTIDEPRESIVO DEL COMPUESTO
PIRAZOLOTRIAZINICO MH4a EN RATONES ALBINOS
Nelson Hamid Hermida Gutiérrez
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE FARMACIA
Bogotá, Colombia
2016
Tesis de Maestría
CIENCIAS - FARMACOLOGÍA
PERFIL DE TIPO ANSIOLÍTICO Y/O ANTIDEPRESIVO DEL COMPUESTO
PIRALOZOLOTRIAZINICO MH4a EN RATONES ALBINOS
Nelson Hamid Hermida Gutiérrez
Trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al
título de:
Magíster en Ciencias - Farmacología
Director:
Mario Francisco Guerrero Pabón
Línea de Investigación:
Farmacología experimental del sistema nervioso
Grupo de Investigación:
Grupo de Investigación en Farmacología Molecular (FARMOL)
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE FARMACIA
Bogotá, Colombia
2016
A mi Padre y a mi Maestro,
por regalarme luz en este camino,
a mi familia,
por ser la fuerza para recorrerlo.
Agradecimientos
A la Universidad Nacional de Colombia por permitirme realizar mi formación de
maestría.
A Colciencias por la beca otorgada como Joven investigador que patrocinó el
desarrollo de esta tesis.
Al profesor Mario Francisco Guerrero Pabón por su acompañamiento,
asesoramiento y apoyo incondicional.
Al profesor Luis Enrique Cuca y a William Ramiro Patiño quienes realizaron la
síntesis del compuesto.
Al bioterio del departamento de Farmacia Facultad de Ciencias, Universidad
Nacional de Colombia.
Resumen
Objetivo: Determinar el perfil ansiolítico y/o antidepresivo del compuesto
pirazolotriazinico MH4a en modelos experimentales en ratones albinos
Métodos principales: MH4a fue evaluado en pruebas de tamizaje
neurofarmacológico: campo abierto, laberinto en cruz elevado, caja luz-oscuridad,
nado forzado, suspensión por la cola, modelo de convulsión inducida por
electrochoque y modelo de convulsión inducida por pentilentetrazol en ratones
albinos ICR en intervalos de dosis de 75, 150 y 300 mg/kg v.o.
Resultados: MH4a no afectó significativamente la actividad locomotora en la
prueba de campo abierto. MH4a mostró tendencias en las pruebas de laberinto en
cruz elevado, caja luz-oscuridad, nado forzado y suspensión por la cola, que no
alcanzaron a ser estadísticamente significativas con respecto al control. MH4a
manifestó un perfil de tipo anticonvulsivante según las pruebas de convulsión
inducida por electrochoque y pentilentetrazol.
Conclusiones: El compuesto MH4a muestra cierta tendencia de tipo ansiolítico y
antidepresivo, y ejerce efectos de tipo anticonvulsivante en modelos de tamizado
farmacológico en ratones de laboratorio.
Palabras clave: pirazolotriazina, ansiolítico, antidepresivo, anticonvulsivante,
sistema nervioso central, modelo animal.
Abstract
Objective: To determine the anxiolytic and / or antidepressant profile of the
pyrazolotriazino compound MH4a in experimental models in albino mice.
Main methods: MH4a was evaluated in neuropharmacological screening tests:
open field, elevated plus maze, light-dark box, forced swim, tail suspension, electro-
shock induced seizure model, and seizure model induced by pentilentetrazol in ICR
albino mice at intervals of Doses of 75, 150 and 300 mg / kg p.o.
Results: MH4a did not significantly affect locomotor activity in the open field test.
MH4a showed trends in elevated plus maze, light-dark box, forced swim, and tail
suspension tests, which were not statistically significant with respect to the control.
MH4a showed an anticonvulsive profile with electroshock and pentylenetetrazole
induced seizure models.
Conclusions: MH4a shows a certain tendency of anxiolytic and antidepressant
type, and exerts anticonvulsive effects in pharmacological models in laboratory
albino mice.
Keywords: pirazolo-triazine, anxiolytic, antidepressant and anticonvulsant, central
nervous system, animal model.
Contenido
Resumen V
Lista de figuras XII
Lista de abreviaturas XIV
Introducción 12
Justificación 13
1. Problema estudiado 14
2. Objetivos 15
2.1 Objetivo general 15
2.2 Objetivos específicos 15
3. Marco teórico 16
3.1 Ansiedad 16
3.2 Depresión 17
3.3 Ensayos con derivados de pirazolotriazinas 17
3.4 Modelos de evaluación de actividad de tipo ansiolítica 19
3.5 Modelos de evaluación de la actividad de tipo
antidepresiva 21
4. Metodología 22
4.1 Modelos de evaluación de la actividad farmacológica 22
4.1.1 Test del suelo agujereado (Holeboard) 22
4.1.2 Test del eje rodante (RotaRod) 22
4.1.3 Campo abierto (Open field) 23
4.1.4 Laberinto en cruz elevado (Elevated Plus Maze) 23
4.1.5 Ensayo de caja luz - oscuridad (Dark-light box) 23
4.1.6 Test de nado forzado (forced swimming test) 23
4.1.7 Ensayo de suspensión por la cola (Tail suspensión test) 24
4.1.8 Modelo de convulsión inducida por electrochoque 24
4.1.9 Modelo de Convulsión inducida con pentilentetrazol 24
5. Diseño experimental y análisis estadístico 26
5.1 De tipo locomotor: 28
5.1.1 Campo abierto 28
5.2 De tipo ansiolítico: 30
5.2.1 Laberinto en cruz elevado 30
5.2.2 Ensayo de caja luz-oscuridad 32
5.3 De tipo antidepresivo 33
5.3.1 Ensayo de desesperación conductual o test de nado
forzado 33
5.3.2 Ensayo de suspensión por la cola 34
5.4 De efectos anticonvulsivantes 35
5.4.1 Modelo de convulsión inducida por electrochoque 35
5.4.2 Modelo de Convulsión inducida con pentilentetrazol
(PTZ) 37
6. Discusión 39
7. Conclusiones 42
8. Recomendaciones 43
9. Bibliografía. 44
10. Anexo A. Síntesis del compuesto MH4a 47
Lista de figuras
Figura 1. Ensayo de campo abierto
29
Figura 2. Entrecruzamientos centrales en prueba de campo abierto
29
Figura 3. Entrecruzamientos periféricos en prueba de campo abierto
30
Figura 4. Entrecruzamientos totales en prueba de campo abierto.
30
Figura 5. Ensayo de laberinto en cruz elevado
31
Figura 6. Frecuencia de entradas promedio en los brazos abiertos del
LCE
31
Figura 7. Estancia promedio en los brazos abiertos del LCE
32
Figura 8. Ensayo de caja luz – oscuridad
32
Figura 9. Estancia en parte iluminada en la prueba de caja luz/oscuridad
33
Figura 10. Test de nado forzado
33
Figura 11. Tiempo de inmovilidad en prueba de nado forzado
34
Figura 12. Ensayo de suspensión por la cola
34
Figura 13. Tiempo de inmovilidad en prueba de suspensión por la cola
35
Figura 14. Modelo de convulsión inducida por electrochoque
36
Figura 15. Protección anticonvulsiva en modelo de convulsión inducida
por electrochoque
36
Figura 16. Modelo de convulsión inducido por Pentilentetrazol
37
Figura 17. Protección anticonvulsiva en modelo de convulsión inducida
por PTZ 38
Lista de abreviaturas
Abreviatura Término
ANOVA
GABA
Análisis de varianza
Acido gama aminobutírico
GABA/BZD Receptor GABA-benzodiacepínico
Cm Centímetros
CRF Factor liberador de corticotropinas
g Gramos
Hz Hertz
LCE Laberinto en cruz elevado
mA Miliamperios
mg Miligramos
ml Mililitros
ms Milisegundo
PNF Prueba de nado forzado
PTZ Pentilentetrazol
s segundos
SNC Sistema nervioso central
SSN Solución salina normal
TDA Trastornos de ansiedad
TSC Test de suspensión por la cola
vo Vía oral
w Vatio
12
Introducción
La ansiedad es una patología muy prevalente a nivel mundial y Colombia no es la
excepción. Según el Estudio Nacional de Salud Mental del 2003, los tipos de
trastornos psiquiátricos más prevalentes a lo largo de la vida son: el trastorno de
ansiedad con 19,3% y los trastornos del estado de ánimo con 15% en un grupo
etario entre 18 y 65 años(Ministerio de la Protección Social, 2003)en la encuesta
Nacional de Salud Mental versión 2015 se reporta que el 11.6% de los adolescentes
declaran 3 o 4 síntomas de ansiedad y de 4 a 6 síntomas de depresión en el 15.8%.
