TERAPIA GENICA Trasferimento di geni esogeni in cellule somatiche di un paziente per correggere un...
-
Upload
calogero-bassi -
Category
Documents
-
view
213 -
download
0
Transcript of TERAPIA GENICA Trasferimento di geni esogeni in cellule somatiche di un paziente per correggere un...
TERAPIA GENICA
Trasferimento di geni esogeni in cellule somatiche di un paziente per correggere un difetto genetico ereditato o acquisito o per introdurre nuove funzioni o proprietà.
TERAPIA GENICA
Speculazioni sulla possibilità di effettuare una terapia genica sono degli anni ’60
Primo trial clinico approvato in USA nel 1989. Primo trial clinico in Italia per la correzione del deficit di adenosina deaminasi (14 settembre 1992)
al 2001: 596 clinical trials di terapia genica (3464 pazienti)
al 2007: circa 650 clinical trials di terapia genica (problemi inefficacia, tossicità)
1) Understanding of the disease process
2) Structure/function of gene to be introduced
3) Animal model and assessment of function
4) Efficient delivery of gene
5) Control of gene expression
6) Prevention/control of immune responses
7) Clinical trial
What is required for Gene Therapy to be possible?
What is required for Gene Therapy to be possible?
TERAPIA GENICA-applicazioniMalattie ereditarie (es. distrofia muscolare, fibrosi cistica) per far esprimere la proteina mancanteMalattie neoplastiche in cui i geni introdotti possono contribuire a distruggere le cellule neoplasticheAlterazioni del sistema immunitario per modificare la risposta immuneMalattie infettive per potenziare i meccanismi di difesa
Gene Transfer: getting genes into
cells
Gene Transfer: getting genes into
cellsTwo main routes:
In vivo: i.v. or i.m. injectable; or non-invasive (eg “sniffable”)
Ex vivo: hepatocytes, skin fibroblastshaematopoietic cells
Gene delivery approaches
Gene delivery approaches
• Physical methods
• Non-viral vectors
• Viral vectors
Physical methodsPhysical methods
Injection of naked DNA
Electroporation in vivo or ex vivo
Ballistic technology – the “gene gun”
Effect of Electric Field on Cell Membrane
cells obtained from
skin biopsy
gene introduced
into cells byelectroporation
genetically engineered
cells are propagated
cells are reinjected
Ex vivo electroporation
Gene Gun
Metodi fisici
• Nessuna limitazione per numero e dimensione del gene
• Scarsamente efficiente se non per certi tipi cellulari
• Reazioni immunitarie per DNA batterico
• Solo per tessuti superficiali
Vantaggi Svantaggi
Strategie per migliorare l’efficienza:
associazione del DNA a polimeri cationici (pol. lineari, es. poli-lisine; pol.ramificati, es. polietilenimine o PEI; pol. sferoidali, es. poliamidoamine)
Metodi fisici
Vettori non virali -Liposomi
–Vescicole sferiche costituite da un doppio strato fosfolipidico
idrofilico
idrofobico
liposome
nucleus
DNA
endocytosis
complex
membrane fusion
Liposome-mediated Gene Transfer
Liposomi
• Nessuna limitazione per numero e dimensione del gene
• Facili da produrre• Scarsa tossicità (?)
• Efficienza modesta
• Espressione a breve termine
Vantaggi Svantaggi
TERAPIA GENICA
Caratteristiche ideali di un vettore per terapia genica:
produzione ad elevate concentrazioni con metodo facile e riproducibile; transgene regolato dai suoi elementi di regolazione;
abilità di raggiungere specifici tipi cellulari;mancata stimolazione di risposta immunitaria da parte dell’ospite
TERAPIA GENICA
Integrazione del transgeneVantaggi:perpetuo; può consentire un’espressione stabile ed una cura.Svantaggi:un’inserzione random può rendere silente il transgene o disregolare geni dell’ospiteeffetti a lungo termine (?)
TERAPIA GENICA
Transgene episomaleVantaggi:assenza di mutagenesi inserzionale o effetti a lungo termine.Svantaggi (?):espressione transiente;necessità di trattamenti ripetuti
Vettori viraliQuelli utilizzati per terapia genica sono modificati affinchè possano infettare cellule di mammifero, ma non siano in grado di replicarsi.Retrovirus
AdenovirusLentivirusAdeno-associated virusHerpes simplex virus
Therapeutic gene
Vector DNA
Helper DNA
Engineering a Virus into a VectorEngineering a Virus into a Vector
wildtype virus
Viral vectorBased on Kay et al 2001
replicationproteins
replicationproteins
structuralproteins
Packaging
essential viral genes
Packaging cell
RETROVIRUS
RNA virus di circa 10 kb con conversione di RNA a DNA mediante una trascrittasi inversa
Vettori principalmente utilizzati sono derivati dal virus Moloney della leucemia murina.transgene si integra stabilmente in cellule in mitosiinattivato dal complemento
Potenziale tossicità:
generazione di virus replicazione-competenti (per ricombinazione in fase di produzione o nell’ospite)
mutagenesi inserzionale (tumori?)
RETROVIRUS
Vettori retrovirali descritti per la prima volta nel ’96Basati sul virus HIV-1
LENTIVIRUS
Possono transdurre anche cellule non in divisionePotenziale tossicità:Simile a retrovirus con l’aggravante che si tratta di un patogeno per l’uomo (studio di lentivirus felini o equini)
DNA virus di circa 36 kb causano infezioni benigne del tratto respiratorio;
ADENOVIRUS
infettano cellule in divisione e non;facili da produrre in grande quantità;ospitano geni di grandi dimensioni;entrano nelle cellule mediante endocitosi;trasgene episomale;
Effetti sfavorevoli:
Espressione a breve termine Reazioni infiammatorieRisposta immune dell’ospite:
cellulare (prod. di linfociti T contro le cellule infettate)umorale (prod. di anticorpi che preclude altri trattamenti)
Tossicità acuta
ADENOVIRUS
Infettano cellule in divisione e nonPuò ospitare transgeni non superiori a 4.5 kbIntegrazione del transgeneInserzione sito-specifica nel cromosoma 19 (?)
