Terapia cellulare Allotrapianto: cellule provenienti da un
donatore della stessa specie Autotrapianto: cellule provenienti
dallo stesso paziente Xenotrapianto: cellule provenienti da animali
di specie diverse
Slide 3
Strategie terapeutiche genetico-molecolari Produzione di
proteine normali in diversi sistemi di espressione (batteri,
lieviti, cellule in coltura, animali geneticamente modificati).
Produzione di anticorpi geneticamente modificati. Produzione di
vaccini geneticamente modificati. Terapia genica.
Slide 4
Insieme di procedimenti atti a a curare o ad alleviare una
malattia modificando geneticamente le cellule dei pazienti. Pu
essere in vivo o ex vivo Terapia genica
Slide 5
Vantaggi teorici della terapia genica Correzione radicale dei
difetti Possibilit di agire su meccanismi molecolari per i quali
risulta estremamente difficile sviluppare farmaci specifici
Vantaggi economici (se permanente eviterebbe la necessit di
trattamenti ripetuti)
Slide 6
Possibili limitazioni della terapia genica Mancanza di necessit
per disponibilit di terapie alternative Mancanza di efficacia
Grandi problemi tecnici Costi Effetti indesiderati (espressione non
regolata, mutagenesi inserzionale, passaggio delle modifiche alla
linea germinale)
Slide 7
Attuali problemi tecnici della terapia genica Efficienza di
trasferimento (vettori virali migliori di non virali) Selettivit
del sistema di trasferimento Espressione instabile nel tempo
Espressione non regolata Reazioni del sistema immunitario Problemi
etici
Slide 8
Malattia pericolosa per la vita, ma dagli effetti
potenzialmente reversibili. Gene clonato. Disponibile sistema di
trasferimento genico efficiente per le cellule affette, che
garantisca espressione stabile nel tempo. Non richiesta regolazione
precisa del gene in questione. Quando si pu pensare di curare una
malattia con la terapia genica?
Slide 9
Incremento della dose genica Strategie terapeutiche Efficace
per le patologie caratterizzate da perdita di funzione totale o
parziale di un gene (ad esempio patologie autosomiche recessive o
autosomiche dominanti caratterizzate da aploinsufficienza)
Slide 10
Correzione mirata della mutazione genica Strategie terapeutiche
Necessaria per le patologie causate dalla presenza di un prodotto
genico alterato, che agisce attraverso un meccanismo dominante o
dominante-negativo. Efficace anche nel caso di una perdita di
funzione.
Slide 11
Inibizione mirata dellespressione genica Strategie terapeutiche
Strategia utile per le patologie causate dalla presenza di
mutazioni ad effetto dominante o dominante negativo.
Uccisione diretta di cellule patologiche Strategie
terapeutiche
Slide 16
Uccisione di cellule patologiche mediata dal sistema
immunitario Strategie terapeutiche
Slide 17
Come faccio entrare il DNA nelle cellule, e cosa gli succede
quando entrato? Vettori viraliVettori non virali Integrazione
casuale Integrazione sito-secifica
Slide 18
Vantaggi dei vettori virali Alta efficienza di trasduzione
Svantaggi dei vettori virali Possibilit di generare nuovi virus
patogeni per ricombinazione con eventuali virus presenti nellospite
Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera
casuale nel genoma) Molecole di DNA di dimensioni limitate Reazioni
immunitarie Costi elevati
Slide 19
Vantaggi dei vettori non virali Impossibile la generazione di