(MINSALUD, 2015)
Existen diferentes limitaciones para hacer investigación farmacológica en el campo
de la psiquiatría debido principalmente a factores éticos y económicos, pero la
necesidad de tratar estas enfermedades genera inquietud en el ámbito científico
por lo cual se plantea como alternativa la realización de estudios experimentales en
animales teniendo en cuenta la relación evolutiva cerebral con los
mamíferos.(Alfredo, 2002)
Actualmente existen diferentes modelos aplicados a la ansiedad y la depresión
como herramienta fundamental en la fase preclínica de diferentes compuestos
prometedores para tener efecto en el sistema nervioso central.
En el 2006 en la universidad de Nariño se sintetizaron compuestos análogos de
pirazolo[1,5-a][1,3,5] triazina, que posteriormente Estrada en el 2010 utilizó
realizando un perfil neurofarmacológico de cuatro compuestos, encontrando
resultados interesantes, como el efecto de tipo anticonvulsivante del compuesto
MH4b1. Dado esto, es conveniente avanzar en el estudio de los demás compuestos,
especialmente del MH4a por la tendencia a aumentar el tiempo en los brazos
abiertos del laberinto en cruz elevado y cierto efecto de tipo ansiolítico en el modelo
de ocultamiento de esferas reportado en el tamizado referido.
En este trabajo se pretende continuar la secuencia investigativa de este compuesto
realizando curva dosis respuesta en diferentes modelos y de esta manera obtener
un acercamiento a las posibles propiedades del mismo en el sistema nervioso
central, teniendo en cuenta que este trabajo está encaminado a la búsqueda de
compuestos cabeza de serie a partir de los cuales se pueden obtener otros más
potentes.
13
Justificación
En el trabajo realizado por Estrada en el 2010, se determinó el perfil
neurofarmacológico de análogos de pirazolo[1,5-a][1,3,5] triazina, evidenciándose
un posible efecto ansiolítico de un compuesto MH4a en el modelo de ocultamiento
de esferas y una tendencia a aumentar el tiempo de estancia en los brazos abiertos
del laberinto en cruz elevado a dosis de100 mg/Kg v.o. La propuesta de este trabajo
investigativo es realizar un perfil ansiolítico y antidepresivo dosis respuesta que nos
permita dilucidar con mayor precisión las propiedades del mencionado
compuesto.(Estrada Valencia, 2010)
Según lo reportado por Michael et al, La tasa de prevalencia de ansiedad en toda la
vida a nivel mundial oscila entre 13.6 a 28,8%, encontrándose tasas de comorbilidad
entre los trastornos de ansiedad (TDA) hasta de 74% y asociaciones tan
significativas como Odds Ratio de 12,3 entre TDA y desordenes de pánico, sin
mencionar diferentes resultados de causalidad compartida con el alcohol y otro tipo
de sustancias. (Michael, Zetsche, & Margraf, 2007)
En las posibilidades de manejo para los TDA se encuentran alternativas
farmacológicas y psicoterapéuticas. En el reciente meta-análisis realizado por
Bandelow et al, quienes compararon la eficacia de los tratamientos de manera
independiente confrontando con placebo, sostienen que, a pesar de tener
resultados significativamente superiores en favor de los medicamentos, se deben
siempre considerar la tasa de riesgo/beneficio por los múltiples efectos secundarios,
interacciones y contraindicaciones que éstos puedan tener. (Bandelow et al., 2015)
El desorden depresivo mayor presenta una prevalencia mundial del 15%, esto
aumenta el riesgo relativo de mortalidad en 1.8 cuando se compara con personas
que no presentan esta patología. Adicionalmente, a pesar de los avances en el
conocimiento de los mecanismos neurofisiológicos la tasa de resistencia al
tratamiento se encuentra entre el 10 y 15%, y se debe tener presente que las tasas
de remisión parcial se reportan en la literatura en un rango de 30 y 40% como lo
describe Tundo et al. (Tundo, Antonio, Rocco de Filippis, 2015)
La tendencia a que este espectro de trastornos siga en aumento y las repercusiones
de los mismos en morbilidad, ausentismo laboral y las diferentes asociaciones con
otras patologías sustentan la necesidad de investigar en compuestos que generen
posibles alternativas de tratamiento, y de esta manera contribuir a menguar el
impacto social.
14
1. Problema estudiado
Diferentes compuestos del sistema pirazolo[1,5-a][1,3,5]triazínico fueron estudiados
por Estrada 2010 (Estrada Valencia, 2010) para evidenciar posible actividad en el
sistema nervioso central (SNC), en esta primera aproximación se encontró un
potencial ansiolítico en uno de los compuestos, denominado MH4a.
De acuerdo a esos resultados, se planteó en esta investigación dar respuesta a las
siguientes preguntas:
¿Posee el compuesto objeto de estudio actividad ansiolítica y/o antidepresiva
significativa?
¿En cuáles modelos animales y a qué dosis se observan respuestas que nos
puedan corroborar la presencia de dicha actividad?
¿Posee efecto locomotor significativo?
15
2. Objetivos
2.1 General:
Determinar el perfil de tipo ansiolítico y/ o antidepresivo del compuesto
pirazolotriazinico MH4a en modelos experimentales en ratones albinos
2.2 Específicos:
Determinar la actividad de tipo ansiolítico en los modelos experimentales de
laberinto en cruz elevado y caja luz oscuridad.
Determinar la actividad de tipo antidepresivo en los modelos de suspensión por la
cola y nado forzado.
Determinar el perfil de tipo anticonvulsivante en los modelos de convulsión inducida
por electrochoque y pentilentetrazol.
Evaluar el efecto locomotor en la prueba de campo abierto.
16
3. Marco teórico
3.1 Ansiedad
La Real Academia Española define la ansiedad como un estado de agitación,
inquietud o zozobra del ánimo. Se considera una emoción común, indispensable
para la vida porque cumple una función adaptativa que prepara al individuo para
estar alerta o actuar ante posibles amenazas. La ansiedad está en nuestra vida
cotidiana, pero tiene que presentarse de una manera proporcionada ante un
estímulo. Cuando su intensidad y duración se prolongan implicando una reducción
de la libertad personal o incluso se manifiesta sin evidenciarse un peligro inminente,
entonces, se trasforma en una ansiedad patológica que afecta al individuo, tiene
características de respuesta más corporales y esta sensación genera la solicitud de
atención médica. (Reyes-Ticas, 2005)
Generalmente se realiza la consulta al médico de atención primaria por algún tipo
de dolor, cansancio o pérdida de peso, estos pacientes son más propensos a
realizar consultas frecuentes y a presentar comorbilidades psiquiátricas, lo que
genera un subregistro importante partiendo de que existe un desafío marcado en el
reconocimiento y tratamiento de este grupo de patologías. Adicionalmente existe
una fuerte evidencia en la asociación con el tabaquismo, alcoholismo y consumo de
otras sustancias convirtiéndose en factores que juegan rol inespecífico de causa y
efecto en el espectro de la enfermedad. (Allgulander, 2006) (Lai, Cleary, Sitharthan,
& Hunt, 2015)
La tasa de prevalencia general de los trastornos de ansiedad (TDA) varía en un
rango de 13.6 a 28.8% dependiendo de los criterios diagnósticos utilizados, las
características de la población estudiada y de cómo se agrupan los diferentes
subtipos de TDA. En atención primaria varía entre el 3.7 y 14.8%, pero es de resaltar
que solo el 13,3% de los pacientes con TAD presentan síntomas de ansiedad como
principal motivo de consulta. En Europa se reportan datos de prevalencia a 12
meses del 2% y es el trastorno mental más frecuente llegando al 10% en algunos
países occidentales. Aunque encontrar estudios epidemiológicos en el mundo árabe
es una difícil tarea, se tienen datos de prevalencia en diferentes países, por ejemplo,
en Jordania la prevalencia de “cualquier trastorno de ansiedad” llega al 28.2%,
16.7% en el Líbano y 16% en Arabia saudita. (Tanios et al., 2009) (Lieb, Becker, &
Altamura, 2005) (Combs & Markman, 2014) (Michael et al., 2007)
17
3.2 Depresión
La organización mundial de salud define la depresión como un trastorno mental
frecuente, que se caracteriza por la presencia de tristeza, pérdida de interés o
placer, sentimientos de culpa o falta de autoestima, trastornos del sueño o del
apetito, sensación de cansancio y falta de concentración. (“OMS Depresión,” 2014)
Es una enfermedad común pero grave, se calcula que afecta a 350 millones de
personas y en el peor escenario puede conducir al suicidio que es la causa en
promedio de 1 millón de muertes anuales.(“OMS Depresión,” 2014) Adicionalmente
es una patología muy incapacitante y aporta en gran dimensión a la carga mundial
de morbilidad, un trastorno depresivo interfiere con la vida diaria de quienes lo
padecen, su desempeño varía y aunque puede ser tratado por no especialistas en
atención primaria con medidas que han demostrado eficacia, más de la mitad de los
afectados en todo el mundo no reciben manejo. (Instituto Nacional de la Salud
Mental, 2007)
Existe cierta controversia respecto del manejo y las tasas de resistencia, pero como
lo señala Tundo et al, se debe verificar que el diagnóstico sea correcto, el tiempo
del tratamiento y la dosis utilizada sea la adecuada, el medicamento sea
seleccionado de acuerdo con el diagnóstico específico y finalmente si existen otras
comorbilidades médicas o psiquiátricas clasificando si están adecuadamente
tratadas, para definir un tratamiento como resistente. (Tundo, Antonio, Rocco de
Filippis, 2015)
3.3 Ensayos con derivados de pirazolotriazinas
Los derivados de las pirazolotriazinas presentan propiedades interesantes para el
tratamiento de patologías diversas, razón por la cual se han convertido en motivo
de estudio en las últimas décadas, tiempo en el cual se han dilucidado vías
alternativas de síntesis patentando nuevos compuestos que luego han sido
sometidos a ensayos in vitro e in vivo.
