Modelli di terapia genica

Modelli di terapia genica

� Definizione e background

� Strategie di terapia genica

� Sistemi di rilascio

� Esempi di trials clinici

� Prospettive future

Molte patologie, dovute a proteine malfunzionanti,non sono trattabili con terapie tradizionali

Negli anni ‘70 nasce l’idea della Terapia Genica

(rilascio intracellulare di materiale genetico per generare un effetto terapeutico, con diverse strategie di

intervento a seconda dello scopo prefissato)

Terapia Genica: perché ?

DNA e mutazioni

ACGT

Proteina anomalaSequenza mutata

Ala CysAsnAspLys …GCAGCA AAAAAA GATGAT AATAAT TGTTGT

� 3 miliardi di basi (A,C,G,T)� circa 30.000 geni� circa 250.000 proteine

GENOMA UMANO

ereditarie (patologie genetiche)acquisite (tumori)dovute a virus (malattie infettive)

MUTAZIONI

Patologie bersaglio

� Multifattoriali

Malattie cardiovascolari e neurodegenerative - Diabete -Artrite reumatoide

� Tumorali

Leucemie - Carcinomi

� Infettive

AIDS - Epatite B e C

� Acquisite

Traumi (fratture ossee, ferite, ustioni) - Ischemie

� Monogeniche

Immunodeficienze - Distrofia muscolare - Fibrosi cistica - Emofilie Retinopatie - Emoglobinopatie - Ipercolesterolemia fam - Xeroderma pigmentosum

Terapia genica: quale tipo?

SOMATICA

manipolazione dell’espressione genica in cellule differenziate

dell’individuo adulto

l’alterazione genica riguarda esclusivamente il paziente su cui è

stata realizzataeventuali modificazioni geniche

verrebbero trasmesse alla progenie

non autorizzata !!!!

manipolazione dell’espressione genica in cellule riproduttive

GERMINALE

ex vivo

Le cellule bersaglio sono prelevate dal paziente,

modificate geneticamente in laboratorio e reintrodotte nello

stesso individuo

in situ

il transgene vienerilasciato localmente nel sito di azione mediante

iniezione i.m. o intratumorale o per

inalazione ecc…

in vivo

il transgene viene somministrato per via sistemica e.v.

nel corpo del paziente

� no problemi immunologici

� efficienza delle metodiche di trasduzione in vitro

� solo alcune malattie (immunologiche, ematologiche,

metaboliche)

� tumori localizzati; patol. dell’apparato respiratorio; tessuto

cutaneo ecc…

� cellule e tessuti poco accessibili

� scarsa efficienza di trasduzione, barriere

Terapia genica: come?

TERAPIA GENICA: come ?

Rilascio gene modificato Rilascio cellule modificate

in vivoex-vivo

Trasferimento

Genico in vivo Aerosol

Perfusione organo

Iniezione diretta(miocardio)

Via sistemica

elettroporazione

Uso di cateteri(tumori solidi)

TERAPIA GENICA: come ?

Vettore per rilasciare e proteggere il gene terapeutico

DNA nudo elettroporazione pistola genica microiniezioneliposomi

non-virali

adenovirus adenoassociati retrovirus lentivirus herpesvirus

virali

Differenze nei sistemi di rilascio

integrazione del transgene nel genoma ospita � espressione stabile

il transgene non si integra nel genoma � espressione temporanea

DNA nudo e metodi fisici

Vantaggi

� assenza di immunogenicità� alta efficienza ex-vivo� rilascio di grossi geni� utile per le vaccinazioni a DNA

Svantaggi

� instabilità nella maggior parte dei tessuti� espressione transitoria � in vivo solo per tessuti superficiali (cute),

muscolo, cuore, fegato

Iniezione diretta

Elettroporazione

Pistola genica

Microiniezione

Cromosomi Artificiali (MACs)

Vantaggi

� capacità di trasportare grossi geni� mantenimento autonomo� espressione genica regolabile

Svantaggi

� difficoltà di costruirlo in laboratorio � difficoltà di rilascio per le sue dimensioni

Vettori chimici

Vantaggi� non contengono geni virali � limitata immunogenicità� anche costrutti molto grandi

Svantaggi

� poco efficienti nel rilascio genico in vivo� espressione transitoria� difficoltà a rilasciare il DNA nel nucleo

