Anticorpi monoclonali:terapia e diagnostica

Anticorpi monoclonali

Sono proteine prodotte dal sistema immunitario cherispondono ad un unico determinante antigenico e, cometali, sono altamente specifiche

Con l’avvento della tecnologia degli ibridomi, la loroproduzione ha rivoluzionato l’immunologia e ha avuto unimpatto straordinario sia nella ricerca che nella clinica

Nel 1975 Kohler e Milstein per la prima voltaprodussero una linea cellulare fondendo un linfocita Bnormale, capace di rispondere ad un singolo epitopoantigenico con cellule mielomatose immortali capacedi crescere indefinitamente in vitro

Nel 1984 lo sviluppo diquesta linea ibrida(IBRIDOMA) valse ai duescienziati il premio Nobel

Anticorpo• Sito di legame con l’antigene: sito che lega l’antigene nella

regione variabile

• Dominio variabile : catena variabile pesante (VH) e variabileleggera (VL). Entrambi sono responsabili del legame all’antigene

• Sito di legame con l’effettore:effettrici nel dominio costante

sito che interagisce con molecole

• Dominio costante : regione Fc dell’anticorpo

• Regione che determina la complementarità (CDR) :combinazione di regioni variabili VL e VH che interagiscono conl’epitopo sull’antigene

Struttura dell’anticorpo

Dominiocostante

Dominio variabile

Funzioni effettrici dell’anticorpo

Dipendente dalla classe di anticorpo (IgG, IgM, etc,)

Attiva il sistema complemento (complement dependentcytotoxicity)

Attiva le cellule citotossiche del sistema immunitario(antibody dependent cellular cytotoxicity)

Produzione di anticorpi monoclonali

Come amplificare indefinitamente i linfociti Bspecifici per un dato antigene e selezionare

un singolo clone secernente ?

POTENZIALITA’ TERAPEUTICHE DEGLIANTICORPI MONOCLONALI

Terapia del cancro (neoplasia mammaria, colon- rettale, polmonare, renale,leucemia, linfomi)

Trattamento di malattie autoimmuni (morbo di Crohn, artrite reumatoide,psoriasi, sclerosi multipla)

Cura dell’osteoporosi

Profilassi nel rigetto di trapianti d’organo

Diagnosi di malattie genetiche

Diagnosi di gravidanza e di malattie a trasmissione sessuale

Diagnostica per immagini

Misurazione dei livelli di una proteina o di un determinatofarmaco nel siero

Tipizzazione ematica o tissutale

Identificazione di agenti infettivi

Identificazione di marcatori tumorali specifici Identificazione di cellule specifiche coinvolte nella rispostaimmunitaria

Identificazione e determinazione della concentrazione dideterminati ormoni

Utilizzo come traccianti nella diagnostica per immagini

Utilizzo nella diagnostica

Evoluzione degli anticorpi monoclonali

Problemi relativi ad anticorpi murini nell’uomo

• Risposta immune umana all’anticorpo di topo (HAMA-Human Anti-Mouse Antibodies)

– successivo trattamento può causare allergia o shockanafilattico

• L’anticorpo di topo non attiva il sistema umano delcomplemento o la citotossicità mediata dall’anticorpo.

• Breve emivita

Anticorpi ingegnerizzati mediante tecnologia del DNAricombinante

• Estrazione di mRNA da ibridoma

• Sintesi di cDNA

• Clonaggio e sequenziamento regioni variabili della catenaleggera e della catena pesante dell’anticorpo

Soluzioni

Anticorpi monoclonali chimerici

• Regioni variabili della catena pesantefusi con la regione costante umana

e leggera di topo

• Approssimativamente il 75% della sequenza umana

• Stessa specificità del bersaglio di quelli murini

• Meno immunogenici di quelli murini

• Numerosi anticorpi chimerici approvati da FDA

Anticorpi monoclonali umanizzati

• Sequenze murine delle regioni CDR (complementarity-determining region) (3 da regione variabile della catenapesante e 3 da regione variabile della catena leggera)trapiantate nella regione variabile umana ed espresseall’interno delle regioni costanti umane.

• Approssimativamente il 90% della sequenza umana

• Meno immunogenici di quelli murini o chimerici

• Diversi anticorpi umanizzati approvati da FDA

Anticorpi monoclonali umani

• Anticorpitransgenici

completamente umani, generati in topi (topi che portano geni delle immunoglobuline

umane)

• 100% sequenza umana

• Ingegnerizzatiricombinante

mediante la tecnologia del DNA

1. Inattivare i geni della catena pesante e leggera di topo2. Introdurre i geni umani della catena pesante e leggera nel genoma

murino3. Il topo transgenico può essere immunizzato con antigeni bersaglio

per generare anticorpi umani

ANTICORPI MONOCLONALI

Evoluzione degli anticorpi monoclonali

Evoluzionedegli anticorpimonoclonali

Citotossicità

REAZIONE ACDCC : Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity

Meccanismi di azione degli anticorpimonoclonali in clinica

ADCC: citotossicità cellulare anticorpo-dipendente

Meccanismi di azione deglianticorpi monoclonali in clinica

CDC: citotossicitàcomplemento-dipendente

Inibizione dellatrasduzione del segnale

anticorpo-mediata

Strategie per potenziare la rispostaanticorpale (anticorpi coniugati)