La OMS en su “programa de acción para superar la brecha en la salud mental”,
plantea como objetivo primario la necesidad de aumentar los recursos financieros y
humanos dedicados a la atención de este tipo de trastornos con el fin de aumentar
la cobertura en los países con ingresos bajos o medio-bajos en donde se presenta
una proporción importante de la carga mundial de estas patologías. Esto trae
consigo que múltiples equipos de trabajo dediquen su tiempo a investigar en
moléculas innovadoras que puedan aumentar el arsenal terapéutico para el manejo
de este tipo de enfermedades (Organización Mundial de la Salud, 2008)
18
Zhao et al en el 2007, realizaron un estudio donde compararon las propiedades de
tipo ansiolítico de dos compuestos con antagonismo diferente por los receptores del
factor liberador de corticotropina (CRF), basados en la mediación de respuesta al
estrés ya conocida del receptor CRF1 extrahipotalámico y el desconocimiento de la
función que cumple el receptor CRF2. Test conductuales y no conductuales fueron
llevados a cabo concluyendo que los efectos son diferentes, pero no contrarios entre
los compuestos estudiados. Llamativamente el compuesto agonista CRF1 dentro
de su estructura tenía un derivado pirazolotriazínico ( pyrazolo[1,5-a]-1,3,5-triazin-
4-amine,8-[4-(bromo)-2-chlorophenyl]-N,N-bis(2-methoxyethyl)-2,7-dimethyl-(9Cl))
(Zhao et al., 2007)
Para el 2009 Gilligan et al reportaron la síntesis y relación estructura actividad de
ocho compuestos pirazolo [1,5-a] -1,3,5-triazina, antagonistas CRF1, realizando
pruebas de tipo ansiolítico como la del laberinto en cruz elevado y el modelo de
retirada defensiva, evidenciando que dos de estos compuestos denominados 13 y
15 tienen efectos ansiolíticos significativos y bajo efecto locomotor. Dados los
perfiles farmacocinéticos promisorios encontrados estos compuestos actualmente
se encuentran en estudios clínicos. (Gilligan et al., 2009)
Un estudio japonés más reciente publicado en el 2011 por Tetsuji Saito et al, en
búsqueda de la identificación de nuevos antagonistas de los receptores CRF
realizaron la síntesis de series de antagonistas bicíclicos del núcleo pirazolo [1,5-a]
pirimidinas, triazolo [1,5-a] pirimidinas, imidazo [1,2-a] pirimidinas y pirazolo [1,5-a]
[1,3,5] triazinas, que posteriormente evaluaron en cuanto a su afinidad, encontrando
en cinco de estos compuestos resultados positivos en el ensayo de tipo ansiolítico,
laberinto en cruz elevado. (Saito et al., 2011)
Otros efectos de los derivados pirazolotriazínicos en el sistema nervioso central
diferentes a los ya descritos de tipo ansiolítico han sido reportados, tal y como se
evidencia en el trabajo de Insuasty et al, donde efectuaron el cribado
anticonvulsivante y el efecto neurotóxico agudo de seis moléculas derivadas de este
sistema en ratones ICR. La molécula denominada MH4b1 mostró efectos
protectores en función de la dosis frente a las pruebas de convulsión por
electrochoque (> 150 mg/kg) y convulsión de 6 Hz (300 mg/kg, v.o.), por lo cual la
postulan como un posible aporte del sistema pirazolo [1,5-a] [1,3,5] triazínico para
el tratamiento de algunos tipos de convulsiones como las refractarias y las crisis
tónico clónico generalizadas. (Insuasty, Castro, Escobar, Murillo, & Rodríguez,
2014)
Otros campos donde se estudian los derivados pirazolotriazínicos son
principalmente en búsqueda de efectos de tipo: antiinflamatorio, anticancerígeno,
19
antiviral y antimicrobiano, como lo menciona Prinka Singla et al en el reciente
artículo de revisión reportado en el 2015, donde manifiestan el potencial
farmacológico de este sistema teniendo en cuenta el amplio espectro de actividad
biológica de las triazinas motivo por el cual se ha generado tanto interés en sintetizar
moléculas a partir de éstas. (Singla, Luxami, & Paul, 2015)
3.4 Modelos de evaluación de actividad de tipo ansiolítica
Los TDA han suscitado interés investigativo dada la prevalencia mundial de esta
patología psiquiátrica, así como la existencia de comorbilidades adjuntas y otro tipo
de anomalías que se generan concomitantemente como las adicciones. En la vida
moderna las situaciones estresantes se convierten en el día a día de la población y
ciertos efectos hormonales como el aumento del cortisol y las catecolaminas pueden
desencadenar afectaciones en múltiples órganos, existiendo una asociación muy
fuerte de este mecanismo con la depresión. Dada la necesidad de encontrar nuevos
fármacos ansiolíticos se han postulado los modelos animales como alternativa,
basados en el hecho de que se tiene un 90% de similitud genética con los roedores.