Liposomi

+ + + +

DNA-

--

-

liposomes

-

Vettori virali

Adenovirus

AAV*

Retrovirus* Herpes-simplexvirus

Lentivirus*

Svantaggi

� reazione immunitaria� tossicità� integrazione random/mutagenesi inserzionale*

Vantaggi

� altamente efficienti nel trasferimento genico� espressione a lungo-termine*

� di facile produzione e in elevate quantità

� esprimibile per un lungo periodo e regolabile

� sicuro, cioé inerte dal punto di vista immunologico

� selettivo per determinati tipi cellulari

� capace di trasportare geni piccoli e grandi

� capace di integrarsi in siti specifici del genoma

� capace di infettare sia cellule in divisione chequiescenti

Vettore ideale

Strategie di terapia genica

introduzione di copie funzionali del gene difettivo o assente

� Compensazione genica

correzione del gene difettivo� Riparo genico

prevenzione del riconoscimento deitessuti da parte dell’organismo

� Anti-infiammatoria

introduzione di geni che producono anticorpi intracellulari� Anticorpale

interruzione del nutrimento ai tumori� Anti-angiogenica

introduzione di “geni suicidi” cheproducono tossine o pro-farmaci

� Suicida

introduzione di RNA antisenso perinibire l’espressione genica

� Inattivazione

introduzione di geni che inattivanoagenti infettivi

� Vaccinazione

� Terapie cellulari trapianto di cellule geneticam modif

patologie infettive (++AIDS, epatite)

patologie autoimmuni

patologie tumorali

patologie ereditarie (mendeliane)

tp. compensativa

tp. riparativa

tp. ablativa – suicida– di inattivazione– anticorpale– anti-angiogenetica

immunoterapia

tp. anti-infiammatoria

trapianti cellulari

patologie acquisite(traumi, ischemie ecc)

patologie multifattoriali (neurodegen, diabete ecc)

Strategie e patologie

Strategie a confronto

espressione della proteina normale

gene X

gene mutato � no proteina

Compensativa (x patologie AR. Trials clinici:FC, emofilia, SCID)

gene X

gene mutato � no proteina

m mm

wt

X Xwt

m

gene correttowt

espressione della proteina normale

wt wtwt

Riparo (anche x patologie AD da gain-of-function)

SOLO DNA GENOMICO CORRETTO

FRAMMENTI DI DNA

DNA GENOMICO MUTATO e DNA INSERITO

RIPARO GENICO RILASCIO GENICODNA NUDO CROMOSOMI ARTF

o PLASMIDI

SOSTITUZIONE OMOLOGA

INTEGRAZIONE DELTRANSGENE

MANTENIMENTO DELTRANSGENE

RILASCIO DI DNA TERAPEUTICO MEDIANTE MICROINIEZIONE

Riparo genico

� Mantiene il gene integro

� Mantiene la relazione tra sequenzeregolatrici e codificanti

� Assicura un livello di espressioneaccurato

� Dovrebbe essere a lungo-termine

Vantaggi

� Efficienza può essere bassa

� Rischio di mutagenesi inserzionale

� Degradazione del DNA terapeutico

Svantaggi

CELLULABERSAGLIO

VETTOREVIRALE

RISULTATOATTESO

cellula epitelio respiratorio

TERAPIA GENICACOMPENSATIVA

per patologie ereditarie

ganciclovir

cellula tumorale

ganciclovir-fosfato

timidin-kinasiVETTOREVIRALE

CELLULABERSAGLIO

RISULTATOATTESO

TERAPIA GENICAABLATIVAper patologie

tumorali

Strategie a confronto

Cellule Tumorali: caratteristiche

Cellulealtamenteproliferanti

Effetto“spettatore”

Terapia suicida

� Successivo trattamento conun pro-farmaco non tossico(es. Gangiclovir) che vieneconvertito selettivamentenella forma tossica (Gangiclovir-P) dal DME

� Conosciuta anche come terapia attivante un profarmaco (GPAT)

� Introduzione in cellule bersaglio di un gene che codifica per un enzima (es. HSV-TK) metabolizzante un farmaco (DME)

AAAmRNA

ODN antisensoRNA antisenso

ribozimasiRNA

AAA

ibrido RNA-DNA � Rnasi Hinibizione della traduzione

taglio diretto dell’mRNA

mutagenesi mirata ODN

gene mutato (es. HIV) filam.anti-senso(stampo)

filam. senso

TFO (elica triplice)