Farmaco

Anticorpomonoclonale

Proteina dellasuperficie cellulare

Cellulabersaglio

Farmaco

Anticorpomonoclonale

Proteina dellasuperficie cellulare

Cellulabersaglio

Enzima

Pro-Farmaco

Sistema di indirizzamento del farmaco basato suanticorpi monoclonali

Anticorpi monoclonali nella terapia antitumorale

Difficoltà tecniche nella pratica clinica:

-Proprietà dell’antigene tumorale

-Proprietà dell’anticorpo

-Integrità dei meccanismi immunologiciresponsabili della risposta

Proprietà dell’anticorpomonoclonale

Capacità di indurre apoptosi

Capacità di indurre una risposta citotossicacomplemento-mediata (CDC) o anticorpo mediata(ADCC)

Accesso alle cellule tumorali

Ridotta immunogenicità

Meccanismi di distruzione delle cellule tumorali

Citotossicità mediata anticorpo-dipendente (ADCC), citotossicitàcomplemento mediata (CDC), apoptosi (meccanismi diretti);inibizione della proliferazione cellulare (meccanismi indiretti)

Anticorpi approvati per l’utilizzo in terapia

Anticorpi monoclonali umanizzati approvati peruso clinico

TRASTUZUMAB HER-2 Cancro della mammella

ALEMTUZUMAB CD 52 B-CLL

PALIVIZUMAB RSV RS VIRUS nei bambini

DACLIZUMAB IL-2R Trapianto d’organo

Cetuximab (Erbitux®)

Anticorpo monoclonale chimerico:

- diretto contro il recettore per il fattore di crescitaepidermico (EGFR) iperespresso nel 60-80% dei pazienticon carcinoma del colon-retto

- approvato dal FDA 2004

Meccanismo d’azione di Cetuximab

Anticorpi anti-VEGF

Angiogenesi

Bevacizumab (Avastin®)

- anticorpo hrAb-anti-VEGF, monoclonale murino umanizzatoche si lega a tutte le isoforme di VEGF-A

- approvato dal FDA nel 2004, per il trattamento di primascelta per il tumore metastatico del colon-retto indicato incombinazione con chemioterapia (5-FU/acido folinico, o 5-FU/acido folinico/irinotecan)

- off-label, alla dose di 1 mg o 0.125 mg intravitreo 1 volta almese ha dimostrato miglioramento dell’acuità visiva e unariduzione dell’angiogenesi

PROCESSO ANGIOGENICO

Ranibizumab (Lucentis )

- anticorpo rhuFab V2, è un frammento di un anticorpomurino umanizzato anti-VEGF che si lega a tutte le isoformedi VEGF

- si somministra alla dose di 0.5 mg intravitreo 1 volta almese ha dimostrato miglioramento dell’acuità visiva e unariduzione dell’angiogenesi

- spesso è associato alla terapia fotodinamica

Farmaci a bersagliomolecolare

oTarget therapy

Target therapy e terapia personalizzata

Immunità e tumoriBurnet anni 1950: Immunosorveglianza e cancro Dume1990: Immunoediting (l’immunità protegge dal cancroma nel contempo può favorirne lo sviluppo) Schreiber2010 : tre livelli di Immunoediting-eliminazione del tumore (prevale l’immunità)-fase di equilibrio (honeymoon)-progressione e sopravvento del tumore (sbilanciamento) Negli ultimi decenni sono aumentate le segnalazioni sulcomplesso rapporto tra immunità e cancro Alcune malattie autoimmuni si correlano ad una elevatamanifestazione di tumori

Immunità e tumori

Sono sistemi di regolazione immunitaria che riducono lepossibilità di innesco di processi autoimmuni Esiste un processo di TOLLERANZA CENTRALE e diTOLLERANZA PERIFERICA I processi immunitari delle cellule T sono attivati dallaesposizione ad antigeni MHC e dalla presentazione di unantigene da parte di cellule APC Per prevenire eventi di innesco di autoimmunità sono previstinumerosi checkpoint regolatori. CTLA4 intervieneprecocemente, PD1 più tardivamente

CTLA4 e PD1

CTLA4/B7

PD1/PD-L1

Sono recettori della famiglia recettoriale B7 Sono espressi da cellule T attivate L’espressione è regolata da TCReceptor Modulano l’espressione di proteine e effettori intracellulari Riducono la proliferazione delle cellule T Riducono la fosforilazione ossidativa delle cellule T Riducono la produzione di citochine (IL2 e INF) Aumentano l’apoptosi delle cellule T

CTLA4 e PD1: similitudini

CTLA4 e PD1: differenzeCTLA4Espresso solo da cellule TPresente nei linfociti dei linfonodiIl ligandoè solo B7 di APCDetermina tolleranza immunitaria in una fase piùprecoceAzione su T regolatori certa

PD 1Espresso da T cell, B cell, cellule mieloidi

Presente nelle cellule dei tessuti perifericiLigandi: B7,PD-L1,PD-L2

Azione su effettori più tardivi del pathwayAzione su T regolatori sporadica

Atezolizumab (anti PD-L1)

Febbre,dolori,sonnolenza Maculopapule Diarrea e coliti ulcerose,epatopatia Ipofisiti, tiroiditi Neuropatie, s. di Guillaume-Barré, miastenia Trombocitopenia Nefriti

Tossicità da antagonismo PD-1/PD-L1

IpilimumabMelanoma, carcinoma renale NivolumabMelanoma, carcinoma polmonare NSCLC, carcinomarenale, linfoma di Hodgkin AtezolizumabCarcinoma uroteliale, carcinoma polmonare NSCLC

Indicazioni terapeutiche