(Kumar, Bhat, & Kumar, 2013)
En los últimos años se han desarrollado múltiples pruebas para identificar
compuestos con potencial actividad ansiolítica, utilizando los conocimientos
neurofisiológicos que se tienen en búsqueda de posibles agonistas o antagonistas
de receptores para determinados neurotransmisores que participan en la
homeostasis cerebral y que su desequilibrio está relacionado con la presencia de
ansiedad entre otras enfermedades. La particularidad de realizar estos ensayos en
ratones permite la posibilidad de ampliar la batería de experimentos o técnicas
experimentales que por razones éticas no se podrían realizar en humanos. (Rejón-
Orantes, Placer Perdomo, 2010)
Kumar et al, en su artículo de revisión mencionan la necesidad de establecer la
validez de los modelos con el fin de que los mismos representen en realidad el
proceso neurofisiológico que se pretende estudiar. Existen tres tipos: la primera, la
validez aparente, en la cual se relaciona la similitud en el modelo animal en cuanto
las respuestas observadas deben ser similares en los humanos; la segunda, la
validez predictiva, en la cual los modelos deben ser sensibles a los fármacos que
han demostrado tener respuesta clínica en humanos y no tener el efecto alguno con
fármacos que en clínica no hayan demostrado eficacia; y el tercer tipo de validez es
de constructo, en la cual se relaciona la lógica teórica del modelo con el
funcionamiento fisiológico en los humanos. Los tres tipos son independientes, pero
se hace pertinente que se logre evidenciar la presencia de los tres para fortalecer la
20
relación biológica entre los animales y el hombre para el estudio de compuestos
prometedores. (Kumar et al., 2013)
Existen dos grupos principales de modelos experimentales en roedores, los
primeros los de tipo condicionado, que se conocen también como modelos de
conflicto, en los cuales se les somete a los animales a un estímulo, el más utilizado
es un impulso eléctrico leve para desarrollar una respuesta determinada. Se
considera que este tipo de ensayos tienen limitaciones importantes debido a que se
basan en el aprendizaje y memoria de los animales lo cual podría mostrar
variabilidad intrínseca del estudio y los resultados encontrados no corresponderían
a la influencia del fármaco evaluado. Adicionalmente se necesita realizar
entrenamiento previo y éste debe ser riguroso para la aplicación de este tipo de
modelos, partiendo de que en éstos los roedores se exponen a circunstancias no
habituales.(Alfredo, 2002) (Kumar et al., 2013)
El otro grupo de los modelos experimentales se les denomina no condicionados, se
les da esta denominación porque en este caso los animales no reciben
entrenamiento previo ni las respuestas conductuales se basan en las esperadas por
el adiestramiento, sino que se evalúan las respuestas espontáneas del roedor
fundamentadas en un grupo de paradigmas conductuales que se han estudiado
para la ansiedad.
Este tipo de modelos tienen como ventaja importante su costo, pues para la
implementación de estos experimentos no se requieren grandes inversiones y
podrían ser asequibles a cualquier grupo de investigación, además, teniendo en
cuenta las características mencionadas, se considera que poseen un nivel de
validez mayor y aunque existe cierta variación natural en la reactividad emocional
de los animales, se elimina la interferencia por memoria o motivación que tienen los
modelos condicionados. (Alfredo, 2002) (Rejón-Orantes, Placer Perdomo, 2010)
Uno de los modelos más utilizado y validado para uso en ratones y ratas es el
laberinto en cruz elevado (LCE), el aparato utilizado tiene cuatro brazos colocados
en forma de cruz, dos de ellos abiertos y los otros dos cerrados, con una plataforma
central. Se basa en la aversión natural de los roedores para los espacios abiertos y
utiliza el conflicto que se genera entre la exploración y la aversión a los espacios
abiertos, este tipo de ensayo es sensible para los ansiolíticos y los ansiogénicos.
Las benzodiacepinas, la buspirona y los agonistas 5HT3 incrementan la exploración
en los brazos abiertos así como las transiciones entre los compartimientos. (Kumar
et al., 2013) (Rejón-Orantes, Placer Perdomo, 2010)
21
3.5 Modelos de evaluación de la actividad de tipo antidepresiva
Para el estudio de la depresión en modelos animales existen tres grupos grandes
con características particulares, los de interacción farmacológica, el de simulación
de la depresión y el de estrés, siendo este último el más utilizado por la practicidad
que ofrece. La prueba de nado forzado (PNF) y el test de suspensión por la cola
(TSC) son los dos experimentos que con más frecuencia son reportados en la
literatura como herramientas convenientes para evaluar la eficacia de compuestos
con actividad de tipo antidepresiva.(Pollak, Rey, & Monje, 2010) (Escorihuela, R.M.
y Fernández-Teruel, 1998)
Estos modelos de estrés agudo PNF y TSC miden el tiempo de inmovilidad de los
roedores en el cilindro con agua o al ser sujetados por la cola respectivamente, el
estado de inmovilidad indica desesperación conductual, entonces, al ser
suministrados los fármacos de posible efecto antidepresivo éstos deben disminuir
el tiempo de la mencionada inmovilidad, sin aumentar la actividad locomotora.
(O’Leary & Cryan, 2013)
Se han realizado estudios para evidenciar las diferencias interindividuales que se
pueden presentar en la PNF, Taghzouti et al realizaron experimentos seriados en
los cuales tuvieron en cuenta los animales que mostraron baja y alta movilidad en
la prueba de reactividad locomotora, la cual realizaron en dos oportunidades en un
corredor circular previamente a la PNF y los compararon luego de la administración
de fluoxetina, encontrando que se presentan diferencias estadísticas en los
resultados cuando se hacen análisis de subgrupos poniendo en evidencia que tal
vez existen mecanismos cerebrales distintos de respuesta al estrés inherentes a
cada animal. Cordero et al realizaron un estudio de variabilidad interindividual
asociándolo con expresión de factores neurobiológicos también en la PNF,
reportaron que una menor expresión de CRF1 y una disminución lenta de los niveles
del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), ambos en el núcleo accumbens
son identificados como factores relacionados con un mayor riesgo de presentar
conducta relacionada con la depresión, posicionando estos factores epigenéticos
como una diana importante en búsqueda de alternativas terapéuticas y un factor
fundamental a tener en cuenta en el momento de realizar modelos experimentales
en búsqueda de compuestos, en los que se espera encontrar respuestas de tipo
antidepresivo así como para otro tipo de estudios neurofarmacológicos. (Cordero,
Trías, Rica, & Rica, 2014) (Taghzouti, Lamarque, Kharouby, & Simon, 1999)
Los modelos experimentales para pruebas de tipo ansiolítica, antidepresiva y
anticonvulsivante que se utilizarán tendrán un apartado en la metodología donde se
describe puntualmente sus aspectos técnicos.
22
4. Metodología
4.1 Modelos de evaluación de la actividad farmacológica
4.1.1 Test del suelo agujereado (Holeboard)
Bossier y Simon en 1964 utilizaron por primera vez este test con la idea de evaluar
el comportamiento animal direccionándolo con criterios que pudieran reflejar
componentes de la conducta como la exploración y la curiosidad.
Se usa una tabla elevada de la superficie, con dimensiones de 40 x 40 x 30 cm, que
contiene 16 agujeros de 3 cm cada uno, distribuidos uniformemente. Se evalúa el
comportamiento de los ratones considerando que el grado de “curiosidad” está
relacionado con el número de veces que el roedor introduce completamente la
cabeza en los agujeros, esto se contabiliza en un tiempo de 5 minutos y ciertos
medicamentos como las benzodiacepinas tienden a disminuir las exploraciones.
(Vogel & Schölkens, 2002)
4.1.2 Test del eje rodante (RotaRod)
El aparato funciona con un cilindro de 2.5 cm de diámetro y 75 cm de longitud,
seccionado horizontalmente por discos de plástico que permite la realización del
ensayo de forma simultánea a varios animales, el sistema gira a una velocidad
ajustable de 2 a 12 revoluciones por minuto, este eje está elevado 25 cm sobre las
plataformas individuales que permiten registrar el tiempo que permanecen los
animales sobre el cilindro debido a que al caer detienen el contador. Esta prueba
evalúa la posible alteración motora que puedan ejercer los compuestos por efecto
de relajación muscular o sedación, y esto le da un valor significativo como prueba
de neurotoxicidad o para determinar el estado basal de los roedores candidatos a
participar en un ensayo neurofarmacológico. (Vogel & Schölkens, 2002)
4.1.3 Campo abierto (Open field)
Se utiliza un campo abierto para evaluar actividad exploratoria, con dimensiones 30
x 30 x 15 cm. Se tiene en cuenta la tendencia natural del animal a explorar, a pesar
del conflicto provocado por el ambiente nuevo. Se cuantifican el número de
entrecruzamientos (con las cuatro patas entre las divisiones del campo),
considerando la periferia y en el centro (actividad exploratoria – actividad ansiolítica
/ sedativa respectivamente). (Lapa, Antonio José - Souccar, Caden - Lima, Teresa
- CM de Lima, 2002)
23
4.1.4 Laberinto en cruz elevado (Elevated Plus Maze)
Consiste en un sistema en forma de cruz griega que tiene dos brazos abiertos de
50 x 10 cm y dos brazos cerrados de 50 x 10 x 40 cm con techo abierto, opuestos
entre sí, utilizado para ratas y elevado 50 cm del suelo, según lo describe Pellow at
el en 1985, que posteriormente fue validado por Lister para ratones cambiando las
dimensiones de los brazos 30 x 5 y 30 x 5 x 25 cm para los abiertos y cerrados
respectivamente conectados por una plataforma central de 5 x 5 cm y elevado a 45
cm del suelo. (Lapa, Antonio José - Souccar, Caden - Lima, Teresa - CM de Lima,
2002) (Pellow & File, 1986)
4.1.5 Ensayo de caja luz - oscuridad (Dark-light box)
El ensayo de exploración luz-oscuridad utiliza el conflicto etológico de los ratones
entre la tendencia para explorar un nuevo ambiente y para evitar un área abierta
iluminada. El aumento en la estancia de la parte iluminada de la caja se considera
un efecto ansiolítico.(Black, 2002)
La caja consta de dos partes, una abierta iluminada y otra oscura con tapa, las
cuales están comunicadas por una ranura que permite el paso del animal entre un
espacio y otro. Las dimensiones son 27 × 27 × 30 cm para el lado de la luz y de 18
× 27 × 30 cm para el lado oscuro.