Inattivazione Genica

no RNA

Inattivazione Genica: RNA

1. Oligonucleotide antisenso

2. Ribozimi

� Interferenza mediata da RNA (RNAi) è un nuovo meccanismo per il silenziamento genico specifico

� Meccanismo evolutivam conservatocome linea di difesa contro virus

� Si legano all’mRNA complementaree lo inattivano in maniera specifica

� Uso di siRNAs sintetizzati chimicamcome nuova metodica di RNA terapeutico

Inattivazione genica: RNA

3. RNA interference

Terapia genica in Cellule Staminali

Cellula staminale CSE

Introduzione del gene terapeutico

Gene terapeutico verrà espresso in tutte le cellule del sangue

Perché usare le cellule staminali ematopoietiche?

� Cellule che si autorinnovano: nessuna necessità diripetute somministrazioni

� Poco numerose e facilmente rimovibili

� Facilmente identificabili, manipolabili e reintroducibili

� Il gene terepautico risiederà in tutte le cellule derivate

� CSE possono migrare in numerosi distretti corporei(midollo osseo, fegato, milza, linfonodi) e funzionare come vettori di trasferimento genico

Bersagli di Terapia Genica con CSE

� Malattie monogeniche SCID, ADA-SCID, malattia di Gaucher,Sindrome di Hurler, anemia di Fanconi,Malattia granulomatosa cronica

� Trapianti e tumori Marcatori genici, geni-suicida,geni di resistenza ai chemioterapici

� Immunoterapia Vaccini a DNA/RNA, recettori chimerici cellule T

� Sindromi daimmunodeficienzaacquisita (HIV)

Riboenzimi catalitici, RNA antisenso, repressori dominanti di geni HIV, RNA decay

SUCCESSI

� ADA-SCID, Aiuti, 2002� X-SCID, Hacein-Bey-Abina, 2002� Epidermolisi bullosa, De Luca, 1998� Ferite epidermide, Quesenberry, 2002

POTENZIALITA’

� Malattie metaboliche� Malattie ematologiche � M. Parkinson � M. di Alzheimer � Infarto� Diabete � Artrite reumatoide

� Trapianti cellulari� Trapianto cellule staminali geneticamente modificate ex-vivo

Terapia cellulare

Trials clinici

Tumori cerebrali

Carcinomi renali

Melanomi

Neuroblastomi

Leucemie mieloidi croniche

Ipercolesterolemia familiare

Fibrosi cistica

Emofilia A e B

Emoglobinopatie

Malattie metaboliche

ADA e X-SCID

Malattia emorragica X-linked dovuta a mutazioni nel gene per fattore VIII

incidenza: 1/5000 maschi

elettroporazione DNA plasmidico in fibrablasti da 6 pazienti con emofilia grave A

Fattore VIII � buon candidato per terapia genica:- l’espressione non è influenzata dagli episodi di

sanguinamento- non rischio di “overdose”- espressione organo-specifica non richiesta- anche bassi livelli possono dare benefici clinici

in 4 / 6 pazienti ���� incremento significativo dei livelli di fattore VIII nel sangue ���� riduzione degli episodi di sanguinamento, minor uso di fattore

VIII esogeno

Terapia genica: es. Emofilia A

� Buoni risultati in modelli animali

� Pochi esempi di risultati a lungo termine nell’uomo(X-SCID, ADA-SCID, Emofilia A)

� Procedure di rilascio genico relativam sicure(sviluppo risposta infiammatoria sistemica, sviluppo di leucemia)

� Alcune patologie più facilmente trattabili

� Alcune aree più promettenti(vaccini a DNA, angiogenesi per m. cardiovascolari, trapianti cell)