nuovi virus patogeni Riduzione del rischio di reazione immunitaria
Possono trasferire molti tipi diversi di molecole, e permettono di
trasdurre molecole di DNA anche molto grandi Bassi costi di
produzione Possibilit di produzione in grandi quantit Svantaggi dei
vettori non virali Scarsa efficienza Se si usano molecole di DNA a
doppio filamento anche questi vettori ossono dare mutagenesi
inserzionale
Slide 20
Vettori non virali Liposomi
Slide 21
Vettori non virali Endocitosi mediata da recettore
Slide 22
Vettori non virali Elettroporazione e altri metodi fisici
(shotgun)
Slide 23
Cosa si pu far entrare nelle cellule con vettori non virali
Plasmidi Molecole di DNA a doppio filamento lineari Oligonucleotidi
DNA Oligonucleotidi RNA (varie modificazioni chimiche, come i
gruppi morfolino) Ribozimi Polipeptidi
Slide 24
Vettori virali In tutti i casi si tratta di virus difettivi,
che possono essere prodotti solo grazie a particolari linee
cellulari capaci di complementare i difetti del virus. In ogni caso
la loro preparazione deve seguire queste fasi obbligate:
1.Costruzione del genoma ricombinante 2.Trasfezione del DNA nella
linea cellulare capace di produrre le particelle virali 3.Raccolta
e analisi del virus 4.Trattamento del paziente
Slide 25
Vettori virali: caratteristiche principali Retrovirus : possono
infettare solo di cellule in divisione e si integrano stabilmente
in maniera casuale. Lentivirus : derivati del virus dell'HIV,
possono infettare cellule quiescenti e si integrano stabilmente in
maniera casuale. Adenovirus: esprimono ad alti livelli, non si
integrano stabilmente e danno grosse reazioni immunitarie. Virus
adeno-associati (AAV): integrazione sito specifica ed espressione
stabile nel tempo, difficile produrli ad alto titolo. Herpes
simplex: infezione molto selettiva dei neuroni, ma importanti
effetti citotossici.
Slide 26
Retrovirus Enveloped virus RNA genome (2 copies) dsDNA enters
into the nucleus and integrates upon mitosis Enters the cell by
fusion LTR: viral transcription, polyad., replication,
integration
Slide 27
ADA LTR Psi - GagPolEnv LTR GagPolEnv LTR Psi + encapsidation
cell line plasmid transfection ecotropic-MoMulv amphotropic Vettori
retrovirali
Slide 28
Trial clinico per deficit ADA
Slide 29
Retrovirus Trial on 2 ADA patients. Started 1990. 2 years
treatment. Results published in 1995 Science, Blaese et al
Slide 30
Retrovirus Ex-vivo Retrovirus-med. gene therapy: SCIDXI trial
1998, A. Fisher France Recessive disease X linked Defect in the c
gene, receptor for cytokines => block in T and NK
differentiation Ex-vivo gene therapy on CD34+cells: MuLV- c 20x106
cells/Kg
Slide 31
Retrovirus A. PCR: detection of c DNA B: RT PCR Detection of c
RNA Lymphocyte subsets protein expression
Slide 32
Retrovirus Genoma di RNA singolo filamento. Possono infettare
solo cellule proliferanti Integrazione casuale nel genoma. Difficle
produrli in grandi quantit (titolo elevato). Successo della terapia
dipendente dalla trasduzione delle stem cells. Poco immunogeni.
Lespressione pu andare incontro ad attenuazione nonostante la
persistenza del virus nel genoma. In assoluto sono vettori pi
utilizzati per la terapia genica.
Slide 33
Oncoretrovirus Mitosis- dependent X ? Lentivirus (HIV-1)
Nuclear transport dependent Int (MA, Vpr) cPPT-DNA flap Come
infettare le cellule post-mitotiche?
