Cos’è la terapia genica?

Per terapia genica (Gene Therapy) si intende l'inserzione di materiale genetico (DNA) all’interno delle cellule al fine di poter curare delle patologie. Questa procedura di inserzione è nota come transfezione.

La storia• ‘50-’60: il trasferimento genico in cellule animali

portava alla sintesi di proteine e di anticorpi contro di esse.

• ’70-’80: nei primi test di terapia genica le proteine sintetizzate a partire dai geni transfettati venivano eliminate dal sistema immunitario.

• ’80: progressi nel campo della biologia molecolare permettevano di modificare il DNA di batteri e microrganismi in modo tale da indurli a produrre determinate molecole. In seguito, gli scienziati decisero di provare ad utilizzare le mutazioni indotte per curare le malattie umane.

Caratteristiche perché sia efficace:

Trasferimento effettuato con successo,

Durata dell’espressione,Assenza di reazioni

immunitarie,Attenzione nella

procedura.

Tipologie di terapia genica:

Dalle cellule delle linea germinale

Dalle cellule della linea somatica:

• IN VIVO

• EX VIVO

EX VIVO Si tratta della tipologia che

venne messa in pratica per prima e consiste nel prelievo delle cellule somatiche della persona interessata. Esse, successivamente, vengono messe in cultura in laboratorio. Durante questo tempo vengono trasfettate con il gene d’interesse, inserito tramite un apposito vettore (spesso virale), e successivamente vengono reinfuse o reimpiantate nel corpo del soggetto. Tale procedura è sicuramente la più lunga e la più costosa delle due ma permette di selezionare ed amplificare le cellule d’interesse ed inoltre gode d’una maggior efficienza.

IN VIVO Viene attuata in tutti quei

casi in cui le cellule non possono essere messe in cultura o prelevate o reinfuse come quelle del cervello o del cuore e della maggior parte degli organi interni. In questo caso il gene d’interesse viene inserito, tramite un opportuno vettore, nell’organismo direttamente per via locale o sistemica.

Come ottenere il gene da transfettare:

• Conoscendo la fisiopatologia della malattia da curare, si selezionano i geni alterati e si ricavano di conseguenza quelli terapeutici.

• Il gene viene isolato, amplificato e sequenziato.

• Grazie alla biologia molecolare, si costruiscono filamenti di DNA con il gene in questione.

Tipologie di trasferimento:

1. Il gene si integra nel genoma dell’ospite e si trasmette alle cellule figlie (si usa nelle malattie genetiche quando serve un gene che si replichi in maniera stabile).

2. Il gene rimane nella cellula sottoforma di particella episomiale, che quindi non viene trasmessa alle cellule figlie ma si manifesta codificando per proteine etc.

3. La particella episomiale viene associata ad un’origine di replicazione, una sequenza di DNA che permette l’aggancio delle polimerasi cellulare, per cui l’episoma viene trasmesso alle cellule figlie.

Trasferimento genico

VIRALE

NON VIRALE

• Iniezione di DNA nudo;• Inserimento tramite

liposomi (polimeri cationici);

• Bombardamento tramite particelle (gene gun).

NON VIRALE

DNA NUDO

• Vantaggi:facilità a produrlo in elevate quantità ed a purificarlo;

• Svantaggi:è facilmente degradabile dalle endonucleasi dell’ospite, l’efficienza di trasformazione del DNA è relativamente bassa.

LIPOSOMI Sono vescicole lipidiche artificiali, dotate di carica positiva, in grado di incorporare DNA a carica negativa

(che viene rilasciato nel citoplasma della cellula ospite, la quale in seguito lo integra nel nucleo). Entrano nelle cellule per endocitosi.

• Vantaggi:sono molto più sicuri dei vettori

virali, contengono molto materiale genetico,

perché transfettino una cellula questa non

deve essere per forza in divisione. • Svantaggi: solo lo 0,1% del DNA viene

espresso.

