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Terapia Genica

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Terapia cellulare Allotrapianto: cellule provenienti da un donatore della stessa specie Autotrapianto: cellule provenienti dallo stesso paziente Xenotrapianto: cellule provenienti da animali di specie diverse

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Strategie terapeutiche genetico-molecolari Produzione di proteine normali in diversi sistemi di espressione (batteri, lieviti, cellule in coltura, animali geneticamente modificati). Produzione di anticorpi geneticamente modificati. Produzione di vaccini geneticamente modificati. Terapia genica.

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Insieme di procedimenti atti a a curare o ad alleviare una malattia modificando geneticamente le cellule dei pazienti. Pu essere in vivo o ex vivo Terapia genica

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Vantaggi teorici della terapia genica Correzione radicale dei difetti Possibilit di agire su meccanismi molecolari per i quali risulta estremamente difficile sviluppare farmaci specifici Vantaggi economici (se permanente eviterebbe la necessit di trattamenti ripetuti)

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Possibili limitazioni della terapia genica Mancanza di necessit per disponibilit di terapie alternative Mancanza di efficacia Grandi problemi tecnici Costi Effetti indesiderati (espressione non regolata, mutagenesi inserzionale, passaggio delle modifiche alla linea germinale)

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Attuali problemi tecnici della terapia genica Efficienza di trasferimento (vettori virali migliori di non virali) Selettivit del sistema di trasferimento Espressione instabile nel tempo Espressione non regolata Reazioni del sistema immunitario Problemi etici

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Malattia pericolosa per la vita, ma dagli effetti potenzialmente reversibili. Gene clonato. Disponibile sistema di trasferimento genico efficiente per le cellule affette, che garantisca espressione stabile nel tempo. Non richiesta regolazione precisa del gene in questione. Quando si pu pensare di curare una malattia con la terapia genica?

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Incremento della dose genica Strategie terapeutiche Efficace per le patologie caratterizzate da perdita di funzione totale o parziale di un gene (ad esempio patologie autosomiche recessive o autosomiche dominanti caratterizzate da aploinsufficienza)

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Correzione mirata della mutazione genica Strategie terapeutiche Necessaria per le patologie causate dalla presenza di un prodotto genico alterato, che agisce attraverso un meccanismo dominante o dominante-negativo. Efficace anche nel caso di una perdita di funzione.

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Inibizione mirata dellespressione genica Strategie terapeutiche Strategia utile per le patologie causate dalla presenza di mutazioni ad effetto dominante o dominante negativo.

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Inibizione mirata dellespressione genica Strategie terapeutiche RNAi

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RNA-interference RNAi Inibizione mirata dellespressione genica

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Ribozimi RNAi Inibizione mirata dellespressione genica

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Uccisione diretta di cellule patologiche Strategie terapeutiche

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Uccisione di cellule patologiche mediata dal sistema immunitario Strategie terapeutiche

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Come faccio entrare il DNA nelle cellule, e cosa gli succede quando entrato? Vettori viraliVettori non virali Integrazione casuale Integrazione sito-secifica

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Vantaggi dei vettori virali Alta efficienza di trasduzione Svantaggi dei vettori virali Possibilit di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus presenti nellospite Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma) Molecole di DNA di dimensioni limitate Reazioni immunitarie Costi elevati

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Vantaggi dei vettori non virali Impossibile la generazione di nuovi virus patogeni Riduzione del rischio di reazione immunitaria Possono trasferire molti tipi diversi di molecole, e permettono di trasdurre molecole di DNA anche molto grandi Bassi costi di produzione Possibilit di produzione in grandi quantit Svantaggi dei vettori non virali Scarsa efficienza Se si usano molecole di DNA a doppio filamento anche questi vettori ossono dare mutagenesi inserzionale

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Vettori non virali Liposomi

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Vettori non virali Endocitosi mediata da recettore

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Vettori non virali Elettroporazione e altri metodi fisici (shotgun)

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Cosa si pu far entrare nelle cellule con vettori non virali Plasmidi Molecole di DNA a doppio filamento lineari Oligonucleotidi DNA Oligonucleotidi RNA (varie modificazioni chimiche, come i gruppi morfolino) Ribozimi Polipeptidi