Slide 34
Lentivirus (HIV) Genoma complesso: geni strutturali gag pol env
geni regolatori tat rev geni accessori nef vpr vpu vif Tropismo per
linfociti e macrofagi Infezione persistente / malattia cronica
progressiva
Slide 35
Lentivirus Particelle virali ibride difettive per la
replicazionecostituite da: Un set minimo di proteine del core
derivate da HIV-1 Il pericapside di un virus non correlato (VSV or
MLV) Un genoma contenente: una cassetta di espressione per il
transgene affiancata da sequenze cis-regolatorie di HIV-1 non sono
presenti geni virali
Slide 36
Lentivirus: costruzione PROMOTER GA RRE PROMOTORE RREGA SDSA
RSV GFP cPPT TRANSGENE Costrutto di trasferimento GAG PROPOL RRE
TAT REV SD polyA CMV Costrutto dincapsidazione sequenze attive in
cis sequenze attive in trans Provirus HIV-1 GAG PRO POL RRE TAT REV
VIF U R ENV NEF SD LTR
Slide 37
Vettore lentivirale di ultima generazione Costrutto codificante
il pericapside VSV-G SDSA polyA CMV Costrutto di trasferimento SIN
(Self-inactivating) PROMOTER GFP eGFP GA RRE hPGK RREGA SDSA RSV
cPPT Wpre Costrutti dincapsidazione REV polyA RSV SDSA GAG PRO POL
RRE polyA CMV
Slide 38
Produzione del vettore Concentrazione per ultracentrifugazione
Costrutto di incapsidazione GAG PROPOL RRE SD polyA SA CMV TAT REV
Envelope VSV-G SDSA polyA CMV Costrutto di trasferimento PROMOTER
eGFP GA RRE hPGK RREGA SDSA RSV cPPT Wpre Cellule HeLa Titolazione
per diluizioni seriali Trasfezione transiente Cellule 293T Raccolta
a 24 e 48 ore
Slide 39
GFP expression 3 months after injection Lentivirus
Slide 40
Control ALB promoter CMV promoter
Slide 41
Lentivirus Genoma ad RNA. A differenza degli altri retrovirus
possono infettare cellule proliferanti e post-mitotiche.
Integrazione casuale (mutagenesi inserzionale) Scarsissime reazioni
immunologiche. Elevata efficienza di trasduzione. Ottime
prospettive per la terapia genica in vivo.
Vettori adenovirali Sviluppo di nuove generazioni di vettori
allo scopo di riudrre immunogenicit e aumentare le dimensioni degli
inserti.
Slide 47
Adenovirus Genoma di DNA doppio filamento. Possono infettare
cellule proliferanti e post-mitotiche. Non si integrano, ma vengono
mantenuti in forma episomica. Pertanto non determinano mutagenesi
inserzionale, ma sono necessari trattamenti ripetuti. Relativamente
facile produrli in grandi quantit (titolo elevato). Forti reazioni
immunologiche.
Slide 48
Ciclo vitale degli AAV Integrazione sito-specifica Fase latente
Ad Fase litica Replicazione Ad
Slide 49
Cap ITR Rep DNA replicationCapsid proteins VP1, VP2, VP3
Integration Packaging Rescue AAV
Slide 50
AAV, preparazione
Slide 51
AAV, infezione di neuroni
Slide 52
Vettori adeno-associati (AAV) Genoma di DNA singolo filamento.
Virus difettivo che richiede per la produzione la contemporanea
presenza di un adenovirus. Possono infettare cellule proliferanti e
post- mitotiche. Facile produrli in grandi quantit Integrazione
sito specifica in un unico locus innocuo (Cr.19), quindi assenza di
mutagenesi inserzionale. Espressione stabile nel tempo. Inserti di
dimensioni limitate. Efficienza di trasduzione variabile. Poco
efficace se purificato bene.
Herpes Simplex Virus (HSV) Genoma di DNA doppio filamento molto
grande (152 kb) e complesso (>70 geni). Spiccato neurotropismo.
Nelle cellule infettate in forma episomica in uno stato latente.
Possibile inserire geni molto grandi. Forti reazioni immunologiche.
Presenza di anticorpi contro il virus in unelevata percentuale di
casi.
Slide 55
Potenzialit di combinazione tra terapia genica e purificazione
cellule staminali
Slide 56
Perch qualcuno sta pensando seriamente alla clonazione umana?
Il problema principale della terapia cellulare
listocompatibilit>rigetto La clonazione permetterebbe di
ottenere cellule staminali totipotenti dotate delle stesse
caratteristiche antigeniche del paziente, da usare per il trapianto
dopo la correzione del difetto.