TERRENO DI COLTURA Miscela di composti biologici o sintetici, organici o minerali, capace di fornire...

TERRENO DI TERRENO DI COLTURACOLTURA

Miscela di composti biologici o sintetici, Miscela di composti biologici o sintetici, organici o minerali, capace di fornire un organici o minerali, capace di fornire un ambiente ottimale per la crescita di un ambiente ottimale per la crescita di un particolare tipo di microrganismoparticolare tipo di microrganismo

TERRENI DI COLTURATERRENI DI COLTURA

I microrganismi vivono in natura in I microrganismi vivono in natura in popolazioni che sono dette miste, costituite da popolazioni che sono dette miste, costituite da un’ampia varietà di differenti tipi di microbi. I un’ampia varietà di differenti tipi di microbi. I microrganismi necessitano di ambienti microrganismi necessitano di ambienti favorevoli e di sostanze nutritive adatte. Il favorevoli e di sostanze nutritive adatte. Il terreno di coltura deve contenere principi terreno di coltura deve contenere principi nutritivi essenziali per lo sviluppo di una nutritivi essenziali per lo sviluppo di una coltura microbica e deve fornire condizioni coltura microbica e deve fornire condizioni ambientali adatte alla crescita, vale a dire ambientali adatte alla crescita, vale a dire condizioni ottimali di: pH, pressione osmotica, condizioni ottimali di: pH, pressione osmotica, ossigeno atmosferico,ecc.ossigeno atmosferico,ecc.

TIPI DI TERRENITIPI DI TERRENI TERRENI COMPLESSI: non si conosce la loro TERRENI COMPLESSI: non si conosce la loro

esatta composizione chimica; sono i più esatta composizione chimica; sono i più comunemente usati; x es.: Brodo Comune, Brodo comunemente usati; x es.: Brodo Comune, Brodo di Malto, MRS.di Malto, MRS.

TERRENI DEFINITI o SINTETICI: si conosce TERRENI DEFINITI o SINTETICI: si conosce l’esatta composizione chimica; formato da l’esatta composizione chimica; formato da composti chimici puri, aggiunti a concentrazione composti chimici puri, aggiunti a concentrazione nota.nota.

TERRENI SELETTIVI o DI ARRICCHIMENTO: TERRENI SELETTIVI o DI ARRICCHIMENTO: terreni di coltura aventi una combinazione di terreni di coltura aventi una combinazione di nutrienti che in combinazione con opportune nutrienti che in combinazione con opportune condizioni fisiche permettono l’isolamento di condizioni fisiche permettono l’isolamento di SPECIFICI microrganismi (x es. con l’uso di SPECIFICI microrganismi (x es. con l’uso di antibiotici)antibiotici)


Nutrient BrothNutrient Broth Nutrient AgarNutrient Agar peptone 5 gpeptone 5 g estratto di carne 1 gestratto di carne 1 g estratto di lievito 2 gestratto di lievito 2 g sodio cloruro 5 gsodio cloruro 5 g acqua dist. 1000 mlacqua dist. 1000 ml Sospendere i componenti in acqua dist. fredda Sospendere i componenti in acqua dist. fredda

poco a poco per evitare la formazione di grumi, poco a poco per evitare la formazione di grumi, agitare e portare all'ebollizione fino a completa agitare e portare all'ebollizione fino a completa soluzione. Aggiustare il pH fino a 7,4.soluzione. Aggiustare il pH fino a 7,4.

Sterilizzare in autoclave.Sterilizzare in autoclave.

X BATTERIX BATTERIX LIEVITI E MUFFEX LIEVITI E MUFFE

De Man Rogosa Sharpe (MRS) per LATTOBACILLIDe Man Rogosa Sharpe (MRS) per LATTOBACILLI Peptone from casein 10.0g;Peptone from casein 10.0g; meat extract 8.0g;meat extract 8.0g; yeast extract 4.0g;yeast extract 4.0g; D(+)-glucose 20.0g;D(+)-glucose 20.0g; dipotassium hydrogen phosphate 2.0g;dipotassium hydrogen phosphate 2.0g; Tween® 80 1.0g;Tween® 80 1.0g; di-ammonium hydrogen citrate 2.0g;di-ammonium hydrogen citrate 2.0g; sodium acetate 5.0g;sodium acetate 5.0g; magnesium sulfate 0.2g;magnesium sulfate 0.2g; manganese sulfate 0.04g;manganese sulfate 0.04g; agar-agar (not present in MRS broth) 14.0gagar-agar (not present in MRS broth) 14.0g acqua dist. 1000 mlacqua dist. 1000 ml


LIQUIDI: sono chiamati BRODI (LIQUIDI: sono chiamati BRODI (BROTHBROTH)) SOLIDI: contengono AGAR. SOLIDI: contengono AGAR.

agaragar - È un polisaccaride contenente zolfo estratto da un’alga- È un polisaccaride contenente zolfo estratto da un’algamarina. Reperibile in commercio in forma essiccata pura. Si marina. Reperibile in commercio in forma essiccata pura. Si

disidrata facilmente. Ci sono vari tipi di agar che hanno disidrata facilmente. Ci sono vari tipi di agar che hanno proprietà fisiche diverse.proprietà fisiche diverse.