GENE GUN Consiste nell’utilizzo di particolari strumenti

elettrici o ad alta pressione, detti cannoni genici (gene gun), che permettono di inviare nella cellula particelle microscopiche d’oro o di tungsteno ricoperte da DNA. Al momento non esistono studi sull’uomo di questa metodica ma solo su animali.

I vettori virali devono avere determinate caratteristiche:• Le particelle virali ricombinanti devono essere difettive rispetto alla replicazione,• Il virus non deve essere pericoloso,• Deve esserci spazio a sufficienza per il gene terapeutico (vincolo di dimensione).

I virus più studiati come possibili vettori da utilizzare nella terapia genica sono:

• Retrovirus,• Adenovirus,• Lentivirus,• Virus adenoassociati,• Herpesvirus.

VIRALE

RETROVIRUSSono formati da due filamenti di RNA con un capside di proteine ed un

involucro lipidico. Grazie all’enzima trascrittasi inversa, a partire dal RNA si ricava il DNA che poi si integra nel genoma dell’ospite grazie all’integrasi.

• Vantaggi: attitudine all’infezione di numerose linee cellulari, l’elevata efficienza nell’integrazione del gene terapeutico nel genoma, che poi viene trasmesso anche alle cellule figlie.

• Svantaggi: è complessa la procedura di purificazione dal mezzo di coltura. Il genoma retrovirale, inoltre, si può integrare in quello cellulare solo quando la membrana nucleare è assente e di conseguenza solo le cellule replicanti possono esser infettate. Un altro problema deriva dal fatto che il gene virale si integra nel genoma in modo relativamente casuale, provocando inserzioni mutageniche con potenziale danno alle cellule. Il vincolo di dimensione è stretto e costa molto utilizzarli.

I lentivirus appartengono alla famiglia dei retrovirus di cui condividono la morfologia ed il ciclo replicativo.

• Vantaggi: possono infettare anche cellule non replicanti (perché passano attraverso la membrana nucleare), il che li rende dei buoni candidati per modificare l’espressione delle cellule a differenzizione terminale .

• Svantaggi: essendo facile che questi virus vadano incontro a ricombinazione genetica, permane il rischio di dare origine ad un virus infettante (è per questo che non ci sono studi di lentivirus applicati all’uomo).

LENTIVIRUS

ADENOVIRUS• Gli adenovirus sono patogeni naturali dell’uomo, con DNA a doppio

filamento, e che causano solamente il comune raffreddore. • Vantaggi: infettano molti tipi di cellule con grande facilità, le infettano

anche se non sono in divisione, il DNA virale esiste come episoma e non si inserisce quindi nel genoma delle cellule bersaglio (evitando così il rischio di cancro).

• Svantaggi: rapida inattivazione delle cellule infettate, inoltre avviene una perdita progressiva dell’episoma per cui la sua espressione risulta transitoria.

VIRUS ADENOASSOCIATIAppartengono alla classe dei parvovirus, cioè piccoli virus a DNA che

necessitano della coinfezione con un adenovirus per potersi replicare. Gli AAV si replicano come virus a DNA a doppio filamento, ma si impacchettano come virus a DNA a filamento singolo. Si utilizzano, se non modificati, perchè si integrano nel genoma bersaglio in uno specifico locus del cromosoma 19, eliminando il rischio di inserzioni casuali.

• Vantaggi: non causano nessuna patologia nell’uomo, per cui non ci sono reazioni immunitarie (e quindi i loro effetti durano a lungo).• Svantaggi: trasportano solo 4kb di geni, cioè la metà rispetto agli adenovirus.

HERPESVIRUS

Non si integrano nel genoma dell’ospite, ma possono essere trattenuti all’interno dei neuroni, in forma più o meno innocua, per tutta la vita del paziente.

• Vantaggi: sono 5 volte più grandi degli adenovirus, di conseguenza contengono più geni; agiscono sulle cellule non in divisione ed hanno un ampio spettro d’infezione (quasi tutte le cellule dello organismo).

