LA TERAPIA GENICA

STRATEGIE

La TERAPIA GENICA mira alla correzione di mutazioni genetiche che determinano patologie mediante:

• SOSTITUZIONE GENICA

• ELIMINAZIONE MIRATA DI CELLULE SPECIFICHE

• INIBIZIONE MIRATA DELLA ESPRESSIONE GENICA

IN VIVOIN VIVO EXEX--VIVOVIVO

STRATEGIE

PRINCIPALI PATOLOGIE

Epitelio retinico

1 milione/annoRetinopatia diabeticaDegenerazione maculareMalattie dell’occhio

CellT, MF,feg. 1 milione/annoAIDS, epatite CMalattie infettive

Neuroni, glia1 milione/annoParkinson, Alzheimer,SLAMalattie neurologiche

Vari tipi> 1 milione/annoVariCancro

Polmoni,fegato1:3,500α1-antitripsinaEnfisema ereditario

Midollo osseoFino a 1:600Difetti in α- o β-globinaEmoglobinopatie (tal., SCA)

Vie resp.1:3,000 caucasiciGene CFTRFibrosi cistica

Fegato1:1,000,000Recettore per LDLIpercolesterolemia familiare

Fegato, musc.1:10,000 maschiFattori VIII o IXEmofilia A e B

Midollo osseoLinfociti TRaraAdenosina deaminasISCID

Cellule bersaglioIncidenzaDeficitPatologia

MODALITÀ DI TRASFERIMENTO GENICO

• IN VIVO • EX VIVO

METODI PER IL TRASFERIMENTO GENICO

LIPOFEZIONE LIPOSOMI VETTORI VIRALI RETROVIRUS

ADENOVIRUS VIRUS ADENO-ASSOCIATI HERPESVIRUS

METODI FISICI ELETTROPORAZIONE PARTICLE GUN

APPLICAZIONI

� TERAPIA GENICA � MARCATURA GENICA

STRATEGIE

VETTORI VIRALI: I RETROVIRUS

• Genoma: RNA singolo filamento.

• Integrazione casuale nel genoma (mutagenesi inserzionale).

• Difficile produrli in grandi quantità (titolo elevato).

• Successo della terapia dipendente dalla trasduzione delle cellule

staminali.

• Poco immunogeni.

• L’espressione può andare incontro ad attenuazione nonostante la

persistenza del virus nel genoma.

• In assoluto sono i vettori più utilizzati per la terapia genica.

• Possono infettare solo cellule proliferanti

• Genoma a RNA.

• A differenza degli altri retrovirus possono infettare cellule proliferanti e post-mitotiche.

• Scarsissime reazioni immunologiche.

• Elevata efficienza di trasduzione e persistenza dell’espressione.

• Ottime prospettive per la terapia genica in vivo.

• Integrazione casuale (mutagenesi inserzionale).

VETTORI VIRALI: I LENTIVIRUS

• Genoma a DNA doppio filamento.

• Possono infettare cellule proliferanti e post-mitotiche.

• Non si integrano, ma vengono mantenuti in forma episomica. Pertanto non determinano mutagenesi inserzionale, ma sono necessari trattamenti ripetuti.

• Relativamente facile produrli in grandi quantità (titolo elevato).

• Forti reazioni immunologiche.

VETTORI VIRALI: ADENOVIRUS

VETTORI VIRALI: SPECIFICITÀ

LA LIPOFEZIONE

LA TRASFEZIONE

CELLULA PACKAGING

VANTAGGI (TEORICI) DELLA TERAPIA GENICA

• Correzione radicale dei difetti

• Possibilità di agire su meccanismi molecolari per i quali risulta estremamente difficile sviluppare farmaci specifici

• Vantaggi economici (se fosse permanente eviterebbe la necessità di trattamenti ripetuti)

SOSTITUZIONE GENICA

STRATEGIE TERAPEUTICHE

Efficace per le patologie caratterizzate da perdita di funzionetotale o parziale di un gene.