- Non è un nutriente, ma utilizzato come agente solidificante- Non è un nutriente, ma utilizzato come agente solidificantenei terreni di coltura.nei terreni di coltura. Dal punto di vista chimico è un galattano, carboidrato Dal punto di vista chimico è un galattano, carboidrato

complesso formato da molecole di galattosio.complesso formato da molecole di galattosio. - Liquefazione a 97/100°C; solidificazione a 42/ 45°C- Liquefazione a 97/100°C; solidificazione a 42/ 45°C I terreni agarizzati possono essere incubati a tutte le I terreni agarizzati possono essere incubati a tutte le

temperature.temperature. Possono essere anche utilizzate gelatina o gel di silicePossono essere anche utilizzate gelatina o gel di silice

CRESCITA IN SUBSTRATI CRESCITA IN SUBSTRATI LIQUIDILIQUIDI

Se il terreno è liquido la crescita può dar luogo a: 1) Se il terreno è liquido la crescita può dar luogo a: 1) Intorbidamento 2) Formazione di una pellicola 3) Intorbidamento 2) Formazione di una pellicola 3) Sedimento (lievito) 4)MucositàSedimento (lievito) 4)Mucosità

INGLOBAMENTO O INGLOBAMENTO O INCLUSIONEINCLUSIONE

Il terreno viene seminato mentre è ancora liquidoIl terreno viene seminato mentre è ancora liquido

I microrganismi ad occhi nudo: I microrganismi ad occhi nudo: crescita in substrati liquidicrescita in substrati liquidi

I MICRORGANISMI AD OCCHIO I MICRORGANISMI AD OCCHIO NUDO:CRESCITA IN SUBSTRATI NUDO:CRESCITA IN SUBSTRATI

SOLIDISOLIDI ( SLANT) ( SLANT) L’agar inclinato è una provetta di terreno a base di agar che viene posta L’agar inclinato è una provetta di terreno a base di agar che viene posta

obliqua durante il raffreddamento e si presta per essere seminata con obliqua durante il raffreddamento e si presta per essere seminata con l’ansa o con l’ago. Sono più facilmente osservabili le colture che l’ansa o con l’ago. Sono più facilmente osservabili le colture che producono pigmentoproducono pigmento


SOLIDI (SLANT)SOLIDI (SLANT)

LA SEMINA DEI TERRENI DI LA SEMINA DEI TERRENI DI COLTURACOLTURA

SEMINA DI TERRENO SOLIDOSEMINA DI TERRENO SOLIDO SPATOLAMENTO SPATOLAMENTO

STRISCIOSTRISCIO


SOLIDI (PIASTRE DI PETRI)SOLIDI (PIASTRE DI PETRI)Se si aggiunge una sostanza solidificante ad un brodo che contiene Se si aggiunge una sostanza solidificante ad un brodo che contiene

cellule batteriche, si verificherà che queste rimangono cellule batteriche, si verificherà che queste rimangono intrappolate ciascuna al proprio posto invece di galleggiare intrappolate ciascuna al proprio posto invece di galleggiare (terreno liquido) e , moltiplicandosi produrrano una massa (terreno liquido) e , moltiplicandosi produrrano una massa visibile di cellule, detta visibile di cellule, detta COLONIACOLONIA..


SOLIDI (PIASTRE DI PETRI)SOLIDI (PIASTRE DI PETRI) Se le cellule si raggruppano ad una certa distanza, Se le cellule si raggruppano ad una certa distanza,

ciascuna sarà in grado di sopravvivere e genererà una ciascuna sarà in grado di sopravvivere e genererà una colonia isolata. Colonie di microrganismi diversi colonia isolata. Colonie di microrganismi diversi differiscono per misura, colore e struttura.Per questo differiscono per misura, colore e struttura.Per questo motivo l’aspetto di una colonia è importante per motivo l’aspetto di una colonia è importante per l’identificazione di una coltura.l’identificazione di una coltura.