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Vettori virali In tutti i casi si tratta di virus difettivi, che possono essere prodotti solo grazie a particolari linee cellulari capaci di complementare i difetti del virus. In ogni caso la loro preparazione deve seguire queste fasi obbligate: 1.Costruzione del genoma ricombinante 2.Trasfezione del DNA nella linea cellulare capace di produrre le particelle virali 3.Raccolta e analisi del virus 4.Trattamento del paziente

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Vettori virali: caratteristiche principali Retrovirus : possono infettare solo di cellule in divisione e si integrano stabilmente in maniera casuale. Lentivirus : derivati del virus dell'HIV, possono infettare cellule quiescenti e si integrano stabilmente in maniera casuale. Adenovirus: esprimono ad alti livelli, non si integrano stabilmente e danno grosse reazioni immunitarie. Virus adeno-associati (AAV): integrazione sito specifica ed espressione stabile nel tempo, difficile produrli ad alto titolo. Herpes simplex: infezione molto selettiva dei neuroni, ma importanti effetti citotossici.

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Retrovirus Enveloped virus RNA genome (2 copies) dsDNA enters into the nucleus and integrates upon mitosis Enters the cell by fusion LTR: viral transcription, polyad., replication, integration

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ADA LTR Psi - GagPolEnv LTR GagPolEnv LTR Psi + encapsidation cell line plasmid transfection ecotropic-MoMulv amphotropic Vettori retrovirali

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Trial clinico per deficit ADA

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Retrovirus Trial on 2 ADA patients. Started 1990. 2 years treatment. Results published in 1995 Science, Blaese et al

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Retrovirus Ex-vivo Retrovirus-med. gene therapy: SCIDXI trial 1998, A. Fisher France Recessive disease X linked Defect in the c gene, receptor for cytokines => block in T and NK differentiation Ex-vivo gene therapy on CD34+cells: MuLV- c 20x106 cells/Kg

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Retrovirus A. PCR: detection of c DNA B: RT PCR Detection of c RNA Lymphocyte subsets protein expression

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Retrovirus Genoma di RNA singolo filamento. Possono infettare solo cellule proliferanti Integrazione casuale nel genoma. Difficle produrli in grandi quantit (titolo elevato). Successo della terapia dipendente dalla trasduzione delle stem cells. Poco immunogeni. Lespressione pu andare incontro ad attenuazione nonostante la persistenza del virus nel genoma. In assoluto sono vettori pi utilizzati per la terapia genica.

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Oncoretrovirus Mitosis- dependent X ? Lentivirus (HIV-1) Nuclear transport dependent Int (MA, Vpr) cPPT-DNA flap Come infettare le cellule post-mitotiche?

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Lentivirus (HIV) Genoma complesso: geni strutturali gag pol env geni regolatori tat rev geni accessori nef vpr vpu vif Tropismo per linfociti e macrofagi Infezione persistente / malattia cronica progressiva

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Lentivirus Particelle virali ibride difettive per la replicazionecostituite da: Un set minimo di proteine del core derivate da HIV-1 Il pericapside di un virus non correlato (VSV or MLV) Un genoma contenente: una cassetta di espressione per il transgene affiancata da sequenze cis-regolatorie di HIV-1 non sono presenti geni virali

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Lentivirus: costruzione PROMOTER GA RRE PROMOTORE RREGA SDSA RSV GFP cPPT TRANSGENE Costrutto di trasferimento GAG PROPOL RRE TAT REV SD polyA CMV Costrutto dincapsidazione sequenze attive in cis sequenze attive in trans Provirus HIV-1 GAG PRO POL RRE TAT REV VIF U R ENV NEF SD LTR

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Vettore lentivirale di ultima generazione Costrutto codificante il pericapside VSV-G SDSA polyA CMV Costrutto di trasferimento SIN (Self-inactivating) PROMOTER GFP eGFP GA RRE hPGK RREGA SDSA RSV cPPT Wpre Costrutti dincapsidazione REV polyA RSV SDSA GAG PRO POL RRE polyA CMV