Terapia genica: risultati

Limiti attuali

bassa efficienza di rilascio genico

bassa specificità di bersaglio

espressione transiente e non-fisiologica

reazione immunitaria contro i vettori

Prospettive future

sviluppo di nuovi vettori

sviluppo di strategie cellulo-specifiche

approcci di gene-targeting

sviluppo di vettori non-immunogenici

Terapia genica: limiti e prospettive

� comprensione dei meccanismi patofisiologici della malattia

� individuazione dell’appropriato bersaglio cellulare

� individuazione del metodo di trasferimento ottimale

� creazione di un modello animale della patologia per studi pre-clinici in vivo

Terapia genica: passaggi-chiave

Sicurezza e Terapia Genica

Necessità di procedimenti sicuri e criteri selettivi nella scelta dei pazienti

- Si riteneva comunemente che la terapia genica somatica per il trattamento di una malattia grave fosse un’opzione terapeutica corretta dal punto di vista etico: i benefici erano ritenuti maggiori di costi e rischi, per malattie mortali o terminali.Il 17 Settembre 1999 Jesse Gelsinger muore a causa di una risposta iperimmune contro la grande quantità di vettore necessaria per una terapia non mirata: il consenso generale è messo in discussione.Jesse Gelsinger, 18 anni, è relativamente sano ed ha una forma lieve di deficienza parziale di ornitina transcarbamilasi (OTC) che poteva anche essere controllata con la dieta e con i farmaci (anche se con un regime molto stretto). In questa malattia, per una incapacità a demolire correttamente le proteine della dieta si ha accumulo tossico di ammoniaca

- Integrazione retrovirale in vicinanza di un oncogene e sviluppo di leucemia in trial clinico per X-SCID (2/15 pazienti)

Il successo della terapia genica dipenderàdalla collaborazione di più specialisti e

dall’utilizzo dell’appropriata combinazione strategia/vettore

per il trattamento di ciascuna patologia

CONCLUSIONI

Non esiste una “pallottola magica” valida per tutte le patologie

Distrofinopatie:trials innovativi

short arm, Xp21

Genome size: 2.5 Mb

79 constitutive exons (1% of the gene)

very large introns and non-coding regions (99% of the gene)

7 promoters (3 driving full length isoforms)

Il gene distrofina

1B 1M 1P 2a 4 9 19 29 44 55 62 68 70-75 78

5’ 3’B M P R B3 S G

La distrofina : dove si esprime

SkM

Heart

� Dystrophin is virtually absent in skeletal muscle of Duchenne patients, in rare cases strongly reduced (rare revertant fibers)

� Dystrophin is present though qualitatively and quantitatively reduced in skeletal muscle of Becker patients

Come distinguere fra Becker e Duchenne

CTRL BMD DMD

revertant fibers (courtesy of Patrizia Sabatelli)

NucleusNucleus

Extracellular MatrixExtracellular Matrix

Outer nuclear membrane

TNNT2TNNT2TPM1TPM1TCAPTCAP

LMNALMNAInner nuclear membrane

TTNTTN

Collagen VI

Laminin 2

δδδδ ββββ γγγγ ββββααααSGCDSGCD

DYSDYS

αααα Integrin SarcolemmaSarcolemma

CostameresCostameres

DESDES Sarcoplasmic Reticulum

Ca2+

Mithocondria

SarcomereSarcomere

Ca2+

Z disc

Z line

I band

M line

A band I band

Z line

Cytoplasmic actin

DSPDSP

MVCLMVCL

PLNPLN

Cytoplasmic actin

CLPCLPLDB3LDB3

MYH7MYH7MYBPC3MYBPC3

ACTCACTC

CTF1CTF1TAZ TAZ

ABCC9ABCC9

EYA4EYA4

DYSDYS

T-tubule

Lancet, 2005

La ricerca

Modulare mutazioni della distrofina con oligonucleotidi antisenso (AONs) >>exon skipping

Come funzionano gli ANTISENSO

LA RICERCA : UTILIZZO DI NANOPARTICELLE PER VEICOLARE OLIGONUCLEOTIDI ANTISENSO

•NANOPARTICELLE ( 500nm)

RR

RR

RR

R

R

R

R

R

RR

RR

R

R R

R

R RR

R

R

++

++

+

+

+

+

+

++

++

+

++

+

T1-AONs : IL LEGAME

LE NANOPARTICELLE T1 LEGANO GLI ANTISENSO

ArON

T1 Fluorescenti (T1-fluo) Al microscopio elettronico

ESPERIMENTI NEL TOPO MDX

EPSERIMENTO NEL MODELLO ANIMALE DI DISTROFINOPATIA (MDX)

ANTISENSO SU ESONE 23 (DOVE èPRESENTE LA MUTAZIONE DEL TOPO)

INOCULO SISTEMICO INTRAPERITONEALE

STUDIO DELLA PROTEINA NEI TESSUTI DEL TOPO

STUDIO DELL’RNA

diaphragm

gastrocnemius

quadriceps

C57BL6 mdx group 1 (day 21)

mdx group 1 (day 60)

mdx group 2 (day 21)