SOLIDI (PIASTRE DI PETRI)SOLIDI (PIASTRE DI PETRI) TECNICA DELLA STRISCIATA SU PIASTRATECNICA DELLA STRISCIATA SU PIASTRA Si può trasferire una coltura microbica sulla superficie Si può trasferire una coltura microbica sulla superficie

dell’agar di una piastra petri con l’ansa o con l’ago dell’agar di una piastra petri con l’ansa o con l’ago incurvato; questa tecnica viene chiamata di trasferimento incurvato; questa tecnica viene chiamata di trasferimento per striscio ed una piastra così preparata viene detta per striscio ed una piastra così preparata viene detta strisciata. Esistono varie tecniche di striscio su piastra. strisciata. Esistono varie tecniche di striscio su piastra. Attenzione! Bisogna flambare e Attenzione! Bisogna flambare e

far lasciare raffreddare l’ago o l’ansa far lasciare raffreddare l’ago o l’ansa

ad ogni passaggio. ad ogni passaggio. L’obiettivo della tecnica dello striscio L’obiettivo della tecnica dello striscio

è quella di formare da una sospensione diè quella di formare da una sospensione di

cellule, cellule,

delle colonie ben separate. delle colonie ben separate.

All’inizio di una striscio le cellule sono strettamente All’inizio di una striscio le cellule sono strettamente compatte, ma con il proseguire lo striscio le cellule compatte, ma con il proseguire lo striscio le cellule rimangono sempre meno sull’ago, trasferendosi rimangono sempre meno sull’ago, trasferendosi sempre più distanziate sull’agar formando colonie sempre più distanziate sull’agar formando colonie sempre più separate.sempre più separate.

Poche strisciate frettolose non producono colonie Poche strisciate frettolose non producono colonie separate; una buona piastra è il risultato di molti separate; una buona piastra è il risultato di molti movimenti continui dell’ansa o dell’ago. Si inizia con movimenti continui dell’ansa o dell’ago. Si inizia con una goccia di coltura sul bordo della piastra.una goccia di coltura sul bordo della piastra.

In una delle tecniche si sterilizza alla fiamma l’ago per In una delle tecniche si sterilizza alla fiamma l’ago per lo striscio o l’ansa e si raffredda sul bordo dell’agar. Si lo striscio o l’ansa e si raffredda sul bordo dell’agar. Si tiene sempre semicoperta la piastra di petri. La goccia tiene sempre semicoperta la piastra di petri. La goccia deve essere opposta a voi e strisciate verso di voideve essere opposta a voi e strisciate verso di voi

CONCETTO DI STERILITÀCONCETTO DI STERILITÀ

STERILIZZAZIONE: distruzione di ogni organismo vivente,STERILIZZAZIONE: distruzione di ogni organismo vivente,(comprese le endospore di (comprese le endospore di Bacillus Bacillus e e Clostridium)Clostridium).. DEVE essere DEVE essere assoluta assoluta In un laboratorio di microbiologia. In un laboratorio di microbiologia.

Nelle industrie alimentari è un concetto statistico (tempi Nelle industrie alimentari è un concetto statistico (tempi di riduzione decimale).di riduzione decimale).

Il più usato ed efficace strumento per sterilizzare è il Il più usato ed efficace strumento per sterilizzare è il CALORECALORE

PERCHÉ? Perché le proteine denaturanoPERCHÉ? Perché le proteine denaturano Lo strumento principale di sterilizzazione in microbiologia Lo strumento principale di sterilizzazione in microbiologia

è:è: L’AUTOCLAVEL’AUTOCLAVE: sterilizza attraverso il vapore sotto : sterilizza attraverso il vapore sotto

pressionepressione(assai più efficace del CALORE secco)(assai più efficace del CALORE secco)

L’AUTOCLAVEL’AUTOCLAVE

sovrapressione di 1atm =sovrapressione di 1atm =121°C; 121°C; tempo di 15 minutitempo di 15 minuti il vapore deve poter entrare il vapore deve poter entrare in contatto con le soluzioniin contatto con le soluzioni (tappi di cotone; bottiglie aperte)(tappi di cotone; bottiglie aperte)

P/T minori eP/T minori etempi maggiori pertempi maggiori perlimitare il danno ai composti organicilimitare il danno ai composti organici(imbrunimento, caramellizzazione)(imbrunimento, caramellizzazione) N.B.: N.B.: Molti zuccheri eMolti zuccheri egli antibiotici devono essere sterilizzati pergli antibiotici devono essere sterilizzati perfiltrazione filtrazione

LAVORARE IN STERILITÀLAVORARE IN STERILITÀ

PipettePipette AnsaAnsa SpatolaSpatola Becco BunsenBecco Bunsen Si lavora con fiamma ossidanteSi lavora con fiamma ossidante(azzurra, più calda, più stabile),(azzurra, più calda, più stabile), NON riducente (gialla)NON riducente (gialla)

Tutti i terreni di coltura dovrebbero essere Tutti i terreni di coltura dovrebbero essere controllati prima dell'uso per controllati prima dell'uso per contaminazione e data di scadenza.contaminazione e data di scadenza.