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Produzione del vettore Concentrazione per ultracentrifugazione Costrutto di incapsidazione GAG PROPOL RRE SD polyA SA CMV TAT REV Envelope VSV-G SDSA polyA CMV Costrutto di trasferimento PROMOTER eGFP GA RRE hPGK RREGA SDSA RSV cPPT Wpre Cellule HeLa Titolazione per diluizioni seriali Trasfezione transiente Cellule 293T Raccolta a 24 e 48 ore

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GFP expression 3 months after injection Lentivirus

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Control ALB promoter CMV promoter

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Lentivirus Genoma ad RNA. A differenza degli altri retrovirus possono infettare cellule proliferanti e post-mitotiche. Integrazione casuale (mutagenesi inserzionale) Scarsissime reazioni immunologiche. Elevata efficienza di trasduzione. Ottime prospettive per la terapia genica in vivo.

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Adenovirus

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ITR 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ITR E1 Late genes (L1-L5) E3 VA MLP IVa2 E2 E4 3.6 kb E1 mediated regulation E4 mediated regulation E2 mediated regulation (E2F.RE) 2

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Vettori adenovirali ITR 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ITR Late genes (L1-L5) VA E2 E4 3.6 kb Transgene E3 E3 E1 E1 ITR E1 293 cells MLP

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Vettori adenovirali Sviluppo di nuove generazioni di vettori allo scopo di riudrre immunogenicit e aumentare le dimensioni degli inserti.

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Adenovirus Genoma di DNA doppio filamento. Possono infettare cellule proliferanti e post-mitotiche. Non si integrano, ma vengono mantenuti in forma episomica. Pertanto non determinano mutagenesi inserzionale, ma sono necessari trattamenti ripetuti. Relativamente facile produrli in grandi quantit (titolo elevato). Forti reazioni immunologiche.

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Ciclo vitale degli AAV Integrazione sito-specifica Fase latente Ad Fase litica Replicazione Ad

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Cap ITR Rep DNA replicationCapsid proteins VP1, VP2, VP3 Integration Packaging Rescue AAV

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AAV, preparazione

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AAV, infezione di neuroni

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Vettori adeno-associati (AAV) Genoma di DNA singolo filamento. Virus difettivo che richiede per la produzione la contemporanea presenza di un adenovirus. Possono infettare cellule proliferanti e post- mitotiche. Facile produrli in grandi quantit Integrazione sito specifica in un unico locus innocuo (Cr.19), quindi assenza di mutagenesi inserzionale. Espressione stabile nel tempo. Inserti di dimensioni limitate. Efficienza di trasduzione variabile. Poco efficace se purificato bene.

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Herpes Simplex Virus (HSV) (ds DNA 152Kb, >70 genes) genome Latency transcripts Latency promoter

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Herpes Simplex Virus (HSV) Genoma di DNA doppio filamento molto grande (152 kb) e complesso (>70 geni). Spiccato neurotropismo. Nelle cellule infettate in forma episomica in uno stato latente. Possibile inserire geni molto grandi. Forti reazioni immunologiche. Presenza di anticorpi contro il virus in unelevata percentuale di casi.

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Potenzialit di combinazione tra terapia genica e purificazione cellule staminali

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Perch qualcuno sta pensando seriamente alla clonazione umana? Il problema principale della terapia cellulare listocompatibilit>rigetto La clonazione permetterebbe di ottenere cellule staminali totipotenti dotate delle stesse caratteristiche antigeniche del paziente, da usare per il trapianto dopo la correzione del difetto.

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Perch qualcuno sta pensando seriamente alla clonazione umana? Cellule somatiche paziente Ovocita Terapia genica Cellula somatica normale Cellule totipotenti sane istocompatibili

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Terapia genica del cancro: potenziamento della risposta immune

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Terapia genica del cancro: sensibilizzazione cellule tumorali a farmaci TK

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Vectors for gene therapy according to www.wiley.co.uk/genetherapy (june 1999) retrovirus liposome adenovirus retro prd cl vaccinia naked DNA others Retro Adeno Lipo