TECNICHE CROMATOGRAFICHE

Le tecniche cromatografiche permettono di separare gli analiti presenti in una miscela complessa.

Tutti i sistemi cromatografici sono costituiti da una fase stazionaria, che

puo’ essere un solido, un gel, un liquido o una miscela solido/liquido ed e’

immobilizzata, ed una fase mobile, che puo’ essere liquida o gassosa e fluisce

sopra od attraverso la fase stazionaria.

IL CROMATOGRAMMA

Rappresentazione illustrata della risposta del rilevatore in funzione del tempo o del

volume di eluizione. Consiste in una serie di picchi, che rappresentano l’eluizione dei

singoli analiti.

IL CROMATOGRAMMA

Tempo di ritenzione (tR)

Tempo impiegato da ciascun analita per uscire dalla colonna.

Il tR ha due componenti: il tempo morto (tM), cioe’ il tempo necessario per passare attraverso gli

spazi liberi nella matrice della fase stazionaria, ed il t’R, cioe’ il tempo in cui l’analita e’

trattenuto dalla fase stazionaria. Quindi, il tempo di ritenzione adattato e’:

t’R = tR-tM

Volume di eluizione o di ritenzione (Vr)

Volume richiesto per eluire l’analita

Fattore di capacita’ (k’)

Indica il tempo relativo che occorre all’analita per eluire dalla colonna, in relazione ad un analita non trattenuto (o escluso), che non

interagisce con la fase stazionaria e che, per definizione, ha un k’ pari a 0. Per cui si ha:

k’ = (tR – tM )/ tM = t’R/ tM

Il fattore di capacita’ (k’) e’ correlato al coefficiente di distribuzione (Kd) dell’analita. Poiche’ la quantita’ e la

concentrazione sono in relazione con il volume, si puo’ scrivere:

k’= Kd x VS/VM

dove

VS e’ il volume della fase stazionaria

VM e’ il volume vuoto o spazio morto

Fattore di separazione (a)

E’ una misura della capacita’ intrinseca del sistema di discirminare tra due analiti. Tale

fattore puo’ essere espresso come :

a = k’A/k’B = t’RA/t'RB

Efficienza della colonna e risoluzione

Si ritiene che le colonne cromatografiche consistano in un numero (N) di zone

adiacenti, in ciascuna delle quali c’e’ lo spazio sufficiente per equilibrare

completamente l’analita tra le due fasi. Ogni zona e’ detta piatto teorico. La

lunghezza della colonnna contenente un piatto teorico e’ detta altezza del piatto

(H), generalmente misurata in micrometri.

Il numero dei piatti teorici e’ :

N=L/H [1]

dove L e’ la lunghezza della colonna

Vale anche la relazione: N = 5.54[(tR – tM)/w1/2]2

Se si considera la posizione di un picco, la [1] puo’ essere espressa come:

N=16L2 /w2 [2]

dove w e’ la larghezza della base del picco in oggetto

Inoltre, si definisce l’altezza equivalente del piatto teorico (HETP) come

HETP = L/N

La risoluzione e’ definita come il rapporto della differenza nel tempo di ritenzione tra

i due picchi ed il valore medio delle loro larghezze di base (wav):

RS = 2(tRA – tRB)/(wA – wB) = tR/ wav [3]

La risoluzione e’ influenzata da: - efficienza del sistema - fattore di selettivita’ - fattore di capacita’

di conseguenza, la [3] puo’ essere scritta come:

RS = (N-2/4) x (a-1/a) x (k’2/1-k’av) [4]

dove k’2 è il fattore di capacita’ per il picco trattenuto piu’ a lungo k’av è il fattore di capacita’ medio per i due analiti

– Equazione di van Deemter per la risoluzione

Rs = ½ x (a-1/a+1) x k’2/1+k’2x (L/h)1/2 [5]

Dove: a – fattore di selettività (separazione)

a = tR1/tR2

k’ – termine di migrazione, fattore di capacità;

L – lunghezza della colonna

h – altezza piatto

LA MATRICE

La matrice e’ il materiale che viene utilizzato per fornire un supporto

alla fase stazionaria

CARATTERISTICHE

- Elevata stabilita’ meccanica

- Presenza di gruppi funzionali

- Elevata capacita’

- Pori di dimensioni e forma controllata

- Superficie inerte per ridurre l’assorbimento non selettivo degli analiti

TIPI DI MATRICE

AGAROSIO

CELLULOSA

DESTRANO

POLIACRILAMMIDE

POLISTIRENE

SILICE

SISTEMI CROMATOGRAFICI

SCELTA DI UN SISTEMA CROMATOGRAFICO

CROMATOGRAFIA SU COLONNA

La fase stazionaria e’ attaccata ad una matrice adatta ed impaccata all’interno di

una colonna di vetro o metallo. La fase mobile viene fatta passare nella colonna

per gravita’.

La cromatografia liquida su colonna

si divide in:

- Cromatografia liquida a bassa pressione (LPLC, low pressure liquid chromatography)

- Cromatografia liquida a media pressione (MPLC, medium pressure liquid chromatography)

- Cromatografia liquida ad alta pressione [o meglio prestazione] (HPLC, high pressure [performance] liquid chromatography)

Schema di un sistema per HPLC

APPLICAZIONI

Separazione di ormoni, droghe, farmaci, amminoacidi, zuccheri, oligopeptidi e proteine.

CROMATOGRAFIA DI ADSORBIMENTO

Questo processo coinvolge forze di interazione deboli, come le forze di Van

der Waals ed i legami idrogeno. Il fenomeno si verifica solo in corrispondenza

di specifici siti di adsorbimento.