INIBIZIONE MIRATA DELL’ESPRESSIONE GENICA

Strategia utile per le patologie causate dalla presenza di mutazioni ad effetto dominante o dominante negativo.

siRNA

STRATEGIE TERAPEUTICHE

UCCISIONE DIRETTA DI CELLULE PATOLOGICHE

STRATEGIE TERAPEUTICHE

TERAPIA GENICA “IN SITU”

STRATEGIE TERAPEUTICHE

UCCISIONE DI CELLULE PATOLOGICHE MEDIATA DAL SISTEMA IMMUNITARIO (TUMORI)

STRATEGIE TERAPEUTICHE

TERAPIA GENICA DEL CANCRO: POTENZIAMENTO DELLA RISPOSTA IMMUNE

STRATEGIE TERAPEUTICHE

LO STATO DELL’ARTE

LO STATO DELL’ARTE

LO STATO DELL’ARTE

LO STATO DELL’ARTE

STATO DELLASPERIMENTAZIONE

1. OLTRE IL 70% DEI PROTOCOLLI SONO IN FASE 1 O2 (VALUTAZIONE DELLA SICUREZZA)

2. 75% DEI PROTOCOLLI IN FASE 1 NEL 1995 NONHANNO SUPERATO QUELLA FASE

3.NESSUN PROTOCOLLO HA AL MOMENTO PRODOTTO

RISULTATI DURATURI E RADICALI NELL’UOMO AD

ECCEZIONE DEGLI INTERVENTI RIGUARDANTI LA

S.C.I.D.

Primo prodotto di terapia genica disponibile in commercio:

Adenovirus esprimente p53 contro carcinomi squamo-cellulari di testa e collo, licenziato in Cina dall’Industria cinese Shenzen SiBiono (2003)

Prodotto simile che sta per essere registrato negli USA (ora in fase III della sperimentazione clinica contro carcinomi sqamo-cellulari di testa e collo, tumori del polmone e della mammella):

Adenovirus per p53, Advexin

Si ritiene che l’Advexin sara’ il primo farmaco di terapia genica registrato in USA..

LO STATO DELL'ARTE

ADA (ADENOSINE DEAMINASE)

• Catalizza la deaminazione di adenosina e desossiadenosina in inosina e desossiinosina

• Mutazioni nel gene dell’ADA causano immunodeficienza (SCID, Severe Combined Immunodeficiency): virtualmente assente attivita’ di linfociti B e T

• Cure possibili: trapianto di midollo, somministrazione di PEG-ADA bovina

TRIAL CLINICO PER DEFICIT ADA

L’espressione di ADA persiste a 12 anni dalla prima infusione di cellule modificate in una delle 2 pazienti trattate:20% dei linfociti esprimono ancora ADA

La 2a paziente ha invece sviluppato anticorpi contro componenti del sistema di infezione (FCS) e ha perso i linfociti trasdotti e l’espressione di ADA

TRIAL CLINICO PER DEFICIT ADA

Gene therapy of Human Severe Combined Immunodeficiency(SCID)-XI Disease:

• Trial successivi hanno dimostrato successo nel correggere il difetto immunitario in 9 pazienti su 10 trattati

• Tuttavia, dopo 3 anni i due pazienti piu’ giovani (1 e 3 mesi al tempo del trattamento) hanno improvvisamente sviluppato proliferazioneclonale di linfociti T maturi (Science 2003).

• In entrambi i casi, i linfociti aberranti mostravano inserzione del vettore retrovirale in prossimita’ del promotore del proto-oncogene LMO2:

MUTAGENESI INSERZIONALE!

TRIAL CLINICO PER SCID

ATTUALI PROBLEMI TECNICI DELLA TERAPIA GENICA

• Efficienza di trasferimento genico

• Selettività del sistema di trasferimento

• Espressione instabile nel tempo

• Espressione non regolata

• Reazioni del sistema immunitario

• Possibili interferenze con il genoma

(mutagenesi inserzionale)

LIMITI DELLA TERAPIA GENICA

• Rischio troppo elevato in presenza di terapie alternative

• Mancanza di efficacia dovuta a problemi tecnici (inefficiente trasferimento genico, inattivazione del gene terapeutico)

• Costi elevati

• Alto rischio di effetti indesiderati (espressione non regolata, mutagenesi inserzionale, passaggio delle modifiche alla linea germinale)