ADENO-ASSOCIATED VIRUS
DNA virus non patogeni che richiedono adenovirus o herpesvirus per replicare
FIBROSI CISTICACFTR
Malattia a carattere autosomico recessivo causata da mutazioni della proteina transmembrana CFTR coinvolta nel trasporto degli ioni Cloro nelle cellule epiteliali di vari organi.
Alterazione di CFTR causa accumulo di muco denso e viscoso nei polmoni e alterazioni funzionali in fegato, pancreas, organi riproduttoriTerapia sintomatica.
CFTR -terapia genicaNecessità di intervenire in vivo
Risultati sperimentali:
Topo KO (patologia polmonare modesta)instillazione tracheale di liposoma-CFTR: promettente
Tossicità vettori virali testata su diverse specie animali risultato variabile
Studi clinici (instillazioni tracheali o spray nasale):Liposoma -CFTR: bassa efficienza di trasfezione e di breve durataAdenovirus-CFTR: prima generazione problemi infiammatori e reazioni anticorpali; scarsa efficacia; seconda generazione meglio tollerati, scarsa e breve espressioneAAV-CFTR: ben tollerato, ma espressione brevePEG-poliK-DNA: nessuna tossicità, effetto per 6 giorniPotenziali sviluppi futuri: cellule staminali eterologhe o modificate geneticamente
CFTR -terapia genica
ADA deficiency
Malattia a carattere autosomico recessivo causata da deficit o alterata funzionalità dell’enzima Adenosina deaminasi, coinvolto nel metabolismo delle purine.Conseguenze: accumulo di dATP, dADP, dAMP; blocco produzione linfociti T, NK, B; difetti scheletrici, disturbi comportamentali, alterazioni rene-fegato. Patologia letale per grave immunodeficienza.
ADA deficiency
Possibilità terapeutiche:
Trapianto di midollo
Terapia sostitutiva: PEG-ADA bovino i.m. 1-2/sett.;
problemi compliance, non-responders (15-20%)
Terapia genica ex-vivo
Terapia genica - ADA deficiency
In linfociti T periferici:
risultati soddisfacenti ottenuti con sospensione di PEG-ADA
vantaggi: fattibilità e sicurezza; linfociti T ingegnerizzati vivono a lungo; limiti: ripristino funzionalità confinata ai linfociti T; necessità di infusioni ripetute.
Terapia genica - ADA deficiencyIn cellule staminali del midollo osseo: Protocollo-Studio effettuato in due bambini di 6 mesi e 30 mesi Sospensione PEG-ADA. Cellule prelevate dal midollo osseo e infettate con vettore retroviraleModerata mieloablazione con Busulfan (2mg/kg/die per 2 gg) due e tre giorni prima del reimpianto
Risultati a 360 giorni:Ripristino linfociti B, T, NK e crollo livelli metaboliti purinici nel paziente più giovane. Buoni risultati solo a carico di linfociti T e NK nel secondo paziente.
SCID-X1(severe combined immunodeficiency disease)
Malattia ereditaria legata al cromosoma X
Grave immunodeficienza caratterizzata dalla mancata maturazione dei linfociti T e NK
Terapia genica ex-vivo con vettori retrovirali in cellule staminali ematopoietiche. Dopo tre anni, sviluppo di leucemia dei linfociti T in due bambini (mutagenesi inserzionale al locus LMO-2, cromosoma 11)Ad oggi 4 casi documentati
OLIGONUCLEOTIDI ANTISENSO
Struttura modificata per aumentare laresistenza alle nucleasi:
oligonucleotidi fosforotioati(stabilità in vitro, buona emivita)
OLIGONUCLEOTIDI ANTISENSO
Problematiche:SpecificitàLegame a fattori di crescita e loro recettori (es. PDGF, VEGF, EGFR)Tossicità pre-clinica : nei roditori immunostimolazione e degenerazione tubulare renale e epatica (alte dosi);nelle scimmie inibizione cascata della coagulazione, attivazione cascata del complemento
OLIGONUCLEOTIDI ANTISENSO:applicazioni
Vitravene (Fomivirsen) - Novartis - Primo oligonucleotide antisenso approvato in terapia (FDA,1998). Distributo in USA, Europa, BrasileIndicazioni terapeutiche: trattamento locale di retinite da CMV in soggetti con AIDSBersaglio: sequenza di mRNA della regione IE2 del CMV essenziale per infettività Tossicità: infiammmazione, aumento di pressione intraoculare, danni alla retina
APTAMERI
PEGAPTANIB - Macugen® (Eyetech Pharm./Pfizer)
RNA aptamero diretto contro il vascular endotelial growth factor (VEGF)-165, isoforma responsabile di neovascolarizzazione oculare patologica e permeabilità vascolare;Indicazione terapeutica: degenerazione maculare associata all’età
PEGAPTANIB struttura e sede di
legame
Purine 2’-O-metilate
Pirimidine 2’-fluorurateHeparin-binding domain VEGF
APTAMERI
• Selettività
• Scarsa tossicità (?)
• Disponibiltà di “antidoti”
• Alternativa all’uso di
anticorpi (?)
Potenziali applicazioni: infezioni, cancro, patologie cardiovascolari