Colture a termine

La coltura da espianti viene definita coltura a termine per

indicare che le cellule isolate da qualsiasi tessuto animale

sono in grado di compiere un numero finito di divisioni

cellulari in vitro per poi andare incontro a degenerazione e

morte.

Colture continue

Sono cellule in cui mutazioni spontanee o indotte hanno

annullato il programma genetico della senescenza

Colture cellulari

aderenti in sospensione

L’adesione è un fenomeno attivo che richiede

l’interazione dei recettori di membrana, le integrine, con

le proteine adesive, quali la fibronectina, adsorbite sulla

piastra di coltura

Terreni per colture

MEM Minimum Essential Medium

DMEM Dulbecco’s Modification of MEM

RPMI Roswell Park Memorial Institute

La soluzione di sali, glucosio, amminoacidi e vitamine

costituisce il terreno base

Questi terreni differiscono tra loro per il contenuto in a.a.

e sali e per la concentrazione di glucosio

Il sistema tampone utilizzato nei terreni è:

HCO3- / H2CO3

H2CO3 deriva dalla CO2 dell’atmosfera e in parte da quella

prodotta dalle cellule

Per questo motivo le cellule devono essere coltivate in

atmosfera al 5% di CO2 e necessitano pertanto di

incubatori con sistema di controllo dell’atmosfera!

Altri sistemi tampone: HEPES N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N’-(2-ethanesulfonicacid)

I terreni tamponati con HEPES sono utili quando le cellule vive i devono essere manipolate per tempi lunghi fuori

dall’incubatore. In questo caso la CO2 dell’atmosfera non è sufficiente a mantenere il pH neutro per cui il terreno si

alcalinizza con conseguente danno per le cellule

I terreni inoltre sono provvisti dell’indicatore rosso fenolo

7.36.8-7.0 > 7.6pH

Con il proliferare delle cellule il terreno tenderà al giallo a

causa dell’acidificazione prodotta dalla CO2 proveniente

dal metabolismo cellulare.

Il colore viola india che le cellule non sono

metabolicamente attive o che la regolazione della CO2 è

errata

Il terreno al momento dell’uso viene completato con:

•Glutammina (è un amminoacido labile)

•Antibiotici

•Siero (in genere al 10%)

Colture di cellule aderenti

Le cellule aderenti vengono poste in piastra e crescono fino

ad occupare l’intera superficie disponibile

Coltura confluente

A confluenza la crescita si arresta e le cellule devono essere

trasferite in nuove piastre

Per staccare le cellule dal fondo si utilizza una soluzione di

EDTA e tripsina

EDTA = chela il Ca++ ed il Mg++ indispensabili per l’adesione

Tripsina = degrada le proteine della matrice che mantengono

le cellule aderenti.

Le cellule staccate devono essere riseminate e non crescono in

modo efficiente e vanno incontro a morte se seminate al di

sotto di una certa densità

0 24 48 72 96 120 1440123456789

101112

ore

cellu

le/c

m2x

104

Diagramma di crescita cellulare in vitro

arresto della crescita a confluenza

fase logaritmica di crescita

Test di vitalità cellulare

Saggio con il Blu Tripano

Il Blu Tripano è un colorante utilizzato nel test di

determinazione della vitalità cellulare. Questo colorante

permette di discriminare tra le cellule vitali e quelle morte in

quanto è assunto solo dalle cellule morte

Dosaggio MTT bromuro di 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil tetrazolio

MTT(giallo)

mitocondrio

Formazano

Colore (azzurro)

MTT

Piastre da coltura cellulare

Le piastre per colture batteriche possono essere usate per

colture cellulari in sospensione ma non per colture cellulari

aderenti

Le piastre per colture cellulari aderenti sono in polistirene ma

sono trattate per renderle idrofile e cariche negativamente.

In tal modo il polistirene lega stabilmente la fibronectina e la

vitronectina presenti nel siero che permettono l’adesione di

diversi tipi di cellule

E’ importante la dimensione della piastra per la densità di semina

Piastra da 5 cm di diametro Area di 20 cm2

Piastra da 9 cm di diametro Area di 60 cm2

Parametri critici per le colture cellulari

Temperatura

Le cellule possono sopportare l’ipotermia (sono conservate

congelate) ma la loro attività metabolica è notevolmente

disturbata.

Non possono sopportare l’ipertermia (Anche piccoli aumenti

di temperatura per brevi periodi possono far morire le cellule).

Una temperatura di 43°C per pochi minuti provoca la morte per

apoptosi

Due prove permettono di misurare l’influenza della

temperatura sullo sviluppo delle cellule:

- La valutazione dell’efficienza di un enzima mitocondriale.

10000 15000 200000

1

2

3

4

536 °C37 °C38 °C

n° cellule

Att

ivit

à m

eta

bo

lica

mit

oco

nd

rial

e

Attività metabolica a differentitemperature di incubazione

- La valutazione della quantità di proteine sintetizzate dalla

popolazione delle cellule.

34 35 36 37 38 39 40 41 420

100

200

300

Temperatura (°C)

sin

tesi

pro

teic

a (%

)

In un incubatore a CO2 il paramentro di temperatura è

direttamente collegato con l’umidità relativa (RH %)

L’energia fornita dall’incubatore serve sia a mantenere la

temperatura che ad evaporare l’acqua dall’apposito vassoio

per portare il livello di umidità relativa alla giusta percentuale.

Umidità relativa (RH %)

L’umidità relativa RH è un parametro che è portato ad un

livello elevato senza necessariamente essere controllato.

L’obiettivo è di limitare l’evaporazione dell’acqua contenuta

nei terreni di coltura per non provocare un aumento della

pressione osmotica.

La difficoltà maggiore consiste nel raggiungere un livello

molto elevato di RH nella camera (RH >98%) evitando la

condensazione sulle pareti o sugli oggetti contenuti

nell’incubatore. Le goccioline di condensazione

costituirebbero un ambiente ideale per la contaminazione e lo

sviluppo di organismi dispersi nell’aria che entrano durante

l’apertura dell’incubatore.

Il pH

E’ molto importante il sistema tampone che interviene

verso la fine del periodo di coltura e cioè quando il

metabolismo cellulare ha prodotto H+

E’ molto importante il sistema tampone che interviene

verso la fine del periodo di coltura e cioè quando il

metabolismo cellulare ha prodotto H+

CO2

La pressione parziale di CO2 usata nella coltura delle cellule

corrisponde alla pCO2 misurata all’interno dei tessuti (35-45

mmHg). In questo modo l’incubatore riproduce

rigorosamente le naturali condizioni di sviluppo delle cellule.

Prevenzione della contaminazione

Sono possibili differenti tipi di contaminazione

- contaminazione da microorganismi dispersi nell’aria

- contaminazione da biofilm

- contaminazione proveniente dal campione

- contaminazione incrociata