RIASSUMENDO

PROBLEMI CHE SI POSSONO PRESENTARE:

• Possono insorgere malattie immunitarie in pazienti con il sistema immunitario compromesso (anziani, persone sottoposte alla chemio etc);

• Alcune mutazioni possono riattivare la pericolosità del virus utilizzato (se si utilizza), come vettore;

• Reazioni allergiche.

LA CURA DELLA EPIDERMOLISI BOLLOSA

• EB:devastante malattia genetica della pelle che provoca il distacco dello strato superficiale, l’epidermide, da quello più profondo, il derma.

• Ricercatori: Michele De Luca, Fulvio Mavilio• Un adulto di 36 anni, colpito dalla forma non letale di epidermolisi bollosa, chiamata giunzionale

(JEB), è stato arruolato per una sperimentazione clinica detta di fase I/II: uno studio pilota in cui per la prima volta un nuovo trattamento viene somministrato a un paziente per cercare di curare una malattia. Il risultato conseguito in questa fase consente di trarre indicazioni circa l’efficacia del trattamento e, in caso positivo, fornisce elementi per le giuste dosi e per la stesura dei relativi protocolli di somministrazione.

• La malattia dipende da un difetto nel gene per la catena beta 3 della laminina 5, una proteina che permette che l’epidermide si attacchi al derma e senza la quale la pelle si stacca con conseguenti infiammazione e infezione.

• Per la prima volta, cellule staminali provenienti dall’epidermide del paziente, prelevate con una biopsia cutanea, sono state corrette geneticamente mediante l’inserimento di un vettore retrovirale della versione sana del gene “malato” (terapia genica), e fatte crescere in laboratorio. La crescita è stata seguita fino a ottenere nove lembi di epidermide, sufficientemente grandi da poter essere trapiantati su due zone delle gambe del malato.

• Il mantenimento della nuova epidermide dipende dalla presenza di cellule staminali geneticamente corrette che garantiscono il rinnovo del tessuto.

• “È la prima volta che una malattia genetica della pelle viene curata grazie a un intervento che unisce la terapia genica alla terapia cellulare. Dopo aver concluso questo studio clinico, il prossimo passo sarà estendere questo trattamento ad altre malattie genetiche della pelle e a malattie di altri epiteli, come per esempio le distrofie corneali, malattie invalidanti che portano a cecità”.

LA CURA DELLA SCID

• SCID=Sindrome da immunodeficienza grave combinata • Legata ad un gene recessivo mutato per cui non vengono

sintetizzate correttamente le proteine necessarie alla maturazione dei globuli bianchi.

• Gli individui affetti da SCID, nelle prime settimane di vita non presentano sintomi (si sviluppano dopo 3-6 mesi).

• Trapianto di midollo osseo da un donatore compatibile. Vista la mancanza di un sistema immunitario nell'ospite, non vi è il problema del rigetto.

• Graft-versus-host disease • Difficile trovare donatori compatibili;• Infusioni mensili di anticorpi;• Ingegnerizzare le cellule del paziente stesso• L’ada-scid è stata sconfitta. Altri tipo no, forse a causa dell’uso di

vettori virali si sono sviluppati casi di leucemia.

PROGETTI FUTURI:CREAZIONE DI BIOREATTORI

Le cellule che esprimono le proteine terapeutiche vengono fatte crescere in coltura in un dispositivo impiantabile nel corpo del paziente. Questo permette alle sostanze nutritive di entrare per garantire la crescita cellulare ed alla proteina ricombinante di diffondersi in circolo, mentre le cellule impiantate sono difese dal sistema immunitario degli ospiti.

GLOSSARIO• Episoma: un elemento genetico che può

integrarsi in un cromosoma mediante un processo di ricombinazione.

• Liposoma: particolare conformazione che una particella contenente grasso e fosforo assume in una soluzione acquosa.

• Cationico: caricato positivamente

• KB: unità di misura utilizzata in genetica corrispondente a 1000 nucleotidi