4.1.6 Ensayo de desesperación conductual o test de nado forzado (forced
swimming test)
Consiste en un procedimiento experimental en el cual se coloca al ratón
previamente administrado (1 hora) en un cilindro con altura de 35 cm y 24 cm de
diámetro que contengan 13.5 cm de agua por un periodo de 6 minutos. Inicialmente
el animal tratará de escapar, pero luego adoptará una postura de inmovilidad a
excepción de los movimientos necesarios para mantener el hocico por encima del
nivel del agua. Los antidepresivos en general aumentan la latencia para la
inmovilidad y reducen el tiempo de inmovilidad presentado por los animales. Existe
una variedad en este ensayo pudiéndose utilizar ratas que son sometidas a una
sesión previa de entrenamiento, varían las dimensiones del recipiente y se tiene en
cuenta el tiempo de nado que en teoría es aumentado por los fármacos inhibidores
de la receptación de serotonina. (Lapa, Antonio José - Souccar, Caden - Lima,
Teresa - CM de Lima, 2002) (Abelaira, Réus, & Quevedo, 2013)
24
4.1.7 Ensayo de suspensión por la cola (Tail suspensión test)
Se considera un modelo predictivo de actividad antidepresiva y es uno de los más
comúnmente usado desde hace 2 décadas, consiste en suspender al ratón por la
cola por un periodo de 5 minutos y registrar el tiempo de inmovilidad para cada
animal y la latencia para la aparición de tal comportamiento, teniendo en cuenta que
debieron ser pre-tratados con una hora de antelación. A diferencia del test de nado
forzado que puede ser utilizado en ratas y ratones este ensayo de suspensión por
la cola solo puede utilizarse en ratones. (Lapa, Antonio José - Souccar, Caden -
Lima, Teresa - CM de Lima, 2002) (Abelaira et al., 2013)
4.1.8 Modelo de convulsión inducida por electrochoque
Este modelo utiliza un aparato estimulador que tiene la capacidad de generar crisis
convulsivas de tipo tónica a través de la aplicación de corriente eléctrica por
electrodos corneales. La respuesta que se espera en el ratón no protegido se
compone de una fase tónica flexora breve y una extensión prolongada de las patas
traseras, esta segunda fase en donde se evidencia una convulsión tónica extensora
se caracteriza por la extensión de las extremidades traseras en un ángulo mayor de
90 grados respecto del eje del cuerpo. (Black, 2002)
Los fármacos que han mostrado efectividad en controlar las convulsiones tónico –
clónicas parciales y generalizadas son los que muestran protección
anticonvulsivante en este tipo de ensayo; fenitoína, carbamazepina, ácido valproico
y fenobarbital los más reconocidos, por esta razón las pruebas de tamizaje con
electrochoque pretender demostrar un perfil protector para las convulsiones
clónicas y/o tónico-clónicas generalizadas.
4.1.9 Modelo de Convulsión inducida con pentilentetrazol (PTZ)
Para el estudio de nuevos fármacos con potencial anticonvulsivo con perfil para
prevenir las crisis de ausencia y las convulsiones mioclónicas se utiliza un método
de inducción química de los eventos convulsivos, el fármaco que logra ese efecto
es el petilentetrazol el cual es un antagonista gabaérgico no competitivo que actúa
sobre el receptor GABA A, bloqueando la entrada de cloro a la célula y de esta forma
facilita la estimulación de la misma. Los fármacos que han demostrado eficacia
protectora en este tipo de ensayo son: etosuxamida, ácido valproico, fenobarbital y
diazepam principalmente, quienes de igual forma en clínica son usados para las
crisis de ausencia. (Black, 2002)
Cada uno de los ensayos mencionados fueron realizados siguiendo los lineamientos
de las normas científicas, técnicas y administrativas para la investigación en salud,
25
establecidas en la Resolución No. 008430 de 1993, del Ministerio de Salud de
Colombia.
Este trabajo fue avalado por el Comité de Ética de la Facultad de Ciencias en
reunión realizada el día 3 de octubre de 2016, acta número 17.
26
5. Diseño experimental y análisis estadístico
La aproximación de los posibles efectos neurológicos, principalmente ansiolíticos
y/o antidepresivos del compuesto evaluado se llevó a cabo de la siguiente manera:
El compuesto pirazolo[1,5-a][1,3,5]triazínico fue suministrado por el grupo “Estudio
químico y de actividad biológica de rutaceae y myristicacea” dirigido por el profesor
Luis Enrique Cuca de acuerdo a la metodología descrita por Estrada.(Estrada
Valencia, 2010) En el anexo A se describe el proceso de síntesis y las
características del compuesto.
Ratones albinos machos CD1(ICR) entre 7 y 9 semanas de peso promedio entre 20
y 30 gramos fueron suministrados por Instituto Nacional de Salud, se transportaron
en cajas metálicas amplias con superficie de viruta y con una cubierta de tela
superior hacia el bioterio del Departamento de Farmacia de la Universidad Nacional
de Colombia, donde se mantuvieron en condiciones controladas de temperatura y
humedad, con ciclos de luz oscuridad de 12 horas. El acceso a la comida y a el agua
fue libre, excepto los días de experimentación en los cuales se les sometió a
periodos de ayuno no mayores a 6 horas. Se realizó cambio diario de la viruta
utilizada como piso en cada una de las cajas en donde se dispusieron en grupos no
mayores a 10 animales distribuidos teniendo en cuenta el peso promedio.
Para registrar los comportamientos en ausencia del experimentador se utilizaron
cámaras de video y todos los procedimientos se llevaron a cabo siguiendo la
normatividad vigente para el manejo de animales y acatando las recomendaciones
del Comité de Ética de la Universidad Nacional de Colombia que avaló el estudio.
El compuesto a evaluar MH4a fue suspendido en Polisorbato-Propilenglicol-
Glicerina-Agua destilada en una proporción de 5:10:10:75. Se prepararon
suspensiones con concentraciones de 7.5 mg/ml, 15 mg/ml y 30 mg/ml, de modo
que al administrar a cada animal un volumen de 0,01 ml/g, las dosis correspondieran
a 75, 150 y 300 mg/Kg. En el caso de los controles positivos (patrones) se utilizó
imipramina a dosis de 32 mg/kg v.o. en las pruebas de nado forzado y suspensión
por la cola, y clonazepam 0.05 mg/kg v.o. en las pruebas de laberinto en cruz
elevado y caja luz - oscuridad. Para los ensayos de actividad ansiolítica y de efecto
anticonvulsivo, se usó la misma fórmula para realizar las suspensiones y en el caso
de los controles negativos se les suministro como vehículo el volumen
correspondiente (0.1 ml/10 g de peso), de acuerdo al peso de cada uno, en todos
los casos por vía oral.
27
La ejecución de los ensayos se realizó utilizando veinte ratones por ciclo de
experimentación, en cada uno de los tres ciclos cada grupo de tratamiento fue
conformado por cuatro ratones, de esta forma se obtuvo un tamaño de muestra total
de doce animales por grupo.
Previamente, fue necesario balancear los grupos y para esto se tuvo en cuenta tres
variables : en la prueba de eje rodante, se registraron los tiempos que cada animal
fue capaz de mantener el equilibrio sobre el eje, esto permitió clasificarlos de
acuerdo a la función motora, para determinar el nivel basal de curiosidad, se utilizó
el test de placa perforada y se registró el número de veces que cada animal introdujo
completamente la cabeza en uno de los orificios de la mencionada placa, y, el tercer
factor fue el peso de los animales, con el registro del peso se terminaron de distribuir
los más equilibradamente posible y se completaron los grupos de tratamiento con
cuatro animales en cada ciclo de experimentación. Conocer las condiciones basales
de los animales y distribuir la variabilidad intrínseca de los mismos nos dio la
posibilidad de atribuir los resultados de los ensayos exclusivamente al efecto de los
tratamientos utilizados.