RISULTATI LA DISTROFINA RICOMPARE NEI MUSCOLI DEL TOPO TRATTATO

C57BL6mdx group 1

(day 21)

diaphragm

gastrocnemius

quadriceps

mdx group 1 (day 60)

RISULTATI LA DISTROFINA RICOMPARE NEI MUSCOLI DEL TOPO TRATTATO

A B C D

C57BL6mdx group 1

(day 21)mdx group 1

(day 21)mdx group 4

(day 21)

RISULTATI LA DISTROFINA RICOMPARE NEL CUORE DEL TOPO TRATTATO

COME SI DIFFONDONO LE NANOPARTICELLE CON LEGATI GLI ANTISENSO

DIAFRAMMA

CELLULE DELLE PARETI DEI VASI

VASI LINFATICI

CELLULE DEL MESOTELIO

Fegato

Milza

ALTRI ORGANI: NON SEGNI DI TOSSICITA’

Altre strategie terapeuticheUp-regulation of functional analogues fo dystrophin (utrophin)

Gene therapy

Cell therapy

Molecular Therapy

(Antisense)

gentamicin (1996-1999)

PTC124 (pilot trial in progress)

“somatic cell gene replacement”� cDNA distrophin (13.9 Kb) in gutted adenovirus (g-AV)

� cDNA distrophin 6.3 Kb in viral vector (AV adenovirus I)

� cDNA distrophin 4.3 Kb (micro dystrophin) in adenoassociated virus (AAV)

Gene therapy

ADVANTAGESADVANTAGES

ONCE-IN-MAN THERAPY (stable therapy)Correct localization of dystrophin (gastrocnemius and tibialis anterior)Correct localization of glycoprotein complex

DISADVANTAGESGreat immuno response!!Requires chronic immunosuppression!!Low availability of viral vectorsGenome integration (side effects)Systemic delivery: no ideas about the late-onset side effects

CELL THERAPYCELL THERAPY

Heterologous cells-mesangioblasts (perycites) injection in dystrophic dogs (golden retriever)-rescue of dystrophin protein synthesis and localisation both in heart and skeletal muscles-reduction of necrotic and inflammatory changes at the morphological analysis of the treated dogs

CELL THERAPYCELL THERAPYADVANTAGESADVANTAGES

OnceOnce--inin--man therapyman therapyUseful potentially for all muscular disordersUseful potentially for all muscular disorders

DISADVANTAGESDISADVANTAGES--safety issues: unknown!safety issues: unknown!

--side effects: theoretically manyside effects: theoretically many--staminal cellsstaminal cells--related trouble (proliferation)related trouble (proliferation)

--heterologous cells: chronic heterologous cells: chronic immunosoppressionimmunosoppression

Terminato nel 2009Dati non ancora disponibili

PTC124

USA company is contacting european groups for a trial for nonsense mutations

Coordination: PTC Therapeutics (US)

PTC124 (gentamicin analogue): read through premature termination codonsPTC124 targets genetic disorders caused by nonsensemutations (Nature, 2007)

PTC124: it may correct nonsense mutations only

PTC124 Stop mutations correction

� Stop (nonsense) AAGGTCTGTTCACCCATTATC

AAGGTCTGTTGA (stop)

Lead to TRUNCATED non functional proteins (generally DMD phenotype)

PTC124: drug able to convert a PREMATURE STOP CODON (TGA, TAA, TAG) in a SENSE codon.

Ribosomal correction (post-transcriptional)

PTC124 (gentamicin analogue): read through premature termination codons

Pre-trial studies in mdx preliminary results: dystrophin rescue up to 5% in mdx treated for 8 weeksNo side effects.

US Multicentric trial (Italy : E.Mercuri, P.Comi and E.Bertini)oral administrationperiod: 6 months-1 year

Limitations: low efficiency of dystrophin rescueSide effects: none known

Prosensa “first in man”trial

PRO051 drug:5’ UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU 3’IC:at least 50% of spared muscle

Concurrent glucocorticoid treatment

0.8 mg of PRO051IM injection

Dystrophin rescue 40-60%Mild side effects

Conclusioni

-primi trial nell’uomo con antisenso e PTC124 giàeffettuato in Olanda e USA

Ma sono necessari:

-ulteriori studi per cercare sistemi di rilascio -accurata valutazione delle efficacia e tossicità

-ricerca di biomarkers