Terapia Genica

Terapia cellulare

• Allotrapianto: cellule provenienti da un donatore della stessa specie

• Autotrapianto: cellule provenienti dallo stesso paziente

• Xenotrapianto: cellule provenienti da animali di specie diverse

Strategie terapeutiche genetico-molecolari

• Produzione di proteine normali in diversi sistemi di espressione (batteri, lieviti, cellule in coltura, animali geneticamente modificati).• Produzione di anticorpi geneticamente modificati.• Produzione di vaccini geneticamente modificati.• Terapia genica.

Insieme di procedimenti atti a a curare o ad alleviare una malattia modificando geneticamente le cellule dei pazienti.

Può essere in vivo o ex vivo

Terapia genica

Vantaggi teorici della terapia genica

• Correzione radicale dei difetti• Possibilità di agire su meccanismi molecolari per i quali risulta estremamente difficile sviluppare farmaci specifici• Vantaggi economici (se è permanente eviterebbe la necessità di trattamenti ripetuti)

Possibili limitazioni della terapia genica

• Mancanza di necessità per disponibilità di terapie alternative • Mancanza di efficacia• Grandi problemi tecnici • Costi• Effetti indesiderati (espressione non regolata, mutagenesi inserzionale, passaggio delle modifiche alla linea germinale)

Attuali problemi tecnici della terapia genica

• Efficienza di trasferimento (vettori virali migliori di non virali) • Selettività del sistema di trasferimento • Espressione instabile nel tempo• Espressione non regolata • Reazioni del sistema immunitario• Problemi etici

• Malattia pericolosa per la vita, ma dagli effetti potenzialmente reversibili.

• Gene clonato.• Disponibile sistema di trasferimento

genico efficiente per le cellule affette, che garantisca espressione stabile nel tempo.

• Non richiesta regolazione precisa del gene in questione.

Quando si può pensare di curare una malattia con la terapia genica?

Incremento della dose genica

Strategie terapeutiche

Efficace per le patologie caratterizzate da perdita di funzione totale o parziale di un gene (ad esempio patologie autosomiche recessive o

autosomiche dominanti caratterizzate da aploinsufficienza)

Correzione mirata della mutazione genica


Necessaria per le patologie causate dalla presenza di un prodotto genico alterato, che

agisce attraverso un meccanismo dominante o dominante-negativo. Efficace anche nel caso di

una perdita di funzione.

Inibizione mirata dell’espressione genica


Strategia utile per le patologie causate dalla presenza di mutazioni ad effetto dominante o

dominante negativo.



RNAi

RNA-interference

RNAi


Ribozimi

RNAi


Uccisione diretta di cellule patologiche


Uccisione di cellule patologiche mediata dal sistema immunitario


Come faccio entrare il DNA nelle cellule, e cosa gli succede quando è

entrato?

Vettori viraliVettori non virali

Integrazione casuale

Integrazione sito-secifica

Vantaggi dei vettori virali

• Alta efficienza di trasduzione

Svantaggi dei vettori virali

• Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus presenti nell’ospite

• Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma)

• Molecole di DNA di dimensioni limitate• Reazioni immunitarie• Costi elevati

Vantaggi dei vettori non virali

• Impossibile la generazione di nuovi virus patogeni

• Riduzione del rischio di reazione immunitaria• Possono trasferire molti tipi diversi di

molecole, e permettono di trasdurre molecole di DNA anche molto grandi

• Bassi costi di produzione• Possibilità di produzione in grandi quantità

Svantaggi dei vettori non virali

• Scarsa efficienza• Se si usano molecole di DNA a doppio

filamento anche questi vettori ossono dare mutagenesi inserzionale

Vettori non virali

Liposomi

Vettori non virali

Endocitosi mediata da recettore

Vettori non virali

Elettroporazione e altri metodi fisici (shotgun)

Cosa si può far entrare nelle cellule con vettori non virali

• Plasmidi• Molecole di DNA a doppio filamento lineari• Oligonucleotidi DNA• Oligonucleotidi RNA (varie modificazioni

chimiche, come i gruppi morfolino)• Ribozimi• Polipeptidi

Vettori virali

In tutti i casi si tratta di virus difettivi, che possono essere prodotti solo grazie a particolari linee cellulari capaci di complementare i difetti del virus. In ogni caso la loro preparazione deve seguire queste fasi obbligate:

1.Costruzione del genoma ricombinante2.Trasfezione del DNA nella linea cellulare capace di produrre le particelle virali3.Raccolta e analisi del virus 4.Trattamento del paziente

Vettori virali: caratteristiche principali

•Retrovirus : possono infettare solo di cellule in divisione e si integrano stabilmente in maniera casuale.•Lentivirus : derivati del virus dell'HIV, possono infettare cellule quiescenti e si integrano stabilmente in maniera casuale.•Adenovirus: esprimono ad alti livelli, non si integrano stabilmente e danno grosse reazioni immunitarie. •Virus adeno-associati (AAV): integrazione sito specifica ed espressione stabile nel tempo, difficile produrli ad alto titolo.•Herpes simplex: infezione molto selettiva dei neuroni, ma importanti effetti citotossici.

Retrovirus

•Enveloped virus•RNA genome (2 copies)•dsDNA enters into the nucleus and integrates upon mitosis•Enters the cell by fusion•LTR: viral transcription, polyad., replication, integration

ADAADALTR

Psi -

Psi -

Gag Pol Env

LTR

Gag Pol Env

LTR

Psi +

encapsidation cell line

plasmid transfection

ecotropic-MoMulv

amphotropic

Vettori retrovirali

Trial clinico per deficit ADA

Retrovirus

Trial on 2 ADA patients. Started 1990. 2 years treatment.

Results published in 1995 Science, Blaese et al

Retrovirus

Ex-vivo Retrovirus-med. gene therapy:

SCIDXI trial 1998, A. Fisher France

• Recessive disease• X linked• Defect in the c gene, receptor for

cytokines => block in T and NK differentiation

• Ex-vivo gene therapy on CD34+cells: MuLV- c 20x106 cells/Kg

Retrovirus

A. PCR:detection of c DNA

B: RT PCRDetection of c RNA

Lymphocyte subsets

protein expression

Retrovirus

• Genoma di RNA singolo filamento.• Possono infettare solo cellule proliferanti• Integrazione casuale nel genoma.• Difficle produrli in grandi quantità (titolo elevato).• Successo della terapia dipendente dalla trasduzione delle stem cells.• Poco immunogeni.• L’espressione può andare incontro ad attenuazione nonostante la persistenza del virus nel genoma.• In assoluto sono vettori più utilizzati per la terapia genica.

Oncoretrovirus

Mitosis-dependent

X

?

Lentivirus(HIV-1)

Nuclear transportdependent• Int (MA, Vpr)• cPPT-DNA flap

Come infettare le cellule post-mitotiche?

Lentivirus (HIV)

• Genoma complesso:– geni strutturali gag pol env– geni regolatori tat rev– geni accessori nef vpr vpu vif

• Tropismo per linfociti e macrofagi

• Infezione persistente / malattia cronica progressiva

Lentivirus

• Particelle virali ibride difettive per la replicazionecostituite da:– Un set minimo di proteine del core derivate

da HIV-1– Il pericapside di un virus non correlato

(VSV or MLV)– Un genoma contenente:

• una cassetta di espressione per il transgene• affiancata da sequenze cis-regolatorie di HIV-1• non sono presenti geni virali

Lentivirus: costruzione

PROMOTERGA

RRE PROMOTORERREGA

SD SA

RSV GFPcPPT TRANSGENECostrutto di trasferimento

GAG

PRO POLRRE

TAT

REVSD

polyACMVCostrutto d’incapsidazione

sequenze attive in cis

sequenze attive in trans

Provirus HIV-1

GAG

PRO POL

RRE

TAT

REV

VIF

U

R

ENV

NEFNEFSD

LTR LTR

Vettore lentivirale di ultima generazione

Costrutto codificante il pericapside

VSV-G

SD SA

polyACMVCMV

Costrutto di trasferimento SIN (Self-inactivating)

PROMOTERGFPeGFPGA

RREhPGKRREGA

SD SA

RSVcPPT Wpre

Costrutti d’incapsidazione

REV polyARSV

SD SA

GAG

PRO POL

RRE polyACMVCMV

Produzione del vettore

Concentrazione per ultracentrifugazione

Costrutto di incapsidazione

GAG

PRO POLRRE

SD

polyA

SA

CMV

TATREV

Envelope

VSV-G

SD SA

polyACMV

Costrutto di trasferimento

PROMOTEReGFPGA

RREhPGKRREGA

SD SA

RSV cPPT Wpre

Cellule HeLa

Titolazione per diluizioni seriali

Trasfezionetransiente

Cellule 293T

Raccolta a 24 e 48 ore

GFP expression 3 months after injection

Lentivirus

Lentivirus

ControlALB

promoterCMV

promoter

Lentivirus

• Genoma ad RNA.• A differenza degli altri retrovirus possono infettare cellule proliferanti e post-mitotiche.• Integrazione casuale (mutagenesi inserzionale)• Scarsissime reazioni immunologiche.• Elevata efficienza di trasduzione.• Ottime prospettive per la terapia genica in vivo.