Los grupos se enumeraron de la siguiente manera: los tres primeros
correspondieron a los tratamientos con MH4a a dosis de 75, 150 y 300 mg/kg
respectivamente, este intervalo de dosificación fue escogido teniendo en cuenta la
dosis utilizada por Estrada de 100mg/kg, las directrices trazadas en técnicas de
tamizaje anticonvulsivante y el programa de desarrollo de medicamentos
antiepilépticos (Estrada Valencia, 2010) (Stables & Kupferberg, 1997) (Porter et al.,
1984), el cuarto grupo fue para los controles positivos y el quinto grupo para los que
se suministró vehículo, como controles negativos.
Se optimizó el uso de los animales empleándolos en pruebas consecutivas, primero
las orientadas a detectar efectos sobre la actividad locomotora, luego aquellas de
actividad de tipo ansiolítico, luego las de tipo antidepresiva y por ultimo las de tipo
anticonvulsivante. Previo al inicio de cada ciclo de experimentos se dio un tiempo
de 10 días adaptativo al ambiente del bioterio de la Universidad Nacional de
Colombia y se dosificaron 3 días previos al inicio de los ensayos.
Para aumentar el tamaño de la muestra, obtener resultados más confiables desde
el punto de vista estadístico para los ensayos de convulsión inducida realizados al
finalizar cada ciclo de experimentación y teniendo en cuenta que solo se puede
realizar una de las dos pruebas mencionadas a cada animal, se añadieron 10
animales que no venían haciendo parte de los experimentos previos, estos ratones
también sometidos a las pruebas de tamizaje para balancearlos y posteriormente
asignarlos de forma aleatoria a cada grupo como se mencionó anteriormente.
Inmediatamente después de finalizar los ensayos los animales fueron sacrificados
28
colocándolos en una cámara con cloroformo, luego fueron introducidos en la nevera
de desechos biológicos para su disposición final.
En este trabajo la hipótesis nula estriba en la posibilidad de que en los diferentes
grupos de tratamiento se obtienen resultados similares y la hipótesis alternativa
niega esta afirmación.
Para los experimentos de: laberinto en cruz elevado, el ensayo de campo abierto
(entrecruzamientos periféricos y totales) y a los test de potencial antidepresivo, nado
forzado y suspensión por la cola, se utilizó la prueba de ANOVA de una sola vía,
previa verificación de la homogeneidad de varianza. Incluyendo la prueba de
diferencias múltiples (post hoc) de Tukey Kramer para identificar los tratamientos
responsables de efectos significativos con respecto al grupo control, la cual es
utilizada para comparar pares de medias. Se escogió esta prueba porque mantiene
bajo el error de tipo I.(Montgomery, 2004) (Barón & Téllez, 2000)
Cuando el supuesto de homogeneidad de varianzas no se satisfizo, se aplicó la
prueba no paramétrica de Kruskall-Wallis seguida de la prueba de Mann-Whitney
cuando procedía, para identificar los tratamientos responsables de las diferencias
significativas con respecto al control. De igual forma, cuando la variable a estudiar
tenía un carácter dicotómico, como se establece en los modelos de convulsión
inducida por electrochoque y el de convulsiones inducidas por pentilentetrazol
(convulsión o protección), se utilizó, igualmente, la prueba no paramétrica de
Kruskal-Wallis. Esta prueba es considerada como la alternativa no paramétrica del
análisis de varianza usual (paramétrico) y se usa para probar o descartar la hipótesis
nula de igualdad de tratamientos.(Montgomery, 2004) (Barón & Téllez, 2000). Todas
las pruebas estadísticas fueron realizadas en el programa Open Stat, asumiendo un
nivel de confianza de 95% (p<0.05).
5.1 De tipo locomotor:
5.1.1 Campo abierto
Se colocaron dos cajas de experimentación en dos lugares específicos del
laboratorio para cada uno de los ciclos de ensayos, de igual forma los trípodes con
las cámaras se dispusieron siempre de igual forma para no alterar los resultados.
Figura 1.
Se administraron los tratamientos para cada grupo de estudio, se colocaron dos
animales de forma simultánea cada uno de ellos en la parte central de la caja, se
29
registraron durante 5 minutos los entrecruzamientos realizados por cada animal
discriminando en totales, centrales y periféricos.
Figura 1. Ensayo de campo abierto
En el análisis de los entrecruzamientos centrales para este ensayo no se evidenció
valores de p significativos entre ninguno de los grupos de tratamiento. Figura 2.
Figura 2. Entrecruzamientos centrales en prueba de campo abierto.
En el caso de los entrecruzamientos periféricos y totales no se evidenciaron
diferencias significativas (p<0.05) por lo cual consideramos que el compuesto MH4a
no afecta la función locomotora. Figuras 3 y 4.
0
10
20
30
40
50
MH4a-75 MH4a-150 MH4a-300 Clonazepam Control
Tie
mp
o (
s)
Tratamiento
ENTRECRUZAMIENTOS CENTRALES
30
Figura 3. Entrecruzamientos periféricos en prueba de campo abierto.
Figura 4. Entrecruzamientos totales en prueba de campo abierto.
5.2 De tipo ansiolítico:
5.2.1 Laberinto en cruz elevado
Una hora después de la administración de los tratamientos cada animal fue
colocado en el centro del aparato con la cabeza en dirección para uno de los brazos
cerrados y su comportamiento fue grabado durante 5 minutos. Se tuvo la precaución
de colocar el LCE siempre en el mismo lugar y posición de la sala de
experimentación, lo mismo ocurrió con el trípode y la cámara. Los registros que se
tomaron de los videos fueron: frecuencia de entradas y tiempo de estancia en los
brazos abiertos. Para facilitar el análisis estadístico se calcularon porcentualmente
los promedios. Figura 5.
0
20
40
60
80
100
120
140
MH4a-75 MH4a-150 MH4a-300 Clonazepam Control
Tie
mp
o (
s)
Tratamiento
ENTRECRUZAMIENTOS PERIFÉRICOS
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
MH4a-75 MH4a-150 MH4a-300 Clonazepam Control
Tie
mp
o (
s)
Tratamiento
ENTRECRUZAMIENTOS TOTALES
31
Figura 5. Ensayo de laberinto en cruz elevado
Para el porcentaje de entradas en los brazos abiertos del LCE, el valor de p
significativo se observó entre los grupos administrados con clonazepam y con
vehículo, hecho que fue reiterativo en cada uno de los ensayos (diferencias
estadísticamente significativas entre el grupo del control respecto del grupo patrón)
y aportó para la validez de predictiva de este trabajo. Aunque se evidencia cierta
tendencia en aumentar la frecuencia de entrada en los brazos abiertos con la dosis
intermedia estos hallazgos no lograron tener significancia estadística. figura 6.
Figura 6. Frecuencia de entradas promedio en los brazos abiertos del LCE.
* p <0.05
Respecto del porcentaje de estancia en los brazos abiertos, las diferencias
significativas se evidenciaron entre los grupos tratados con clonazepam y vehículo,
se obtuvo resultados similares respecto del experimento anterior manteniendo la
*
0
20
40
60
80
MH4a-75 MH4a-150 MH4a-300 Clonazepam Control
Nú
me
ro p
rom
ed
io d
e e
ntr
adas
Tratamiento
ENTRADAS EN BRAZOS ABIERTOS
32
tendencia a aumentar en este caso los tiempos de estancia en los brazos abiertos
con la dosis de 150mg/kg. figura 7.
Figura 7. Estancia promedio en brazos abiertos en LCE. * p <0.05
5.2.2 Ensayo de caja luz-oscuridad
En la parte iluminada se colocó una lámpara con un bombillo de 60 w y registraron
con cámaras de grabación las transiciones de cada animal durante 5 minutos, se
realizaron registros simultáneos colocando los animales de frente a la parte
iluminada de caja. La evaluación de los videos reportó los tiempos de estancia en
la parte iluminada para su posterior análisis. Figura 8.