Tipologie di cromatografia di adsorbimento

- Cromatografia su idrossiapatite

- Cromatografia per interazione idrofobica

I solventi vengono scelti in base alle caratteristiche degli analiti

- Alcoli, se gli analiti contengono gruppi idrossilici

- Acetone o Esteri, se gli analiti presentano gruppi carbonilici

- Idrocarburi, per analiti non polari.

CROMATOGRAFIA DI PARTIZIONE

Questa tecnica dipende dai coefficienti di

distribuzione (Kd) ed utilizza fasi

stazionarie e fasi mobili liquide.

Tipologie di cromatografia di partizione

- Cromatografia liquida in fase normale - Cromatografia liquida in fase inversa - Cromatografia liquida in fase inversa per

accoppiamento ionico - Cromatografia chirale - Cromatografia controcorrente

CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO

Si basa sull’attrazione tra particelle di carica opposta. Le separazioni a scambio ionico vengono effettuate su colonne impaccate

con uno scambiatore ionico.

SCAMBIATORI IONICI (1)

- Scambiatori anionici o basici:

molecole con gruppi carichi positivamente che legano molecole anioniche (cariche negativamente)

- Scambiatori cationici o acidi:

molecole con gruppi carichi negativamente che legano molecole cationiche (cariche positivamente)

SCAMBIATORI IONICI (2)

- Scambiatori forti:

sono completamente ionizzati a tutti i valori di pH; sono i gruppi solfonato e le ammine quaternarie

- Scambiatori deboli:

sono ionizzati solo in un ristretto intervallo di pH; sono i gruppi carbossilici e dietilammonio

Il meccanismo di scambio ionico si basa su cinque passaggi:

1. Diffusione dello ione sulla superficie di scambio

2. Diffusione dello ione attraverso la matrice fino al sito di scambio

3. Scambio di ioni al sito d’interazione 4. Diffusione dello ione scambiato fino alla

superficie 5. Distacco selettivo dello ione scambiato ad

opera dell’eluente e diffusione della molecola nell’eluente esterno.

Schema di una cromatografia a scambio ionico

Nella resina scambiatrice di cationi(o anioni) il catione (o anione)

presente nella msicela viene legato al posto degli ioni del tampone

con cui era stata equilibrata la colonna.

CROMATOGRAFIA AD ESCLUSIONE MOLECOLARE (o gel filtrazione)

La separazione delle molecole, sulla base della loro dimensione molecolare e della forma, utilizza le

proprieta’ del setaccio molecolare di una varieta’ di materiali porosi.

Vt = V0 + Vi [5]

dove Vi e’ la somma del volume interno dei

granuli di resina V0 e’ il volume morto Vt e’ il volume totale occupato dalla resina

rigonfiata dal solvente

La distribuzione dell’analita nella colonna dipende dal volume totale di fase mobile disponibile. Per un dato gel, il fattore di distribuzione Kd di un particolare analita dipende dalle sue dimensioni molecolari.

Kd = Ve-V0/Vt-V0 [6]

Kd = 0 molecola grande

Kd = 1 molecola piccola

APPLICAZIONI

Purificazione delle macromolecole biologiche Determinazione della massa molecolare

relativa Dissalazione Studi proteina-ligando Concentrazione delle soluzioni

CROMATOGRAFIA DI AFFINITA’

Questa tecnica si avvale dell’estrema specificita’

delle interazioni di riconoscimento

molecolare, per ottenere la separazione e la purificazione delle

molecole.

Tipologie di cromatografia di affinita’

- Cromatografia di affinita’ con lectine

- Cromatografia di immunoaffinita’

- Cromatografia con chelanti di metalli

- Cromatografia con ligandi colorati

- Cromatografia covalente

Schema di purificazione di un enzima

CROMATOGRAFIA BIDIMENSIONALE

Tecnica che permette di migliorare la risoluzione delle separazioni per partizione

ed adsorbimento.

Il materiale che deve essere separato viene posizionato

sotto forma di macchia in un angolo della lastrina, che viene sviluppata e, quindi, rimossa dal contenitore e fatta seccare. In seguito viene sviluppata con un

secondo sistema di solventi, per i quali i composti da

separare hanno diversi valori di Kd.

CROMATOGRAFIA GAS-LIQUIDO (GLC o GC)

Si basa sulla ripartizione tra una fase liquida ed una gassosa. Le colonne utilizzate sono capillari di vetro o metallo con diametro interno tra 0.03 e 0.1 mm e lunghe fino a

100 metri.

Schema dell’apparato per GC

Fase Stazionaria

E’ un liquido ad alto punto di ebollizione

Puo’ essere :

- fase stazionaria selettiva, che sfrutta le caratteristiche chimiche dei componenti

- fase stazionaria non selettiva, che sfrutta i diversi punti di ebollizione

E’ costituita da un gas inerte come azoto, elio oppure argon

Fase Mobile

Sistemi di rilevazione

- Rilevatore a ionizzazione di fiamma (FID)

- Rivelatore a cattura di elettroni (ECD)

CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE

La fase stazionaria, legata ad una matrice adatta, si trova stratificata su una superficie di vetro,

plastica o metallo. La fase mobile liquida passa per capillarita’ sul sottile strato di materiale, in

posizione orizzontale o verticale.

Il movimento dell’analita e’ caratterizzato dal suo fattore di ritardo, Rf.

Rf = distanza percorsa dall’analita

distanza percorsa dal solvente

Sistemi di rilevazione

- Esame della lastrina sotto luce ultravioletta, per composti che assorbono nella zona dell’ultravioletto o fluorescenti

- Esame della lastrina sootoposta ad autoradiografia

- Esame della lastrina mediante l’uso di agenti specifici.