Adenovirus

Adenovirus

ITRITR 1010 20 20 30 30 40 40 50 50 60 60 70 80 90 100 70 80 90 100

ITRITRE1E1

Late genes (L1-L5)Late genes (L1-L5)E3E3VAVA

MLPMLP

IVa2IVa2

E2E2

E4E4

3.6 kb3.6 kb

E1 mediated regulationE1 mediated regulation



(E2F.RE)(E2F.RE)22

Vettori adenovirali

ITRITR1010 20 20 30 30 40 40 50 50 60 60 70 80 90 100 70 80 90 100

ITRITR

Late genes (L1-L5)Late genes (L1-L5)

VAVA

E2E2

E4E4

3.6 kb3.6 kb

TransgeneTransgene E3E3

E1E1

ITRITR

E1E1

293 cells293 cells

MLPMLP

Vettori adenovirali

Sviluppo di nuove generazioni di vettori allo scopo di riudrre immunogenicità e aumentare le dimensioni degli inserti.

Adenovirus

• Genoma di DNA doppio filamento.• Possono infettare cellule proliferanti e post-mitotiche.• Non si integrano, ma vengono mantenuti in forma episomica. Pertanto non determinano mutagenesi inserzionale, ma sono necessari trattamenti ripetuti.• Relativamente facile produrli in grandi quantità (titolo elevato).• Forti reazioni immunologiche.

Ciclo vitale degli AAV

Integrazione sito-

specifica

Fase latente

Ad

Fase litica

Replicazione

Ad

Cap

ITRITR

Rep

DNA replication Capsid proteins

VP1, VP2, VP3Integration

IntegrationPackagingRescue

Rescue

AAV

AAV, preparazione

AAV, infezione di neuroni

Vettori adeno-associati (AAV)

• Genoma di DNA singolo filamento.• Virus difettivo che richiede per la produzione la contemporanea presenza di un adenovirus.• Possono infettare cellule proliferanti e post-mitotiche. • Facile produrli in grandi quantità• Integrazione sito specifica in un unico locus innocuo (Cr.19), quindi assenza di mutagenesi inserzionale.• Espressione stabile nel tempo. • Inserti di dimensioni limitate.• Efficienza di trasduzione variabile.• Poco efficace se purificato bene.

Herpes Simplex Virus (HSV)

(ds DNA 152Kb, >70 genes)

genome

Latency transcripts

Latencypromoter

Herpes Simplex Virus (HSV)

• Genoma di DNA doppio filamento molto grande (152 kb) e complesso (>70 geni).• Spiccato neurotropismo.• Nelle cellule infettate è in forma episomica in uno stato latente.• Possibile inserire geni molto grandi.• Forti reazioni immunologiche.• Presenza di anticorpi contro il virus in un’elevata percentuale di casi.

Potenzialità di combinazione tra terapia genica e purificazione cellule staminali

Perché qualcuno sta pensando seriamente alla clonazione

umana?

• Il problema principale della terapia cellulare è l’istocompatibilità>rigetto

• La clonazione permetterebbe di ottenere cellule staminali totipotenti dotate delle stesse caratteristiche antigeniche del paziente, da usare per il trapianto dopo la correzione del difetto.

Perché qualcuno sta pensando seriamente alla clonazione

umana?

Cellule somatiche paziente

Ovocita

Terapia g

enica

Cellula somatica normale

Cellule totipotenti sane istocompatibili

Terapia genica del cancro: potenziamento della risposta immune

Terapia genica del cancro: sensibilizzazione cellule tumorali a farmaci

TK

Vectors for gene therapy according to www.wiley.co.uk/genetherapy (june 1999)

retrovirusliposomeadenovirusretro prd clvaccinianaked DNAothers

Retro

Adeno

Lipo

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