Figura 8. Ensayo de caja luz - oscuridad
*
0
20
40
60
80
100
MH4a-75 MH4a-150 MH4a-300 Clonazepam Control
Tie
mp
o (
seg)
Tratamiento
ESTANCIA EN BRAZOS ABIERTOS
33
El valor de p significativo se presentó entre el grupo de clonazepam y el grupo de
vehículo, no se observaron diferencias respecto de los grupos de tratamiento con
MH4a. Figura 9.
Figura 9. Estancia en parte iluminada en la prueba de caja luz/oscuridad.
* p <0.05
5.3 De tipo antidepresivo:
5.3.1 Ensayo de desesperación conductual o test de nado forzado
Previa administración de los grupos de tratamiento, se colocaron por parejas en los
cilindros, el agua utilizada fue calentada a 38 grados centígrados previa colocación
de los ratones, para evitar comportamientos de los animales inherentes al frio
producido por la misma. Se registraron con grabaciones de 6 minutos y se
cuantificaron posteriormente los tiempos de inmovilidad como dato para analizar.
Figura 10.
*
0
50
100
150
200
MH4a-75 MH4a-150 MH4a-300 Clonazepam Control
Tie
mp
o (
s)
Tratamiento
ESTANCIA EN PARTE ILUMINADA
34
Figura 10. Test de nado forzado
El valor de p significativo se observó entre los grupos de tratamiento administrados
con imipramina y vehículo. Aunque se evidencia cierta tendencia a disminuir los
tiempos de inmovilidad en con la dosis de 150mg/kg, estos hallazgos no tienen
soporte estadístico. figura 11.
Figura 11. Tiempo de inmovilidad en prueba de nado forzado. * p <0.05
5.3.2 Ensayo de suspensión por la cola
Se dispone de una caja de 4 compartimientos, abierta en su parte anterior y con
cuatro anillos colocados en su techo, en cada uno de los anillos con el uso de cinta
adhesiva se colocaron los animales una hora después de la administración de los
tratamientos, se grabaron durante 6 minutos cada grupo de animales y se
registraron posteriormente en la revisión de los videos los tiempos de inmovilidad
para su posterior análisis estadístico. Figura 12.
Figura 12. Ensayo de suspensión por la cola.
*
0
50
100
150
200
MH4a-75 MH4a-150 MH4a-300 Imipramina Control
Tie
mp
o (
s)
Tratamiento
TIEMPO DE INMOVIL IDAD
35
El valor con significancia estadística se presentó cuando se comparon los grupos
administrados con clonazepam y con vehículo, se mantiene cierta tendencia a
mejorar los tiempos de inmovilidad con la dosis intermedia. figura 13.
Figura 13. Tiempo de inmovilidad en prueba de suspensión por la cola.
* p <0.05
5.4 De efectos anticonvulsivantes
5.4.1 Modelo de convulsión inducida por electrochoque
Previo a la realización de este ensayo se realizó una prueba piloto en donde se
corroboró los parámetros ya programados del estimulador marca Coulbourn modelo
A13-65 y se registró el protocolo específico con el número “30”, éste establece: una
corriente de 50 mA, la frecuencia de 60 Hz, el tiempo de retardo de 15 ms, primer
pulso positivo de 0,6 ms, interpulso de 0,5 ms, segundo pulso positivo de 0,6 ms y
una descarga de ocho ciclos para un tiempo total de 0,1336 s.
Como se mencionó anteriormente para estos ensayos de inducción convulsiva en
cada ciclo de experimentación se aumentó el número de animales por prueba. Dos
ratones fueron adicionados a cada uno de los grupos de tratamiento que venían
realizado todos los ensayos previos. Para estas pruebas el patrón positivo fue
clonazepam a dosis de 0.05 mg/kg. Se administraron los animales con una hora
previa a la realización del ensayo con las mismas condiciones mencionadas en
metodología general.
Se ajustó la distancia entre los electrodos corneales y se instiló una gota de solución
salina normal en cada ojo previo a la colocación de los electrodos para permitir la
conducción del impulso eléctrico.
*
0
20
40
60
80
100
120
MH4a-75 MH4a-150 MH4a-300 Imipramina Control
Tie
mp
o (
s)
Tratamiento
TIEMPO DE INMOVIL IDAD
36
Se aplicó el estímulo eléctrico solo 1 vez a cada animal y se consideró como efecto
protector el bloqueo del componente extensor tónico de las extremidades traseras,
inmediatamente posterior al registro, los animales que sobrevivieron se colocaron
en la cámara con cloroformo. Figura 14.
Figura 14. Modelo de convulsión inducida por electrochoque.
El grupo patrón, clonazepam, como el producto evaluado, MH4a (150 y 300 mg/kg) mostró efectos significativos con respecto al control. figura 15.
Figura 15. Protección anticonvulsiva en modelo de convulsión inducida por
electrochoque. * p <0.05
* **
0123456789
10
MH4a-75 MH4a-150 MH4a-300 Clonazepam Control
Nú
me
ro d
e r
ato
ne
s
Tratamiento
MODELO DE CONVULSIÓN INDUCIDA POR ELEC TROSHOCK
Convulsión Protección
37
5.4.2 Modelo de Convulsión inducida con pentilentetrazol (PTZ)
Una hora después de la administración de los tratamientos descritos, recordando el
clonazepam como control positivo y el aumento del tamaño de la muestra ya
explicado previamente, se aplicó vía subcutánea pentilentetrazol (PTZ) a una dosis
de 80 mg/kg, se vigiló la respuesta de los animales durante un periodo de 30 minutos
y se consideró como no protección el hecho de presentar al menos un episodio de
movimientos musculares espasmódicos repetitivos que persistieran por más de 5
segundos. Figura 16.
Posterior a este tiempo de observación los animales sobrevivientes se colocaron en
la cámara con cloroformo.
Figura 16. Modelo de convulsión inducido por Pentilentetrazol.
El grupo patrón, clonazepam, mostró diferencias estadísticas respecto del grupo
control, se observa protección con MH4a a dosis de 150 y 300 mg/kg (4 y 5 animales
respectivamente) sin que estos sean significativos. Figura 17.
38
Figura 17. Protección anticonvulsiva en modelo de convulsión inducida por
PTZ. * p <0.05
*
0123456789
10
MH4a-75 MH4a-150 MH4a-300 Clonazepam Control
Nú
me
ro d
e a
nim
ale
s
Tratamiento
MODELO DE CONVULSIÓN INDUCIDA POR PTZ
Convulsión Protección
39
6. Discusión
En el ensayo de campo abierto el número de entrecruzamientos centrales,
periféricos y totales, presentados por cada uno de los grupos de estudio no
evidenció diferencias desde el punto de vista estadístico, como es de esperarse se
observó un aumento en el número de entrecruzamientos centrales en el grupo
administrado con clonazepam, lo cual es atribuible al efecto ansiolítico generado por
este fármaco.