L’area iniziale di semina deve ricoprire una L’area iniziale di semina deve ricoprire una superficie compresa fra un terzo ed un superficie compresa fra un terzo ed un quarto dell’area complessiva dell’agar quarto dell’area complessiva dell’agar utilizzato. Possono essere utilizzate in utilizzato. Possono essere utilizzate in funzione delle circostanze piastre intere, a funzione delle circostanze piastre intere, a metà od a quattro settori. I campioni metà od a quattro settori. I campioni devono essere seminati per ottenere colonie devono essere seminati per ottenere colonie isolate, o diffusi direttamente su un intera isolate, o diffusi direttamente su un intera porzione di una piastra e posti ad incubare porzione di una piastra e posti ad incubare senza successiva diffusione del materiale.senza successiva diffusione del materiale.

Le anse metalliche devono essere flambate portando la Le anse metalliche devono essere flambate portando la loro estremità nella parte inferiore della fiamma di un loro estremità nella parte inferiore della fiamma di un Bunsen fino a che l’intera ansa non assume colore rosso Bunsen fino a che l’intera ansa non assume colore rosso per il calore. Riporle a raffreddare su un supporto prima per il calore. Riporle a raffreddare su un supporto prima del loro utilizzo. Ciò può essere eseguito prima e dopo il del loro utilizzo. Ciò può essere eseguito prima e dopo il loro utilizzo e fra la semina di piastre di agar.loro utilizzo e fra la semina di piastre di agar.

E’ consuetudine utilizzare due anse per consentire un E’ consuetudine utilizzare due anse per consentire un adeguato raffreddamento di ciascuna dopo la flambatura adeguato raffreddamento di ciascuna dopo la flambatura mentre si sta utilizzando l’altra ansa. Possono essere mentre si sta utilizzando l’altra ansa. Possono essere utilizzate per ciascuna piastra anse monouso diverse. Le utilizzate per ciascuna piastra anse monouso diverse. Le anse di metallo devono essere riscaldate con la fiamma di anse di metallo devono essere riscaldate con la fiamma di un Bunsen con la parte terminale dell’ansa rivolta verso un Bunsen con la parte terminale dell’ansa rivolta verso basso fino ad arroventarsi, poi rimosse e lasciate basso fino ad arroventarsi, poi rimosse e lasciate raffreddare.raffreddare.

Tutti i terreni devono essere incubati il più presto Tutti i terreni devono essere incubati il più presto possibile. La piastre per l’incubazione anaerobica devono possibile. La piastre per l’incubazione anaerobica devono essere incubate il più presto possibile per prevenire la essere incubate il più presto possibile per prevenire la perdita di vitalitàperdita di vitalità

TECNICA ASETTICATECNICA ASETTICA

Quando si manipolano campioni o culture, la Quando si manipolano campioni o culture, la tecnica asettica risulta importante per tecnica asettica risulta importante per evitare la loro contaminazione e proteggere evitare la loro contaminazione e proteggere chi lavora da infezione proveniente dal chi lavora da infezione proveniente dal campione.campione.

Se il lavoro viene svolto su un banco aperto, Se il lavoro viene svolto su un banco aperto, uno sterilizzatore Bunsen dovrebbe essere uno sterilizzatore Bunsen dovrebbe essere collocato in stretta prossimità per flambare collocato in stretta prossimità per flambare le anse o i fili metallici.le anse o i fili metallici.

· Quando si aprono i contenitori delle culture · Quando si aprono i contenitori delle culture mantenere il campioni lontano dal visomantenere il campioni lontano dal viso

INCUBAZIONE DEI INCUBAZIONE DEI MICRORGANISMIMICRORGANISMI

I brodi o i terreni agarizzati seminati devono essere posti I brodi o i terreni agarizzati seminati devono essere posti ad unaad una

TEMPERATURA, per un TEMPO e nelle CONDIZIONI ottimali TEMPERATURA, per un TEMPO e nelle CONDIZIONI ottimali perper

permettere la crescita del microrganismo con sui si sta permettere la crescita del microrganismo con sui si sta lavorandolavorando

Esempi:Esempi: Bacillus stearothermophilusBacillus stearothermophilus G+, anaerobio facoltativo, termofiloG+, anaerobio facoltativo, termofilo Bifidobacterium bifidumBifidobacterium bifidum G+, anaerobio stretto, mesofiloG+, anaerobio stretto, mesofilo Incubazione a 60°C per 8-12 h Incubazione a 37°C per 36-Incubazione a 60°C per 8-12 h Incubazione a 37°C per 36-

48 h48 h Le piastre vanno incubate in posizione capovolta.Le piastre vanno incubate in posizione capovolta. Scrivere nome, data e tipo di contenutoScrivere nome, data e tipo di contenuto

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