Para el LCE, tanto en el número de entrecruzamientos como en el tiempo de
estancia en los brazos abiertos se evidenciaron diferencias estadísticamente
significativas cuando se comparó el grupo del control positivo con los grupos en
donde las dosis fueron de 75 y 300 mg/kg de MH4a, así como con el grupo del
control negativo. Ninguna de las dosis de MH4a mostró valores de p significativos
respecto del grupo control. En el estudio previo realizado por Estrada et al este
compuesto había mostrado cierta tendencia a dosis de 100 mg/kg, en este trabajo
se observó a dosis de 150 mg/kg pero tampoco se alcanzó significancia
estadística.(Estrada Valencia, 2010)
Respecto del ensayo de caja luz – oscuridad, en el estudio de Estrada et al no
realizó esta prueba por lo cual no tenemos la referencia experimental, sin embargo,
los resultados actuales se mantienen en concordancia con el ensayo mencionado
anteriormente del LCE, debido a que se conserva la tendencia a aumentar el tiempo
de estancia en la parte iluminada de la caja a dosis de 75 y 150 mg/kg, pero decreció
cuando se dosifico con 300 mg/kg. Las diferencias estadísticas se observan entre
el grupo control y el patrón, como entre el clonazepam y las dosis de 75 y 300 mg
/kg, en concordancia con el ensayo mencionado anteriormente se observa menor
conducta ansiosa a dosis de 150 mg/kg sin que esto sea significativo desde el punto
de vista estadístico.(Estrada Valencia, 2010)
Los resultados arrojados en el test de nado forzado muestran diferencias
estadísticas del grupo que fue administrado con Imipramina respecto de los grupos
que fueron dosificados con 75mg/kg y 300 mg/kg de MH4a y con el grupo control,
llamativamente se observó tendencia antidepresiva a dosis de 150 mg/kg, el estudio
realizado por Estrada a dosis de 100 mg/kg MH4a no mostró ningún efecto en
mejorar los tiempos de inmovilidad. (Estrada Valencia, 2010)
El ensayo de suspensión por la cola no fue realizado en el trabajo de Estrada et al,
los experimentos realizados en el actual estudio mantienen un patrón estadístico
muy similar respecto del ensayo de nado forzado y conservan la constante, de que
se observaron diferencias desde el punto de vista estadístico entre el grupo control
40
y el grupo patrón, y, cierta tendencia con la dosis de 150mg/kg de MH4a a mejorar
los tiempos de inmovilidad pero sin robustez estadística que sustente este último
hallazgo. (Estrada Valencia, 2010)
En el modelo de convulsión inducida por electrochoque se evidenció protección en
dos de los nueve ratones en quienes se administró 75 mg/kg de MH4a, es de
resaltar que cuando los animales fueron dosificados con dosis más altas (150 y 300
mg/kg) todos los animales fueron protegidos, desde la óptica estadística estos
resultados fueron significativos contrariamente a los resultados reportados por
Estrada et al, donde no evidenciaron protección en ninguno de los 7 animales a los
que le administraron 100 mg/kg de MH4a.(Estrada Valencia, 2010)
Para el desarrollo del modelo de convulsión inducida por PTZ se utilizaron también
nueve animales por grupo, sin evidenciar ninguna protección cuando la dosis de
MH4a fue de 75 mg/kg, en su trabajo Estrada et al reportan que solo un animal fue
protegido, ellos utilizaron siete ratones por grupo y los dosificaron con 100 mg/kg de
MH4a. El efecto protector se incrementó cuando la cantidad de compuesto
administrado fue mayor, en el grupo de 150 mg/kg hubo protección en cuatro de los
nueve animales y en el grupo de la dosis superior (300 mg/kg) de MH4a se registró
protección en cinco de los nueve ratones. En el grupo patrón solo 1 animal no fue
protegido con el clonazepam. No hubo diferencias estadísticamente significativas
entre los grupos de tratamiento de dosis intermedia y alta de MH4a respecto del
grupo control positivo.(Estrada Valencia, 2010)
Datos no publicados en un trabajo conjunto de cooperación con este compuesto
señalan que tiene efectos agonistas del receptor GABA-A/BZD, esta afinidad por el
receptor nos dan una correlación de los hallazgos in vitro e in vivo, con lo cual
podemos inferir que los resultados de carácter ansiolítico y anticonvulsivante
pueden deberse a la activación del mencionado receptor benzodiazepínico.
Los fármacos que son agonistas del receptor GABA-A/BZD normalmente no
muestran resultados positivos en los ensayos antidepresivos, en este trabajo
obtuvimos tendencias en las pruebas de nado forzado y suspensión por la cola, es
decir que esta pirazolotriazina tal vez actúa a través de otros mecanismos de acción.
La disminución en las pruebas de laberinto en cruz elevado, caja luz-oscuridad,
nado forzado y suspensión por la cola cuando se utilizó la dosis superior, podría
obedecer a efectos cuyo mecanismo de acción es diferente a los mencionados y
por ende posiblemente contrarrestaron el efecto inicial. Este patrón de respuesta
observado en una curva de respuesta tipo U y U invertida reflejan precisamente la
participación de múltiples respuestas biológicas que responden a diferentes
41
gradientes de concentración en un intento por conservar la homeostasis.(Calabrese
& Baldwin, 2001)
En la tesis desarrollada por Juan Camilo Escobar, se obtuvo una sal del compuesto
denominado MH4b, el cual hace parte de los cuatro evaluados previamente por
Estrada. El pirazolo [1,5-a] [1,3,5] triazina: 2-etiltio-7-metil-4-(4-metilfenil)
pirazolo[1,5-a][1,3,5]triazina) fue sometido a agitación en una solución de ácido
clorhídrico al 5% hasta su solubilización, previo a la realización de los ensayos de
tipo anticonvulsivante, sin embargo los resultados no fueron mejores que los ya
reportados en el tamizaje realizado por Estrada, esto podría explicar que la sal
aunque mejora la solubilidad del compuesto no garantiza la penetración en la
barrera hematoencefálica.(Estrada Valencia, 2010) (Escobar, 2016)
Una limitación importante es este trabajo de investigación fue que el
experimentador, quien revisaba los vídeos, tabuló los datos y realizó el análisis de
los resultados fue la misma persona, se reconoce que esto puede producir un sesgo
de medición, pero no invalida los resultados obtenidos.
42
7. Conclusiones
MH4a no afecta la función locomotora cuando se prueba en el ensayo de campo
abierto.
MH4a muestra cierta tendencia de tipo ansiolítico y antidepresivo que no se puede
concluir a la luz de nuestros datos en las pruebas de laberinto en cruz, caja luz-
oscuridad, suspensión por la cola y nado forzado.
MH4a ejerce efectos de tipo anticonvulsivante, según los modelos de convulsión inducida por electrochoque y pentilentetrazol, que podrían deberse a la activación del receptor GABA/BZD.
43
8. Recomendaciones
Se recomienda la realización de nuevos ensayos con el fin de aumentar el tamaño
de la muestra y de esta forma poder evidenciar significancia estadística en las
pruebas de laberinto en cruz elevado, caja luz-oscuridad, nado forzado y suspensión
por la cola.
44
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Anexo A
Tomado del trabajo de tesis de Martin Estrada: Efectos neurofarmacológicos de análogos de Pirazolo[1,5-a][1,3,5]triazinas, 2010.(Estrada Valencia, 2010)
Pirazolo[1,5-a][1,3,5]triazinas. Estructura y nomenclatura.
Son compuestos que poseen la estructura general mostrada en la figura 1a. Su nombre se debe a que el anillo del pirazol (1,2-diazol), heterociclo de cinco miembros, se encuentra unido a través de las posiciones 1 y 5 a la cara “a” de la 1,3,5-triazina, heterociclo de seis miembros con tres átomos de nitrógeno en posiciones 1,3 y 5 (Figura 1b).
48
Figura 1. A estructura general, b nomenclatura de pirazolo [1,5-a][1,3,5] triazinas.
Esta clase de compuestos se numera partiendo del nitrógeno adyacente al anillo del pirazol y continuando hacia el siguiente átomo de nitrógeno triazínico como se muestra en la figura 1a.
El trabajo realizado por Insuasty et al en el año 2006 condujo a la obtención de las nuevas 4-aril-7-metil-2-tioetilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazinas MH4ad, a partir de la reacción regioselectiva de 5-amino-3-metilpirazol 1 con los aroiliminoditiocarbonatos de S,S-dietilo 2a-d. Esquema 1.
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Las posibles rutas de ciclación son varias si se tiene en cuenta que el pirazol posee tres centros nucleofílicos: el carbono en posición 3, el grupo amino en posición 1 y el grupo amino en posición 5, y que en los aroiliminoditiocarbonatos existen dos centros electrofílicos que son el carbono carbonílico y el carbono imínico.
Tabla 1. Propiedades físicas de los productos MH4a-d obtenidos por Insuasty y sus
colaboradores.
Estos compuestos fueron plenamente caracterizados mediante las técnicas espectroscópicas de Resonancia Magnética Nuclear de Hidrógeno (RMN-1H), de carbono 13 (RMN-13C), mono y bidimensionales y mediante difracción de rayos X (DRX) en el caso de los productos MH4b y MH4d cuya estructura cristalina lo permitió4. Los
datos de desplazamiento químico () de los átomos de hidrógeno y de carbono presentes en estos compuestos se resumen en las tablas 2 y 3.
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Tabla 2. Datos de 1H-RMN de MH4a-d. DMSO-d6, 400MHz (TMS-estándar interno)
Tabla 3. Datos de 13C-RMN de MH4a-d, DMSO-d6, 100MHz (TMS-estándar
interno)
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